使用核-壳-壳磁珠的设备系统和方法与流程

使用核-壳-壳磁珠的设备系统和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年9月18日提交的美国临时申请第62/902,136号和2019年11月7日提交的美国临时申请第62/932,218号的申请权益。这些申请通过引用整体并出于所有目的并入本文。


背景技术：

3.可能存在从溶液分离目标生物分子或富集溶液内的目标生物分子群是有用的许多应用。许多生物溶液(例如，患者样本、实验室混合物等)可能包含目标生物分子和其它非目标组分(非靶向生物分子、盐、缓冲液组分、细胞等)的混合物。出于提取和/或富集目标生物分子的目的，已经开发了不同的程序，例如以去除原始溶液的不期望组分和/或增加目标产物相较于非目标产物的比例。
4.各种类型的珠可用于生物分子的分离(和/或富集)。例如，珠可以结合到生物分子，因为从溶液分离所结合的珠可能比单独分离生物分子更容易。所结合的珠可能会响应生物分子单独不响应的力。珠的特性，例如它们结合的生物分子和它们所响应的力，可能部分取决于珠的组成和化学。


技术实现要素：

5.在至少一个方面，本公开涉及一种磁珠，其包含实心磁芯、围绕所述磁芯的第一壳和围绕所述第一壳的第二壳。
6.所述第一壳可以包含保护层。所述第一壳可以是无孔的。所述实心磁芯可以包含具有组成为fe
x-co
y-nioz的金属合金氧化物。所述第一壳可以包含惰性碳壳。所述第二壳可以包含二氧化硅壳。
7.所述磁珠可以具有1μm或更小的直径。所述实心磁芯具有100-300nm的直径，所述第一壳具有10-50nm的厚度，并且所述第二壳具有20-100nm的厚度。所述第一壳可以包含羟基、环氧基或其组合。所述第二壳可以包含中孔。所述中孔可以介于2-20nm之间。
8.所述磁珠可以包括设置在所述第二壳的外表面上的化学基团。所述化学基团可以包含选自包括以下的群组的亲水部分：聚乙二醇、聚丙烯酸、聚乙烯醇、葡萄糖、蔗糖、半胱氨酸、麦芽糖、壳聚糖、藻酸盐、纤维素、甲壳质、淀粉及其组合。述化学基团可以包含具有选自包括以下的群组的表位羧基的化合物：琥珀酸酐、聚丙烯酸、氨基酸、藻酸、碳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、水杨酸、没食子酸、唾液酸。
9.在至少一个方面，本公开涉及一种方法，其包含形成磁芯，用第一壳材料涂覆所述磁芯，和用第二壳材料涂覆所述第一壳材料。
10.形成所述磁芯可以包含在压力下加热铁盐和至少一种其它金属盐的混合物。所述铁盐混合物可以包含氯化铁(iii)、硫酸铁(iii)、硝酸铁(iii)及其组合。所述铁盐和至少一种其它金属盐的混合物可以包含表面活性剂。
11.所述方法还可以包含纯化所述磁芯。用所述第一壳材料涂覆所述磁芯可以包含将
糖溶剂热碳化到所述磁芯上。所述糖可以是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或其组合。
12.所述方法还可以包含将聚合物材料涂覆到所述磁芯上。用所述第一壳材料涂覆所述磁芯可以包含用所述第一壳材料涂覆所述磁芯和聚合物材料。用所述第二壳材料涂覆所述第一壳材料可以包含将溶液中的所述第二壳材料分解到包含所述磁芯和第一壳材料的中间珠上。所述第二壳材料可以包含选自包括以下的群组的硅有机化合物：原硅酸四乙酯、原硅酸四甲酯及其组合。
13.所述方法还可以包含在所述第二壳材料中形成孔。所述方法还可以包含改性所述第二壳材料的表面。所述表面改性可以包含将所述第二壳材料的表面上的羟基转化为活性位点并将官能团结合到所述活性位点。
14.在至少一个方面，本公开可涉及一种方法。所述方法包含将核-壳-壳磁珠(css-mb)与包含目标生物分子的样本混合。所述css-mb包含实心磁芯、围绕所述实心磁芯的第一壳和围绕所述第一壳的第二壳。所述方法包含对所述混合物施加磁场以使所述css-mb聚集成团粒，将所述团粒与所述混合物的上清液分离，和从所述团粒回收所述目标生物分子。
15.所述目标生物分子可以包含核酸、蛋白质、肽、细胞、外来体或其组合。所述方法可以包含在存在结合缓冲液的情况下将高于界限尺寸的生物分子结合到所述css-mb。回收所述目标生物分子可以包含在存在洗脱缓冲液的情况下从所述css-mb洗脱所述目标生物分子。所述目标生物分子可以是核酸，并且所述结合缓冲液可以包含核酸沉淀缓冲液，所述核酸沉淀缓冲液包含脱水剂、盐桥、缓冲剂、载体分子、表面活性剂及其组合。所述方法可以包含用洗涤缓冲液洗涤所述团粒。
