扩增mRNA和制备全长mRNA文库的方法与流程

扩增mrna和制备全长mrna文库的方法
技术领域
1.本发明涉及用于扩增样品中包含至少一种rna，尤其是至少一种mrna的方法，这种方法用于从含有多种rna分子的样品中制备全长rna文库中的用途，用于对特定细胞的总rna或生物体的整个外显子组进行测序的方法，以及用于遗传诊断的方法。另外，本发明涉及包含用于实施本发明的至少一种方法的试剂的试剂盒。


背景技术：

2.尽管近年来所有技术都在不断进步，但rna测序，尤其是全长mrna测序或转录组或外显子组测序仍然是一个巨大的挑战。外显子组包括生物体基因组的所有部分，这些部分包含在外显子中，并且在遗传信息转录和通过rna剪接去除内含子后，产生翻译成这种生物体的最终蛋白质的mrna。另一方面，转录组包括一个细胞或特定细胞群的所有rna，尤其是所有相应的mrna。
3.全外显子组测序可以极大地促进对常见以及罕见疾病的理解。已知影响甚至消除特定蛋白质功能的突变是孟德尔疾病的主要原因。例如choi等人(proc natl acad sci usa,106(45)，第19096-19101页(2009))和bamshad等人(nat rev.genet.,12,745-755(2011))报道了用于确定在孟德尔和非孟德尔疾病中起作用的遗传变异的全外显子组捕获和大规模并行dna测序。
4.尤其是癌细胞的转录组对于更好地理解致癌作用特别重要。然而，对其它细胞类型(如干细胞)的分子机制和细胞途径的分析也是研究的一个永久焦点，正如对各种不同应用和用途的生物标志物发现一样。
5.虽然人和动物的外基因组和转录组特别有利于促进疾病的治疗或预防，但是对于植物细胞来说，额外的好处在于更好地理解植物遗传学，例如通过靶向突变和基因工程来改良作物植物。
6.遗传物质的快速分析需要简单易用、高效可靠的工具。一个主要问题是需要直接检测小的生物样品(诸如患者的血液或其它来源)中的目标dna或rna。这些样品只提供微量的遗传物质的各种组分。为了达到所需的灵敏度，通常需要其中在分析之前增加样品中核酸的量的扩增步骤。或者，应用其中放大直接从dna/rna分析物获得的微小检测信号的检测方法。
7.核酸扩增的方法包括pcr扩增和其它核酸扩增方案。pcr扩增的主要有利方面是，在从生物材料中获得的不同dna链库中，只有目标dna序列被扩增。这是对复杂生物样品中单个基因进行可靠分析的基础。在过去的几年里，焦点已经转移到下一代测序(ngs)技术和rna测序。由于没有稳健的方法直接对rna进行测序，因此所有的文库制备方法都是从将rna反转录成dna开始的。然后，在所谓的“第二链合成”过程中，通常将所得的单链cdna转化为双链dna(dsdna)，这使得寡核苷酸与测序机器兼容。此外，测序过程需要衔接子序列。这些衔接子只能通过标记(转座酶介导的dna片段化和引物添加)或通过酶促连接高效地引入dsdna。这种单链rna向双链dna的转化过程，是造成目前rna文库制备方法复杂的原因。
8.最近，wo 2019/063803公开了化学连接方法，该方法使得能够以与连接酶针对dsdna显示的效率相似的效率化学连接单链dna。该方法使用了由sharpless和meldal的小组在2001/2002年独立定义的点击化学概念(sharpless,k.b.等人，angew.chem.2002,114,2708,angew.chem.int.ed.2002,41,2596；meldal,m.等人，j.org.chem.2002,67,3057)。铜催化的叠氮化合物与炔烃产生1,2,3-三唑的反应生(其为1,3-偶极huisgen环加成的变化形式(r.huisgen,1,3,-diploar cycloaddition chemistry(ed.:a padwa),wiley,new york,1984))已经成为执行点击反应最广泛使用的方法。由于其温和的条件且效率高，该反应已在生物学和材料科学中得到了非常广泛的应用，诸如用于各种目的的dna标记(gramlich，p.m.a.等人，angew.chem.int.ed.2008,47,8350)。
