基于RNA甲基化蛋白YTHDF2在胃癌细胞的调控应用的制作方法

基于rna甲基化蛋白ythdf2在胃癌细胞的调控应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及基于rna甲基化蛋白ythdf2在胃癌 细胞的调控应用。


背景技术：

2.全球范围内胃癌发病率在恶性肿瘤中居于第5位、病死率居于第3位， 中国胃癌患者占全球胃癌患者的44.2％，这表明胃癌的治疗仍具有巨大的挑战 性。
3.目前，手术仍然是根治胃癌的最主要方式。但是中国的早期胃癌的诊断 率低，约有70％的胃癌患者在就诊时已到进展期，ⅳ期胃癌患者的5年生存率 约为5％-20％，总生存期仅有9-10个月。
4.肿瘤血管生成作为肿瘤发展中的重要标志，对于肿瘤发生、发展、转移 和预后至关重要。在没有血液供应的情况下，肿瘤细胞通过弥散获取一定的 营养，肿瘤的体积较小，处于相对静息的状态；在肿瘤发展过程中，肿瘤细 胞释放促血管生长因子，诱发内皮细胞的移行、增殖、迁移，导致新的血管 在肿瘤周围和内部形成，为肿瘤提供营养，促使肿瘤的侵袭和远端迁移。
5.rna甲基化已被证明在生物学过程和疾病发生发展中发挥重要功能，是目 前临床和生命科学上的研究热点，rna甲基化已被证明参与到肿瘤的发生发展 的过程中。
6.然而，目前在胃癌中少有相关rna甲基化的研究。
7.因此，研究rna甲基化对于胃癌生成的机制具有至关重要的作用，明确 胃癌的潜在分子机制，能够为早期和精确的预防、诊断和治疗胃癌提供方向， 进一步提高胃癌患者的临床诊断效率和预后判断能力。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供基于rna甲基化蛋白ythdf2在胃癌细胞的调控应 用，以解决上述背景技术中提出的问题。
9.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于rna甲基化蛋白ythdf2 在胃癌细胞的调控应用。
10.优选的，通过rna甲基化蛋白ythdf2抑制lncrnapvt1降解促进胃癌细 胞生成。
11.优选的，rna甲基化蛋白ythdf2抑制lncrnapvt1降解促进胃癌血管生 成。
12.优选的，rna甲基化蛋白ythdf2能与lncrnapvt1结合。
13.优选的，所述rna甲基化蛋白ythdf2的存在与lncrnapvt1的表达呈正 相关关系。
14.优选的，所述lncrnapvt1能够促进vegfa的表达，且所述lncrnapvt1 的表达与vegfa的表达呈正相关关系。
15.优选的，胃癌细胞生成包括：胃癌细胞增殖、胃癌细胞迁移、胃癌细胞 血管生成能力。
16.优选的，所述lncrnapvt1具有促进胃癌细胞增殖、促进胃癌细胞迁移、 促进胃癌
细胞血管生成能力。
17.本发明的技术效果和优点：
18.1、本发明证明通过rna甲基化蛋白ythdf2抑制lncrnapvt1降解促进胃癌 细胞生成，在临床中能够早期监控和有效干预，以此来降低胃癌患者的不良 预后发生率及死亡率，具有极大的临床意义；
19.2、本发明证明ythdf2及lncrnapvt1可以作为胃癌诊断和筛查的潜在靶 点，能够为早期和精确的预防、诊断和治疗胃癌提供方向，进一步提高胃癌 患者的临床诊断效率和预后判断能力。
附图说明
20.图1为tcga数据库中ythdf2在胃癌组织中的表达情况。
21.图2为本发明所述的lncrnapvt1在胃癌组织中的表达情况及其与胃癌 患者生存期的关系；其中图2a为tcga数据库中lncrnapvt1在胃癌组织中 的表达情况；图2b为lncrnapvt1的表达与胃癌分期的关系；图2c为lncrnapvt1的表达与胃癌患者总生存期的关系；图2d为lncrnapvt1在30对胃癌 组织和癌旁组织中的表达情况。
22.图3为本发明所述的vegfa、cd31、cd34在胃癌组织中的表达情况；其 中图3a为tcga数据库中vegfa在胃癌组织中的表达情况；图3b为tcga数 据库中cd31、cd34在胃癌组织中的表达情况；图3c为胃癌组织和癌旁组织 中cd31、cd34的免疫组化示例图。
23.图4为本发明所述的lncrnapvt1在胃癌细胞系中的表达情况及干扰 lncrnapvt1后的验证；其中图4a为lncrnapvt1在五种胃癌细胞系中的表 达情况；图4b为sirna-pvt1干扰胃癌细胞bgc-823和sgc-7901后lncrnapvt1 的表达情况。