16.在至少一个方面，本公开可以涉及一种试剂盒，其包含一群核-壳-壳磁珠(css-mb)和核酸沉淀试剂。每个css-mb包含实心磁芯、围绕所述实心磁芯的第一壳材料和围绕所述第一壳材料的第二壳材料。所述css-mb可以在存在所述核酸沉淀试剂的情况下可逆地结合核酸。
17.所述核酸沉淀试剂可以包含脱水剂、盐桥、缓冲剂、载体分子、表面活性剂及其组合。所述试剂盒还可以包含洗涤缓冲液。所述试剂盒还可以包含洗脱缓冲液。所述css-mb可以在存在所述洗脱缓冲液的情况下释放所结合的核酸。
附图说明
18.图1是根据本公开的一些实施例的核-壳-壳磁珠的截面图。
19.图2是根据本公开的一些实施例的合成核-壳-壳磁珠的方法的流程图。
20.图3a和3b是根据本公开的一些实施例的核-壳-壳磁珠的电子显微照片。
21.图4是根据本公开的一些实施例的核-壳-壳磁珠的光谱图。
22.图5是根据本公开的一些实施例的核-壳-壳磁珠的尺寸分布图。
23.图6是描绘了根据本公开的一些实施例的富集生物分子的方法的流程图。
24.图7是根据本公开的一些实施例的用于按尺寸分离核酸的核-壳-壳磁珠的图。
25.图8是根据本公开的一些实施例的使用核-壳-壳磁珠在不同界限范围之间回收核酸的图。
26.图9是根据本公开的一些实施例的用核-壳-壳磁珠清理之前和之后的核酸的图。
具体实施方式
27.以下对某些实施例的描述在本质上仅是示范性的，且决不旨在限制本公开或其应用或用途的范围。在以下对本系统和方法的实施例的详细描述中，参考了形成本文的一部分的附图，所述附图以说明方式示出了可以实践所描述的系统和方法的具体实施例。足够详细地描述了这些实施例，以使所属领域的技术人员能够实践当前公开的系统和方法，并且应理解，可以利用其它实施例，且可以在不脱离本公开的精神和范围的情况下进行结构和逻辑改变。此外，为清晰起见，某些特征的详细描述在其对于所属领域的技术人员来说将显而易见时将不予以讨论，以免使本公开的实施例的描述混淆不清。因此，以下详细描述不应在限制性意义上理解，并且本公开的范围仅由所附权利要求书限定。
28.磁珠可以用于目标生物分子的分离和/或富集。磁珠具有相对强的磁响应，这使得它们能够被磁场吸引(或排斥)。例如，可以对含有磁珠的溶液施加磁场，这可以使磁珠被收集在尽可能靠近磁场的区域中。当不存在磁场时，磁珠可以分散在溶液中。磁珠的表面化学以及其它因素(例如，缓冲条件)可能使某些生物分子优先结合到磁珠的表面，这可以用于进行各种测定。生物分子与磁珠的结合可以是可逆的，并且所结合的生物分子随后可以从磁珠洗脱。
29.一些磁珠通常由聚合物(即聚苯乙烯)珠构成，其中散布有多个较小的磁性纳米颗粒(20-30nm)。由于单个磁性纳米颗粒的尺寸很小，每个磁性纳米颗粒的磁响应不是很强。因此，包含磁性纳米颗粒的整个磁珠通常可能很大(通常约为1-5μm)以提供足够的空间来包含许多磁性纳米颗粒以实现期望的磁响应。这种相对较大尺寸的磁珠导致较大的沉降速率和较低的表面积/体积比，这限制了磁珠与周围生物分子的有效相互作用并减少了生物分子的结合位点的数量。这可能会降低此类珠在需要低沉降和高结合亲和力的各种测定中的效用。此外，在磁珠中使用如聚苯乙烯等聚合物材料意味着苯的官能团暴露在磁珠的表面上。苯的疏水性会导致生物分子的强非特异性结合。例如，这使得具有较大尺寸的核酸在结合后难以从磁珠释放，并且还可能牺牲核酸的结合位点，因为它们可能被其它生物分子(例如，蛋白质、肽)的非特异性结合“填充”。因此，可能需要具有高磁响应和有利的表面结合性质的相对较小的磁性纳米颗粒。
30.本公开涉及用于核-壳-壳磁珠(css-mb)的设备、系统和方法。css-mb可以包含由第一壳围绕的实心磁芯，所述第一壳又由第二壳围绕。在一些实施例中，实心磁芯可以是单一材料，例如单一超顺磁性晶体。第一壳可以是保护磁芯不与外部溶液相互作用(并且反之亦然)的保护层。第二壳可以提供与目标生物分子相互作用的化学。实心磁芯可以允许相对较小(例如，约1μm或更小)的css-mb表现出相对强的磁响应。css-mb的尺寸减小可以降低磁珠的沉降速率，并且还增加磁珠的表面积/体积比。第一壳可以允许封装磁珠，这可以允许在为第二壳选择的化学中具有更大的自由度。第二壳可以允许改善表面化学，这可以允许增加结合到目标生物分子的特异性。使用两个壳可以允许尺寸相对较小的珠，其仍然具有强磁响应(由于实心磁芯)但也将具有有利的表面化学(由于由第一壳提供的外壳和芯之间的分离)。这种css-mb的性质在许多潜在的测定中可能是有利的。