9.这种化学连接原理促进各种小组开发了无需酶促连接的文库制备方法(routh,a.等人，j.mol.biol.427,2610-2616(2015),us 2018/0127816 a1(illumina,inc.),miura,f.等人，nucleic acids research，第46卷，第16期，e95(2018))。尽管减少方案步骤(例如通过消除对第二条链合成的需要或抑制人为重组(artefactual recombination)和引物二聚体形成)的数量有好处，但注意到与常规方案相比，灵敏度略有下降。此外，由于在反转录过程中需要掺入人工核苷酸，并且标准文库制备方法中使用的所有聚合酶都不接受由此产生的骨架模拟物，因此缺少新方案的广泛商业应用。
10.因此，本发明的目的是提供用于mrna的扩增和尤其是样品中包含的多种mrna的全长文库，例如个体的某一细胞类型的全外显子组制剂或总mrna的制备的改进的概念。促进其它rna，尤其是病毒rna的测序或扩增，是由发明人进行的研究的另一个方面。此外，本发明的一个目的是提供利用化学连接方法的效率来连接单链dna的方法，但是该方法与文库工作流程中的标准酶兼容。


技术实现要素：

11.本发明通过提供用于扩增rna和/或进行rna(优选mrna)测序，尤其是用于制备某些细胞的总mrna或生物体的全外显子组的全长mrna文库的改进的方法，解决了上述问题。
12.在第一方面，本发明涉及用于扩增包含在样品中的至少一种rna，优选mrna和/或对所述rna进行测序的方法，所述方法包括：
13.a)提供至少一种第一引物，所述第一引物包括与位于至少一种待扩增rna的3’端或其附近的序列互补的序列，以及在允许至少一种第一引物与至少一种rna杂交的条件下将所述至少一种第一引物添加到样品中，
14.b)在包括向样品中添加逆转录酶和核苷酸的条件下反转录所述至少一种rna，以提供所述至少一种rna的一个或多个全长cdna，
15.c)至少从过量的核苷酸中纯化样品
16.d)添加双脱氧核苷酸(所述双脱氧核苷酸在3’位置被修饰以包含一对叠氮化物和炔烃分子的第一配偶体)和不依赖于模板的聚合酶，以在步骤b)中获得的cdna的3’末端附接单个3
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叠氮化物或3
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炔烃修饰的双脱氧核苷酸，
17.e)至少从步骤d)中添加的过量修饰的双脱氧核苷酸中纯化样品，
18.f)在进行点击反应和在形成三唑键联的情况下将衔接子分子与步骤d)中获得的一种或多种3
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修饰的cdna连接的条件下，加入衔接分子，所述衔接分子包含多核苷酸序列
和附接至其5’端的所述叠氮化物和炔烃分子对的第二个配偶体，
19.g)添加第二引物，所述第二引物包含与衔接子分子5’端处的至少6个核苷酸互补并且在其3’端包含与一种或多种cdna3’端的双脱氧核苷酸互补的核苷酸的核苷酸序列，并以实现第二引物与步骤e)中获得的连接的衔接子/cdna分子在与三唑键联重叠的位置处的杂交和结合，
20.以及替代地
21.h)加入dna聚合酶以实现第二引物的链延伸，以产生一种或多种第二链dna，包括与步骤b)中获得的一种或多种完整cdna互补的序列，以及
22.i)对步骤h)的一种或多种第二链dna进行测序，或者
23.j)加入与第一引物的至少一部分相同的第三引物，扩增一种或多种全长cdna以获得全长rna文库，
24.或者
25.h’)加入dna聚合酶以实现第二引物的链延伸，同时测定一种或多种第二链dna和一种或多种完整cdna的序列。
26.在第二方面，本发明涉及用于扩增样品中包含的至少一种rna(优选mrna)并且/或者测定所述rna的序列，所述方法包括：
27.a)提供至少一种第一引物(所述第一引物包含与位于至少一种待扩增的mrna的3’端或其附近的序列互补的序列，并且所述引物在其5’端含有一对叠氮化物和炔烃分子的第一配偶体的修饰)，以及在允许至少一种第一引物与至少一种mrna杂交的条件下将所述至少一种第一引物添加到样品中，