24.图5为本发明所述的lncrnapvt1在体外促进胃癌细胞血管生成；其中 图5a为干扰sirna-pvt1前后胃癌细胞bgc-823和sgc-7901的血管生成情况； 图5b为图5a中的血管数量统计图。
25.图6为本发明所述的lncrnapvt1在体内促进胃癌细胞血管生成。
26.图7为本发明所述的lncrnapvt1促进胃癌细胞增殖；其中图7a为干扰 sirna-pvt1前后胃癌细胞bgc-823生长情况；图7b为干扰sirna-pvt1前后 胃癌细胞sgc-7901生长情况；图7c为干扰sirna-pvt1前后胃癌细胞bgc-823 和sgc-7901的克隆形成情况；图7d为图7c中的克隆形成数统计图。
27.图8为本发明所述的lncrnapvt1促进胃癌细胞迁移；其中图8a为干扰 sirna-pvt1前后胃癌细胞bgc-823和sgc-7901的transwell小室贴壁细胞情 况；图8b为图8a中的贴壁细胞计数统计图。
28.图9为本发明所述的lncrnapvt1促进vegfa表达；其中图9a和9b为lncrnapvt1调控靶基因的二代测序结果；图9c为干扰sirna-pvt1前后胃癌 细胞bgc-823和sgc-7901中vegfa的表达情况。
29.图10为本发明实施例1中lncrna pvt1在斑马鱼体内促进胃癌细胞增殖、 迁移；其中图10左列为卵黄部位的荧光信号，量化后代表增殖，图10右列为 躯干部位的荧光信号，量化后代表迁移。
30.图11为本发明实施例1中lncrnapvt1在斑马鱼体内促进胃癌细胞血管 形成。
31.图12为肿瘤血管生成与肿瘤转移的关系图。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例中的附图1-12，对本发明实施例中的技术方案 进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有 做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.在本发明中，vegfa为(血管生成因子)。
34.longnon-codingrna(lncrna)是指长链非编码rna，不具备编码蛋白 的功能，lncrna的长度超过200个核苷酸单位，lncrna虽然不能编码蛋白质， 但却可以通过各种路径调控基因和蛋白质的表达水平，从而调控机体的生理 功能。
35.lncrna的异常表达出现在人类疾病发生和发展的每个阶段。
36.rna甲基化在生物学过程和疾病发生发展中发挥重要功能，并且rna甲基 化参与到肿瘤的发生发展的过程中。
37.有三类分子参与了甲基化过程：writers,erasers,readers。
38.其中：writers介导rna的甲基化修饰过程，能够催化mrna的m6a甲基 化；erasers介导rna的去甲基化修饰过程，能够去除mrna上的m6a甲基化； readers识别rna甲基化位点，并参与mrna的剪接、转运、稳定性和翻译。
39.本发明提供了如图中1-12所示的基于rna甲基化蛋白ythdf2在胃癌细 胞的调控应用。
40.具体的，通过rna甲基化蛋白ythdf2抑制lncrnapvt1降解促进胃癌细 胞生成。
41.具体的，rna甲基化蛋白ythdf2抑制lncrnapvt1降解促进胃癌血管生 成。
42.具体的，rna甲基化蛋白ythdf2能与lncrnapvt1结合。
43.具体的，所述rna甲基化蛋白ythdf2的存在与lncrnapvt1的表达呈正 相关关系。
44.具体的，所述lncrnapvt1能够促进vegfa的表达，且所述lncrnapvt1 的表达与vegfa的表达呈正相关关系。
45.具体的，胃癌细胞生成包括：胃癌细胞增殖、胃癌细胞迁移、胃癌细胞 血管生成能力。
46.具体的，所述lncrnapvt1具有促进胃癌细胞增殖、促进胃癌细胞迁移、 促进胃癌细胞血管生成能力。
47.在本发明中，rna甲基化蛋白ythdf2抑制lncrnapvt1降解促进胃 癌细胞生成。
48.在本发明中，rna甲基化蛋白ythdf2能够识别lncrnapvt1上的甲基化 位点，且rna甲基化蛋白ythdf2能与lncrnapvt1结合并增加lncrnapvt1 的稳定性，进而促进了肿瘤细胞的增殖、迁移和血管生成。
49.如图12所示，肿瘤血管生成作为肿瘤发展中的重要标志，在肿瘤发展过 程中，肿瘤细胞释放促血管生长因子，诱发内皮细胞的移行、增殖、迁移， 导致新的血管在肿瘤周围和内部形成，为肿瘤提供营养，促使肿瘤的侵袭和 远端迁移。