31.图1是根据本公开的一些实施例的核-壳-壳磁珠的截面图。核-壳-壳磁珠(css-mb)100包含磁芯102、第一壳104和外壳106。
32.在一些实施例中，css-mb 100可以具有通常球形的形状，其尺寸由直径d
珠
定义。
css-mb 100可以具有小于约1μm的直径d
珠
。例如，css-mb 100的直径d
珠
可以介于约200nm和1000nm之间。在其它示范性实施例中，可以使用更大和更小的直径。应理解，尽管为了便于讨论，css-mb 100通常可以被示出为球形，但这可能代表css-mb100的理想化视图，并且css-mb 100可能偏离完美球形。例如，css-mb 100的群体可以包含单独的css-mb 100，它们是球形的、扁圆形的、扁长形的、椭圆形的，具有与完美球形的一或多个其它偏差(例如，表面上的凹形或凸形“块”)或其组合。
33.磁芯102可以具有约100nm和300nm之间的直径d
芯
。磁芯102可以是实心材料。在一些实施例中，磁芯102可以是实心晶体簇，例如超顺磁性晶体簇。在一些实施例中，磁芯102可以是单个超顺磁性晶体。在一些实施例中，磁芯可以由金属合金形成，例如金属合金氧化物晶体。在一些实施例中，磁芯102可以包含选定比例的金属混合物。例如，磁芯102可以包含如fe、co和ni等金属的混合物。在一些实施例中，磁芯102通常可以具有组成fe
x-co
y-nioz，其中x、y和z都是整数值。
34.第一壳104通常可以是沉积在磁芯102的外表面上的球形层。第一壳104可以具有厚度t1，其在一些实施例中可以介于约10nm到约50nm之间。第一壳104可以是防止css-mb 100的外部环境的组分和磁芯102之间的化学相互作用的保护壳。第一壳104可以是无孔的。第一壳104可以由惰性材料形成。例如，第一壳104可以包含石墨碳。在一些实施例中，第一壳104可以具有包含一或多个化学基团的外表面，所述化学基团促进第一壳104和第二壳106之间的结合。例如，如果第一壳104包含石墨碳，则第一壳104的表面可以包含相对丰富的羟基和/或环氧基，它们可以为第二壳106提供锚定位点。
35.第二壳106通常可以是沉积在第一壳104的外表面上的球形层。第二壳106可以具有厚度t2，其在一些实施例中可以介于约20nm到100nm之间。因此，css-mb 100的总半径可以是磁芯102的半径加上第一壳104和第二壳106分别的厚度t1和厚度t2。
36.第二壳106可以是css-mp 100的外壳。第二壳106可以进一步保护磁芯102(例如，除了由第一壳104提供的保护之外)，可以提供对一或多个反应有用的表面化学，和/或提供可以用另外的化学基团官能化以提供这种表面化学的活性位点。在一些实施例中，第二外壳106可以是无孔的。在一些实施例中，第二外壳106可以是多孔的。例如，第二壳106可以包含可以均匀分布在整个第二壳106中的中孔。在一些实施例中，第二壳可以由氧化硅形成，例如缩合氧化硅。
37.在一些实施例中，第二壳106的外表面可以由一层化学基团107围绕。这些化学基团107可以是第二壳106的化学所固有的和/或可能是由于第二壳的表面化学的改性。例如，化学基团107可以包含结合到第二壳106的外表面的化学物质。表面化学基团107可以用于改善溶液中的css-mb 100(例如，其分散在溶液中)的化学性质和/或促进css-mb 100和一或多个生物分子之间的结合。
38.在一些实施例中，各个官能团可以作为化学基团107的一部分结合到css-mb的表面。第二壳106可以包含和/或可以经修饰以包含多个活性位点，所述活性位点可以用于将官能团结合到第二壳106的外表面。例如，在第二壳106由二氧化硅形成的实施例中，第二壳106可以包含多个表面羟基。这些表面羟基可以被修饰成羧基，其可以形成结合一或多个官能团的活性位点。
39.化学基团107的一个实例可以包含促进生物分子之间的结合的化学物质。例如，
css-mb 100的表面羟基可以通过将呈现羧基的化学物质共价结合到羟基而用这些化学物质进行改性，所述化学物质为例如含有羧基表位的小分子、聚合物、树枝状聚合物。例如，羟基可以用化学物质转化为羧基，所述化学物质为例如琥珀酸酐、聚丙烯酸、氨基酸、藻酸、碳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、水杨酸、没食子酸、唾液酸及其组合。基于在某些缓冲条件下的固相反向固定机制，羧基可以用于实现某些目标生物分子的结合。