28.b)在包括向样品中添加逆转录酶和核苷酸的条件下反转录所述至少一种mrna，以提供所述至少一种mrna的一种或多种全长cdna，
29.c)至少从过量的核苷酸中纯化样品
30.d)添加双脱氧核苷酸(所述双脱氧核苷酸在3’位置被修饰以包含一对叠氮化物和炔烃分子的第二个配偶体)以及不依赖于模板的聚合酶，以在步骤b)中获得的一种或多种cdna的3’端处附接单个3
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叠氮化物或3
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炔烃修饰的双脱氧核苷酸，
31.e)至少从步骤d)中添加的过量经修饰的双脱氧核苷酸中纯化样品，
32.f)在形成三唑键联的情况下，进行点击连接反应以产生一种或多种环状单链cdna，
33.g)添加第二引物，所述第二引物包含与第一引物的5’端处的至少6个核苷酸互补并且在其3’端包含与cdna的3’端处的双脱氧核苷酸互补的核苷酸的核苷酸序列，以实现第二引物与步骤f)中获得的一种或多种连接的环状第一引物/cdna分子在与三唑键联重叠的位置处的杂交和结合，
34.或者
35.h)加入dna聚合酶以实现第二引物的链延伸，随后扩增一种或多种全长cdna，或者
36.h’)加入dna聚合酶，以实现第二引物的链延伸，同时测定包括一种或多种全cdna在内的一种或多种环状单链dna的序列。
37.在第三个方面，本发明涉及此类发明方法用于从含有多种mrna分子的样品中制备全长mrna文库的用途。
38.在第四方面，本发明涉及对生物体的一种或多种类型的细胞的总mrna或生物体的全外显子组进行测序的方法，所述方法包括提供含有这种外显子组或总细胞mrna的样品，通过实施本文所述的根据本发明的方法制备全长mrna文库，以及测定所获得的总细胞mrna或外显子组的序列。
39.在第五方面，本发明涉及用于扩增样品中包含的至少一种rna，优选mrna并且/或者测定所述rna序列的试剂盒，所述试剂盒包括：
40.a)第一引物，所述引物包含与位于至少一种待扩增的rna的3’端或其附近的序列互补的序列，
41.b)逆转录酶，
42.c)双脱氧核苷酸，其在3’位置被修饰以包含一对叠氮化物和炔烃分子的第一配偶体，
43.d)不依赖于模板的聚合酶，
44.e)衔接分子，其包含多核苷酸序列和附接至其5’端的所述叠氮化物和炔烃分子对的第二结合配偶体
45.f)第二引物，其包含与衔接分子的5’部分的至少6个核苷酸互补并且在其3’端包含与c)的双脱氧核苷酸互补的核苷酸的核苷酸序列，
46.g)与第一引物的至少一部分相同的第三引物。
47.本发明的第六方面是用于扩增样品中包含的至少一种rna，优选mrna并且/或者测定所述rna的序列的试剂盒，所述试剂盒包括：
48.a)第一引物，所述引物包含与位于至少一种待扩增的mrna的3’端或其附近的序列互补，并且所述引物在其5’端含有一对叠氮化物和炔烃分子的第一配偶体的修饰，
49.b)逆转录酶，
50.c)双脱氧核苷酸，其在3’位置被修饰以包含一对叠氮化物和炔烃分子的第二配偶体，
51.d)不依赖于模板的聚合酶，
52.e)第二引物，其包含与第一引物5’部分的至少6个核苷酸互补，并且在其3’端包含与c)的双脱氧核苷酸互补的核苷酸的核苷酸序列。
53.本发明和优选实施例的详细描述
54.通过常用方法扩增来自天然来源的全长rna，尤其是全长mrna、特定细胞或细胞类型的总mrna，或甚至生物体的全外显子组，即蛋白质编码基因的完整编码区，仍然是一个复杂和耗时的过程。本发明采用所谓的“点击化学”来促进全长rna的扩增，甚至样品中包含的几种或多种rna的扩增也可以在一个步骤中进行。rna序列的测定可以在扩增后或甚至在通过一种或多种rna的反转录获得的一种或多种cdna的第二链合成过程中进行。
55.原则上，如果需要扩增这种rna，尤其是含有任何种类rna的混合物并且/或者测定所述rna的序列，本发明的方法可以应用于所有种类的rna。将本发明的方法应用于mrna是优选的，并且这种方法包括的另一种优选rna是呈任何形式的病毒rna，即也是整合到宿主基因组中的病毒rna。虽然本发明方法的以下详细示例性描述通常主要涉及mrna，但应当理解，也可以进行相同的措施和步骤，以便以相同的方式扩增病毒rna或其它rna或测定其序列。