50.如图1所示，与正常胃组织相比，ythdf2在胃癌组织中高表达。
51.如图2所示，lncrnapvt1在胃癌组织中高表达，且lncrnapvt1的表达 与胃癌的分
期呈正相关，与患者的总生存期呈负相关。
52.通过对30对胃癌组织和癌旁组织中lncrnapvt1的表达情况进行检测， 其中21对标本显示lncrnapvt1在胃癌组织中的表达高于癌旁正常组织。
53.如图3所示，vegfa在胃癌组织中高表达，对胃癌组织和癌旁组织进行免 疫组化实验，发现评估血管生成的cd31在胃癌组织中的表达高于癌旁组织， 同时高度糖基化的i型跨膜糖蛋白cd34在胃癌组织中的表达也高于癌旁组 织。
54.如图4-6所示，lncrnapvt1具有促进胃癌细胞血管生成的能力。
55.(1)如图4a-4b所示，在五种胃癌细胞系中检测lncrnapvt1的表达， 选取在胃癌细胞中高表达lncrnapvt1的胃癌细胞bgc-823和sgc-7901进行 后续的研究，利用sirna-pvt1干扰技术在胃癌细胞bgc-823和sgc-7901中 降低lncrnapvt1的表达，qrt-pcr验证干扰成功。
56.(2)如图5a-5b所示，体外matrigel血管生成实验显示，在敲降lncrnapvt1后，胃癌细胞bgc-823和sgc-7901的血管生成能力受到明显抑制。
57.(3)如图6所示，裸鼠动物模型上进行血管载体造模研究显示，胃癌细 胞bgc-823和sgc-7901在敲降lncrnapvt1后，血管生成能力受到明显抑制。
58.如图7所示，lncrnapvt1具有促进胃癌细胞增殖的能力，细胞增殖实验 和克隆形成实验显示，在敲降lncrnapvt1后，胃癌细胞bgc-823和sgc-7901 的增殖能力受到明显抑制。
59.如图8所示，lncrnapvt1具有促进胃癌细胞迁移的能力，细胞迁移实验 显示，在敲降lncrnapvt1后，胃癌细胞bgc-823和sgc-7901的迁移能力受 到明显抑制。
60.如图9所示，lncrnapvt1能够促进vegfa的表达，且所述lncrnapvt1 的表达与vegfa的表达呈正相关关系。
61.lncrnapvt1调控胃癌血管生成靶基因vegfa，将si-nc和si-pvt12# 的胃癌细胞bgc-823做二代测序，测序结果分析发现，在lncrnapvt1调控 的靶基因中，与血管生成相关的基因富集程度最高。
62.进一步在敲降lncrnapvt1的胃癌细胞bgc-823和sgc-7901中检测vegfa 的表达情况，发现lncrnapvt1的表达下调后，胃癌细胞中vegfa的表达也 下降，故，lncrnapvt1能够促进vegfa的表达促进胃癌进展。
63.实施例1、在斑马鱼体内敲降lncrnapvt1。
64.(1)将转染si-nc和si-pvt1的胃癌细胞bgc-823用cm-dii染料进行 染色(cm-dii是一种亲脂性的荧光染料，使细胞呈现红色荧光)，收集染色后 的细胞，大约300个细胞注射到48hpf的斑马鱼幼鱼的卵周间隙中。
65.在1dpi时，用体视显微镜从所有移植的幼鱼中筛选出荧光面积相同的幼 鱼。
66.在4dpi时，用体视显微镜进行图像拍摄，拍摄部位包括卵黄和躯干。
67.其中卵黄部位的荧光信号量化后代表增殖，躯干部位的荧光信号量化后 代表迁移。
68.如图10所示，lncrnapvt1表达下调后，胃癌细胞的增殖、迁移能力受 到抑制。
69.(2)为了排除少数的非特异性信号同时也为了获取高分辨率的图像，使 用了共聚焦显微镜，将cm-dii标记的细胞注射到tg(flli1a:egfp)转基因 斑马鱼幼鱼中，其中血管
内皮细胞被egfp标记。
70.在4dpi时，通过多层扫描对移植瘤进行成像。
71.如图11所示，lncrnapvt1表达下调后肿瘤血管密度下降(绿色荧光表 示斑马鱼的血管，红色荧光表示肿瘤细胞)。
72.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限 制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的 技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或 者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的 任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。