40.化学基团107还可以包含可以改变css-mb 100的整体表面化学的亲水组分(例如，亲水部分)。例如，亲水组分可以是小分子(例如，两性离子分子、糖分子)或聚合物(例如，聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺)。亲水组分可以增加磁珠在水溶液中的分散性，这可能有利于靶向生物分子和css-mb 100之间的相互作用。化学基团107中的亲水组分也可以帮助避免其它生物分子在样本中的非特异性结合，这又可以增强所富集的靶向生物分子的纯度。亲水组分的实例包含聚乙二醇、聚丙烯酸、聚乙烯醇、葡萄糖、蔗糖、半胱氨酸、麦芽糖、壳聚糖、藻酸盐、纤维素、甲壳质、淀粉及其组合。
41.图2是根据本公开的一些实施例的合成核-壳-壳磁珠的方法的流程图。在一些实施例中，方法200可以用于合成核-壳-壳磁珠(css-mb)，例如图1的css-mb 100。
42.方法200通常可以从框210开始，其描述了形成磁芯(例如，图1的磁芯102)。在一些实施例中，框210可以涉及磁芯的溶剂热合成。框210中描述的磁芯的合成可以涉及在存在离子封端试剂(即乙酸盐)的情况下分散在有机溶剂(例如，乙二醇)中的一或多种铁盐(例如，氯化铁(iii)、硫酸铁(iii)、硝酸铁(iii))和一或多种其它金属(即co、ni)盐的起始混合物。在一些实施例中，本混合物还可以包含表面活性剂。在一些实施例中，金属盐混合物可以作为预混合的起始材料获得。在一些实施例中，方法200可以包含组合一或多种试剂以形成铁盐混合物。
43.框210中描述的合成可以涉及在压力下加热金属盐混合物以形成磁芯。例如，可以将金属盐混合物转移到高压釜反应器中，并且可以在压力下加热至约180-240℃的温度，持续约4-80小时。例如，如果金属盐混合物包含fe、co和ni盐的混合物，则可以形成多种金属芯，所述金属芯包含具有通式fe
x-co
y-nioz(其中x、y和z都是整数)的晶体。框210中描述的合成可以包含将包含磁芯的混合物冷却至室温。框210中描述的合成可以包含纯化磁芯，例如通过用洗涤缓冲液(例如，水和/或乙醇)洗涤磁芯，然后干燥磁芯。例如，可以通过施加磁场将磁芯从溶液中拉出、去除上清液并将磁芯悬浮在洗涤缓冲液(例如，水和/或乙醇)中来洗涤磁芯。洗涤可以重复多次。经干燥的磁芯可以产生磁芯的固相集合。
44.框210之后通常可以是框220，其描述了用第一壳材料涂覆磁芯。在一些实施例中，第一壳材料可以形成图1的第一壳104。这可以产生中间珠(例如，由第一壳围绕的磁芯)。框220可以包含将糖(即葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等)溶剂热碳化到磁芯上。磁芯可以与糖均匀混合。例如，经干燥的磁芯可以与糖机械混合。磁芯和糖的混合物可以在压力下加热以碳化糖。例如，可以将磁芯和糖的混合物转移到高压釜反应器中，并且可以在压力下加热至约100-180℃的温度，持续约24-60小时。在压力下加热混合物的过程期间，可以将碳壳形成到磁芯上。
45.在一些实施例中，框220可以包含将聚合物材料涂覆到经干燥的磁芯上，然后依次在惰性气体环境中进行热辅助碳化过程。这可以用碳壳涂覆聚合物材料。因此，css-mb可以在磁芯和第一壳之间包含额外的聚合物壳。
mb的相对均匀性以及它们相对较小的尺寸(例如，约1μm或更小)可以增加css-mb在水性环境中悬浮的适用性，这又可以增加水性环境中的css-mb和生物分子之间的相互作用。这可能会增加使用css-mb进行的测定的可重复性。
53.图6是描绘了根据本公开的一些实施例的富集生物分子的方法的流程图。方法600通常可以使用核-壳-壳磁珠(例如，图1的css-mb 100)来进行。图6的方法600被描述为从样本纯化、富集和/或回收目标生物分子的通用过程。下面提供了描述方法600的示范性实施例的各个实例。
54.方法600通常可以从框610开始，其描述了将核-壳-壳磁珠与包含目标生物分子的样本混合。术语样本通常可以指包含目标生物分子的任何化学物质。样本可以是包含目标生物分子以及一或多种其它化学组分的混合物或溶液。通常，样本可以包含水溶液中的一或多个生物分子，但是也可以使用非水溶液。在一些实施例中，样本可以是生物样本，例如获自患者的流体，例如血液、组织、血清、血浆、淋巴液、尿液、精液、唾液、乳汁、培养细胞及其组合。在一些实施例中，生物样本可以获自非人类受试者，例如植物或动物，或可以获自人工来源，例如实验室中培养的细胞系。在一些实施例中，样本可以是先前反应或测定的产物。例如，样本可以是分子生物学测定的产物，例如基因测序、扩增反应(例如，qpcr、ddpcr、等温扩增等)和/或其它过程。