56.在本发明的整个上下文中，mrna是指信使rna，即由细胞或生物体中包含的dna编码的并且可通过细胞机制翻译成蛋白质的rna。另外，如此处所定义的，术语rna和mrna也可涵盖合成核糖核酸或包括经修饰的核苷酸的mrna。rna或mrna还意指包括含有糖部分的类似物的核酸。虽然天然rna和mrna含有一种或多种选自腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤的碱基，但也可包含非天然的碱基。
57.本发明的方法可应用于只含有一种类型的rna或mrna的样品。这意味着样品仅包含具有相同核苷酸序列和相同核苷酸数量的核酸。在本发明的其它实施方案中，样品可以包含两种或更多种不同的rna和/或mrna，优选两种或gjq多种不同的mrna。在本发明的上下文中，术语“不同的rna和/或mrna”旨在不仅包括具有不同核苷酸序列的核酸，而且还包括具有相同核苷酸序列但由于任何原因而含有不同数量的核苷酸的rna和/或mrna。
58.如在本发明的上下文中所使用的，术语“点击化学”或“点击反应”等旨在指本领域中描述的所有相应方法以及在上述“发明背景”部分中提到的示例性出版物。特别是参考wo 2019/063803 a1，出于本发明的目的特别地包括其公开内容，尤其是涉及进行点击反应的条件、试剂和方法方面。优选地，在步骤f)的上下文中，进行铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应，最优选在wo 2019/063803 a1所述的条件下进行。然而，在本发明的上下文中，也可能并且优选进行应变促进的无铜点击连接(strain-promoted copper-free click ligation)(spaac)，其为用于连接炔烃和叠氮化物修饰的核酸的另外的公知方法(例如i.s.marks等人，bioconjug chem.2011 22(7):1259-1264；m.shelbourne等人，chem.commun.2012,48,11184-11186；m.shelbourne等人，chem.commun.2011,47,6257-6259)。现有技术中已经描述了用于修饰用于点击化学的核苷酸和核酸的合适的炔烃和叠氮化物残基，所述炔烃和叠氮化物残基是本领域技术人员公知的。点击就绪的5
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炔烃或叠氮化物修饰的寡核苷酸的实例也概述于图7中。炔烃三键或叠氮化物基序与如此修饰的核苷酸之间的间隔子的长度可以变化，并且仅受dna聚合酶或逆转录酶通读包含三唑键联的相应模板的能力的限制，所述三唑键联是由一对炔烃和叠氮化物分子的点击反应产生的。在本发明的优选实施方案中，间隔子包含至少一个原子和至多30个原子，更优选至多20个原子，最优选至多10个原子。间隔子包含c原子，但是也可以包含杂原子n和/或o。
59.简言之，本发明的第一方面包括通过反转录从一种或多种(m)rna模板制备cdna，在此期间或之后，将所获得的一种或多种cdna的3’端对其进行修饰以包括炔烃或叠氮化物修饰。更具体地说，将参与点击反应的一对分子中的一个配偶体附接至cdna。随后，通过点击反应将包含多核苷酸或寡核苷酸序列以及在其3’端处的分子对的第二个配偶体的衔接子与一种或多种cdna连接。使用这种衔接子和特异性第二引物允许高效扩增一种或多种cdna或直接测定一种或多种cdna的序列。
60.该第一发明方法包括初始步骤a)，其中将与位于至少一种(m)rna的3’端或其附近的序列互补的第一引物加入到含有一种或多种(m)rna的样品中。在允许第一引物与互补(m)rna序列杂交的条件下，将该第一引物添加到样品中。
61.所述至少一种第一引物包括足够数量的核酸，所述核酸与相应的靶(m)rna互补，以允许引物与(m)rna有效杂交。第一引物可包括任何数量的被认为在dna/rna扩增程序中有用的核苷酸。在优选实施方案中，第一引物由至少5个核苷酸，优选至少10个或至少15个核苷酸组成。在此类优选实施方案中，第一引物还由最多60个核苷酸，优选最多50个核苷