55.目标生物分子可以是核酸、蛋白质、肽、细胞、外来体或其组合。在一些实施例中，目标生物分子可以是区别于相同类型的其它生物分子的特定类型的生物分子。例如，在一些实施例中，目标生物分子可以是高于某一尺寸界限的核酸，而低于所述尺寸界限的核酸可能不被靶向。在一些实施例中，核酸可以包含dna、rna、寡核苷酸、经标记的核酸，例如用放射性磷酸盐和/或荧光团标记的核酸、经修饰的核酸，例如包含用生物素或地高辛修饰的核苷酸的核酸、或其组合。
56.css-mb可以作为干燥成分提供或可以悬浮在缓冲液中。在一些实施例中，缓冲液可以是结合缓冲液以促进一或多个分子与css-mb的结合。在一些实施例中，css-mb可以与样本组合，然后可以单独加入结合缓冲液。在一些实施例中，混合可以涉及样本和css-mb的混合物的搅动(例如，涡旋、搅拌等)。
57.一旦css-mb与溶液组合，css-mb就可以与溶液中的一或多个分子结合。例如，在一些实施例中，css-mb可以结合到目标生物分子。在一些实施例中，css-mb可以结合到除目标生物分子之外的溶液的各种组分。例如，如果目标生物分子是低于某一尺寸阈值的dna，则css-mb可能会结合到高于所述尺寸阈值的dna。
58.框610之后通常可以是框620，其描述了向混合物施加磁场以使css-mb聚集成团粒。所施加的磁场可以使css-mb聚集在容纳混合物的容器的特定区域中并降低css-mb在容器的其余部分中的浓度。例如，磁场可能导致css-mb沉淀到容器的特定区域，这可能会留下具有css-mb(以及它们所结合的分子)的一般固体团粒的某一区域以及容器的其余部分中的液体上清液。在一些实施例中，磁场可以导致基本上所有的css-mb聚集成团粒，并且上清液可以基本上不含css-mb。
59.磁场可以由磁体提供，例如实心磁体或电磁体。在一些实例中，可以通过使容纳混合物的容器靠近磁体来提供磁场。响应于磁场，css-mb(以及它们所结合的分子)可能会被吸引到团粒中。例如，在磁场源是靠在容器上的磁体的一些实施例中，css-mb可以被吸引到
容器的最靠近磁体的区域，并且团粒可以靠着容器的最靠近磁铁的壁形成。
60.框620之后通常可以是框630，其描述了将团粒与上清液分离。在施加磁场后，css-mb(以及它们所结合的分子)可以聚集成团粒，混合物的其余液体组分可以是液体上清液。团粒和上清液可以彼此分离。例如，可以从容器中去除液体上清液(例如，通过用移液管将上清液移出容器)，从而留下固体团粒。在一些实施例中，可以从容器中去除团粒，并且可以留下上清液。
61.框630之后通常可以是框640，其描述了回收目标生物分子。回收目标生物分子的过程可以取决于目标生物分子的类型以及目标生物分子是否结合到css-mb(例如，在框610中)。
62.在css-mb结合目标生物分子的一些实施例中，框640可以涉及从css-mb释放目标生物分子。例如，可以将团粒重悬在液体中。例如，可以将液体加入到包含团粒的容器中，然后搅动以将团粒重悬在液体中。在一些实施例中，液体可以是洗脱缓冲液，其包含使目标生物分子从css-mb释放到液体中的化学物质。可用于释放目标生物分子的特定化学物质将关于下面的具体实例更详细地讨论。在一些实施例中，然后可以重复框620和630以去除(未结合的)css-mb，从而在液体中留下目标生物分子。
63.在一些实施例中，css-mb可以结合非目标生物分子。例如，css-mb可以结合样本中除目标生物分子之外的生物分子，从而使其在混合物中不结合。在目标生物分子是低于某一尺寸阈值的核酸的示范性实施例中，css-mb可以结合到高于所述尺寸阈值的所有核酸。因此，在进行框630之后，目标生物分子可以保留在上清液中。在一些实施例中，css-mb可以结合到样本中的基本上所有的非靶向生物分子，并且上清液可以主要(例如，仅)包含靶向生物分子。在目标生物分子保留在上清液中的一些实施例中，框640可以涉及保留上清液。
64.在一些实施例中，在方框610之前，方法600可以包含制备溶液。这可以涉及一或多个步骤以使溶液与方法更相容和/或增加方法600的预期产量。例如，如果溶液是含有细胞的生物样本，则制备溶液可以包含例如裂解细胞、去除细胞碎片和/或将细胞从溶液中滤出的过程。在另一实例中，如果溶液在与css-mb不相容的缓冲液中，则方法600可以包含对溶液进行缓冲液交换以用相容的缓冲液替换不相容的缓冲液。在其它示范性实施例中，可以使用其它类型的样本制备。
65.在一些实施例中，方法600可以包含回收css-mb。可能期望回收css-mb，使得其可以用于一个以上反应。css-mb的回收可以在框640之后进行，并且可以包含释放结合到css-mb的任何生物分子(靶向或非靶向)。回收还可以包含洗涤css-mb。然后可以将所回收的css-mb作为同一测定的不同过程的一部分或作为新测定的一部分重新使用。
66.在一些实施例中，方法600可以用于聚集目标生物分子。例如，此应用中的方法600可以包含将css-mb与样本混合以捕获目标生物分子，作为框610的一部分；通过外部磁场从溶液分离css-mb，并弃去上清液，分别作为框620和630的一部分；洗涤磁珠；和以小得多的洗脱体积从css-mb洗脱目标生物分子，作为框640的一部分，以聚集目标生物分子。在一些实施例中，经聚集的目标生物分子可以重悬在与其最初悬浮其中的缓冲液不同的缓冲液中(例如，缓冲液交换)。在一些实施例中，经聚集的目标生物分子可以重悬在与其最初悬浮其中的缓冲液相似的缓冲液中。
67.方法600的一个示范性应用是按尺寸从背景生物分子分离和富集生物分子。在此
应用中，目标生物分子可以是高于界限尺寸、低于界限尺寸、在界限尺寸范围之间或在界限尺寸范围之外的生物分子。例如，目标生物分子可以是高于特定界限尺寸(例如，高于约某一碱基对数)的核酸。例如，尺寸界限可以介于约100bp和600bp之间。大于600bp且小于100bp的界限尺寸也可以用于其它实例中。可以使用不同的缓冲条件来确定结合到css-mb的核酸的尺寸。
68.在一些实施例中，在存在核酸沉淀缓冲液的情况下，核酸(例如，dna、rna、寡核苷酸等)优先且可逆地结合到css-mb，所述核酸沉淀缓冲液可以包含脱水剂、盐桥、缓冲剂及其组合。这些核酸沉淀缓冲液可以是css-mb所悬浮在的缓冲液的一部分，或者可以加入到css-mb中。例如，核酸沉淀缓冲液可以加入到css-mb中，然后样本可以与css-mb的悬浮液混合，作为框610的一部分。在另一个实例中，可以混合css-mb和样本，然后可以加入化学物质，作为框610的一部分。
69.脱水剂可以提供疏水溶液以迫使亲水核酸分子离开溶液，这可以促进核酸在磁珠上沉淀。盐桥有助于最小化核酸分子的负电荷排斥。缓冲剂为核酸提供合适的ph以结合在磁珠表面上。在一些实施例中，核酸沉淀试剂可以包含表面活性剂，其可以减少核酸与css-mb的非特异性结合。
70.在一些实施例中，在存在脱水剂(即聚乙二醇、聚丙二醇等)、盐桥(即nacl、kcl、cacl2等)和缓冲剂(即tris、tris-hcl、edta等)的情况下，靶向生物分子结合到珠。在一些实施例中，靶向生物分子在某一ph(ph 3到8)下结合到珠。在一些实施例中，靶向生物分子以低盐浓度从珠洗脱。在一些实施例中，靶向生物分子在某一ph(ph 6到10)从珠洗脱。
71.在一个非限制性实例中，在目标生物分子是某一尺寸的核酸的应用中，方法600可以包含提供磁珠溶液，并将所述溶液施加于核酸样本以捕获高于界限值的核酸，作为框610的一部分。方法600的示范性应用还包含通过外部磁场从溶液分离珠，作为框620的一部分，并弃去含有低于界限值的核酸的上清液，作为框630的一部分。600可以包含在弃去上清液之后任选地洗涤磁珠，并继续从珠洗脱高于界限值的纯化核酸，作为框640的一部分。
72.在一个非限制性实例中，在目标生物分子是低于第一界限值且高于第二界限值的核酸的应用中，所述方法可以包含将包含核酸的样本与磁珠溶液混合以捕获高于第一界限值的核酸，作为框610的一部分。例如，可以选择css-mb和样本的混合物中的缓冲条件以使高于第一界限值的核酸优先结合到css-mb。方法600的示范性应用可以包含如框620中的施加磁场，以及如框630中的将团粒与上清液分离。方法600的示范性应用可以包含弃去结合到高于第一界限尺寸的核酸的css-mb，同时收集上清液，作为框640的一部分。然后方法600的示范性应用可以重复回到框610，并且包含将新的css-mb溶液施加到所收集的上清液。新的css-mb溶液可以包含优先使高于第二界限值的核酸结合到css-mb的缓冲条件。例如，第二缓冲条件可能比使高于第一界限尺寸的核酸结合到css-mb的缓冲条件强。方法600的示范性应用可以包含如框620中的通过外部磁场从溶液分离珠，并如框630中的将团粒与上清液分离；洗涤css-mb；并如框640中的从css-mb洗脱核酸。因此，从css-mb洗脱的核酸可能低于第一界限值且高于第二界限值。
73.在一些实施例中，用于方法600的各种试剂中的一或多种可以一起包装在试剂盒中。在一些实施例中，试剂盒可以包含化学试剂，例如css-mb，和缓冲液，例如结合缓冲液和洗涤缓冲液。在一些实施例中，试剂盒可以包含物理组件，例如磁体和用于混合试剂的各种
(可重复使用或一次性)容器。在一些实施例中，试剂盒可以包含预先分配用于单一反应的试剂。在一些实施例中，试剂盒可以包含以较大量包装的试剂，并且分配可以由试剂盒的用户进行。在一些实施例中，所述试剂盒可以包含允许用户“调整”方法600的各个方面的说明。例如，试剂盒可以包含用于改变结合缓冲液的浓度的说明，这又可以改变生物分子的目标尺寸。
74.用于按尺寸分离核酸的示范性试剂盒可以包含css-mb(例如，图1的css-mb 100)群和核酸沉淀缓冲液。核酸沉淀缓冲液可以包含脱水剂、盐桥、缓冲剂及其组合。脱水剂可以提供疏水溶液以迫使亲水核酸分子离开溶液，这又可以促进长核酸沉淀到磁珠上。脱水剂可以包含聚亚烷基二醇(例如，聚乙二醇、聚丙二醇等)，其在一些实施例中可以具有1000到10,000da之间的分子量和10％到25％之间的重量/体积浓度。
75.盐桥可以帮助最小化长核酸分子的负电荷排斥。盐桥可以包含盐，例如nacl、kcl、cacl2及其组合。在一些实施例中，盐桥的盐可以具有0.5m到5m之间的浓度。
76.缓冲剂可以为结合在磁珠表面上的长核酸提供合适的ph。缓冲剂可以包含tris、tris-hcl、edta及其组合。核酸沉淀试剂中包含的一组示范性缓冲剂可以包含浓度为0-10mm的tris、浓度为0-1mm的edta、浓度为0-10mm的tris-hcl及其组合。
77.核酸沉淀试剂还可以包含另外的组分。在一些实施例中，将表面活性剂加入到核酸沉淀试剂中，以减少非特异性核酸结合。例如，可以使用表面活性剂，例如tween-20、triton x-100、sds及其组合。一组示范性表面活性剂可以包含浓度为0.01％-0.5％的tween-20、浓度为0.01％-0.5％的triton x-100、浓度为0.1％-1％的sds及其组合。
78.在一些实施例中，核酸沉淀试剂可以用于帮助确定尺寸界限。例如，增加核酸沉淀试剂的强度(试剂浓度、体积/样本体积比等)可能会降低长片段与短片段的界限尺寸。
79.在一些实施例中，试剂盒还可以包含洗涤缓冲液，其可以用于一或多个洗涤步骤中。洗涤缓冲液可以包含醇。在一些实施例中，试剂盒可以包含洗脱缓冲液。洗脱缓冲液可以包含相对低的盐浓度以引起短dna片段的释放。可替代地和/或另外地，洗脱缓冲液可以包含某一ph(例如，ph 6到10)。
80.实例1—按尺寸进行的dna梯状条带标准品的分离
81.图7是根据本公开的一些实施例的用于按尺寸分离核酸的核-壳-壳磁珠的图。图700示出了沿横轴的核酸尺寸(以碱基对或bp为单位)和沿纵轴的浓度量度(以分数单位或fu为单位)。图700的一条迹线表示用于选择性地滤出高于350bp的界限尺寸和低于约100bp的核酸的核-壳-壳磁珠(css-mb)，而第二条迹线示出用于结合样本中的所有尺寸的核酸的非css-mb。
82.图7的样本是介于约50-3000bp之间的dna梯状条带。dna梯状条带用css-mb和非css-mb处理。所述过程包含：1)在含有脱水剂和盐桥的缓冲液下，将尺寸》350bp的dna选择性地结合到css-mb；2)在外部磁场下从溶液分离所结合的css-mb；3)收集含有尺寸《350bp的未结合dna的上清液溶液；4)在含有较高浓度的脱水剂和盐桥的缓冲液下，选择性地将尺寸介于100-350bp之间的dna结合到磁珠；5)在外部磁场下从溶液分离css-mb，并弃去上清液；6)用70％乙醇溶液洗涤磁珠；7)用洗脱缓冲液从css-mb洗脱选定dna。使用agilent 2100生物分析仪对所富集的dna进行表征。本公开中的css-mb去除了高于界限尺寸(350bp)的dna片段，并回收了100到350bp范围内的dna片段。富集效率高于非css-mb，大片段残基较
少，但在100到350bp范围内的回收率相似。
83.实例2—对片段化dna的尺寸选择
84.图8是根据本公开的一些实施例的使用核-壳-壳磁珠在不同界限范围之间回收核酸的图。图800与图700相似之处在于，其示出了沿横轴的核酸的尺寸和沿纵轴的所述尺寸的浓度。图800的每条迹线示出了当使用针对某一尺寸范围的dna的css-mb过滤不同于所述范围的dna时的样本中的dna的图谱。特别地，每个实验都使用相同的下限(100bp)但不同的上限(300、500和700bp)。一条迹线还示出了未经过滤的片段化dna，其包含介于约100bp和约2000bp之间的dna片段。
85.图8的实例是使用源自培养人类细胞的样本进行的。特别地，样本包含hela细胞的基因组dna，其使用dsdna按照制造商的方案进行片段化。片段化基因组dna包含尺寸在约100到2000bp的宽范围内的dna片段。然后以类似于图6中描述的方法600的方式用css-mb处理片段化dna样本。所述过程包含：1)在含有相对应浓度的脱水剂和盐桥的一系列缓冲条件下，选择性地将高于上限值的dna结合到css-mb；2)在外部磁场下从溶液分离css-mb；3)收集含有未结合dna的上清液溶液；4)在含有较高浓度的脱水剂和盐桥的缓冲液下，选择性地将尺寸大于下限(例如，100bp)的dna结合到css-mb；5)在外部磁场下从溶液分离css-mb，并弃去上清液；6)用80％乙醇溶液洗涤css-mb；7)用洗脱缓冲液从css-mb洗脱选定dna。使用agilent2100生物分析仪对所富集的dna进行表征。css-mb去除了高于界限尺寸(分别为300、500和700bp)的dna片段，并回收了100bp到界限尺寸范围内的dna片段。css-mb可以用于选择尺寸分布较窄的dna片段，适用于下游应用。
86.实例3—ngs文库制备工作流程中的清理
87.图9是根据本公开的一些实施例的用核-壳-壳磁珠清理之前和之后的核酸的图。图9的图表示对经扩增的dna的清理程序，以回收高于界限尺寸的dna。可以使用如聚合酶链式反应(pcr)等扩增反应来扩增dna。扩增可以是下一代测序(ngs)程序的一部分。
88.在使用css-mb(例如，图1的css-mb 100)的典型ngs文库制备工作流程中，对通过接合体连接和pcr扩增制备的dna片段进行清理程序。文库制备产物含有经连接和扩增的dna片段(》150bp)以及过剩的接合体单体(50-60bp)和二聚体(120bp)。所述过程包含：1)在含有脱水剂和盐桥的缓冲液下，将尺寸》120bp的dna选择性地结合到css-mb；2)在外部磁场下从溶液分离css-mb，并弃去上清液；3)用70％乙醇溶液洗涤css-mb；4)用洗脱缓冲液从css-mb洗脱选定dna。使用agilent 2100生物分析仪对所富集的dna进行表征。本公开中的珠去除了低于约120bp的界限尺寸的dna片段，并回收了高于约120bp的dna片段。
89.因此，css-mb可以允许磁珠相较于其尺寸具有相对大的磁响应(例如，由于实心磁芯)。这又可以允许以相对小的尺寸合成css-mb，这可以例如改善css-mb在溶液中的分散以及增加表面/体积比。这可以改善css-mb在结合到目标生物分子方面的性能。第一壳材料的使用可以允许保护实心磁芯免于与溶液的组分相互作用。这又可以允许在第二壳材料的化学中具有更大的自由度，这可以用于进一步改善css-mb的性能。
90.应了解，本文描述的实例、实施例或过程中的任一个可以与一或多个其它实例、实施例和/或过程组合或分开，和/或在根据本系统、装置和方法的单独装置或装置部分当中进行。例如，本文提出的任何方法都可以重复、省略或重新布置它们的任何步骤。任何方法的步骤可以以与所述顺序不同的顺序进行。另外的步骤可以包含在本文提出的任何方法
中，并且可以发生在本文描述的步骤之间。
91.应了解，本文描述的实例、实施例或过程中的任一个可以与一或多个其它实例、实施例和/或过程组合或分开，和/或在根据本系统、装置和方法的单独装置或装置部分当中进行。
92.应了解，尽管已经给出了某些数值，但这些只是示范性的。作为此类实例给出的数值应被认为是近似的，并且也可以使用大于或小于示范性数值的值。类似地，当给出数值范围(例如，x和y之间)时，其应被理解为包含边界(例如，x和y)，并且边界也可以是近似的示范性值。
93.上述讨论旨在仅说明本系统，并且不应被解释为将所附权利要求限制为任何特定实施例或实施例组。因此，尽管已参考示范性实施例特别详细地描述了本系统，但还应了解，在不脱离如在所附权利要求书中所阐述的本系统的更广和既定精神和范围的情况下，所属领域的普通技术人员可以设计众多修改和替代实施例。因此，说明书和附图应以说明性方式看待，并且不旨在限制所附权利要求书的范围。