酸，最优选最多45个核苷酸组成。实现或有利于至少一种第一引物与至少一种mrna杂交的条件是本领域技术人员熟知的，包括如zhang等人biochem.j.，1999,337,231-241中描述的那些条件。技术人员也可通过初步测试容易地确定尤其有利的条件。
62.在该第一发明方法的第二步骤b)中，从与至少一种(m)rna杂交的引物的3’端开始，在包括向样品中添加逆转录酶和核苷酸的条件下反转录(m)rna，以提供至少一种mrna的一种或多种全长cdna。虽然天然存在的4种类型的核苷酸datp、dctp、dgtp和dttp通常用于本发明的上下文中，但也可包括人工核苷酸，只要它们不损害本发明方法的任何进一步步骤的cdna形成。至于步骤a)，用于反转录的条件也是技术人员熟知的。
63.在中间步骤c)中，至少去除步骤b)中使用的过量核苷酸。在本发明的优选实施方案中，可以在该步骤中除去剩余的一种或多种(m)rna、过量的逆转录酶和过量的一种或多种引物。在尤其优选的实施方案中，根据本领域已知的方法进行cdna纯化，并且纯化的cdna包括在该方法的进一步的步骤中。
64.在接下来的步骤d)中，向样品中加入双脱氧核苷酸(ddntp)，其在3’位置被修饰以包括叠氮化物/炔烃点击反应对的第一个配偶体和不依赖于模板的聚合酶。术语“双脱氧核苷酸”或ddntp代表不具有2
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和3
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羟基的核苷酸。在本发明的上下文中，ddntp包括碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤之一。通过聚合酶将经修饰的双脱氧核苷酸添加到cdna序列的3’末端，并且由于双脱氧核苷酸不包含所需的3’羟基，因此不会发生进一步的链延伸，并且连接的叠氮化物或炔基可用于cdna的3’末端与第二点击反应配偶体的反应。在本发明的优选实施方案中，炔烃或叠氮基团附接至ddntp的脱氧核糖部分的3
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位置，并且还优选地，ddntp包含附接至分子的叠氮化物基团。
65.在进一步的中间步骤e)中，除去至少过量的步骤d)中使用的经修饰的双脱氧核苷酸。在本发明的优选实施方案中，同样在该步骤中，最终剩余的一种或多种(m)rna、过量的逆转录酶和过量的第一引物和/或步骤d)中使用的不依赖于模板的聚合酶也可被除去。
66.在步骤f)中，将衔接分子作为第二点击反应配偶体添加到样品中。衔接子分子包含寡核苷酸或多核苷酸序列，并包含附接至其5’的叠氮化物和炔烃分子对的第二配偶体。炔基和叠氮化物基之间发生的点击反应在形成三唑键联的情况下将衔接子分子与cdna的3’端连接。衔接子分子用于在本发明方法的下一步中通过杂交进行的第二引物的结合和随后的扩增。因此，衔接子分子含有足以允许这种第二引物结合的数量的核苷酸，通常至少6个核苷酸，优选至少10个，更优选至少15个核苷酸。在优选实施方案中，衔接子分子包含最多100个核苷酸，更优选最多80或60个核苷酸。此外，在步骤e中使用衔接子分子也被认为是本发明的优选实施方案，所述衔接子分子含有与附接至其5’端的炔烃。
67.在下一步骤g)中，添加上述第二引物，其包含与衔接子分子互补的全部或部分核苷酸序列。第二引物的核苷酸序列与衔接分子核苷酸序列的5’端处的至少6个核苷酸互补，并且在其3’端含有与一种或多种cdna的3’端的双脱氧核苷酸互补的核苷酸。因此，第二引物在与通过点击反应形成的三唑键联重叠的位置处与连接的衔接子/cdna分子杂交并结合。
68.在进一步的步骤中，通过添加dna聚合酶来延伸第二引物。只要需要扩增一种或多种rna，就可加入一种或多种与一种或多种第一种引物的至少一部分相同的第三种引物，然后可以根据已知方法扩增获得的cdna。该选项由步骤h)和j)定义。第三引物可以例如比第
一引物包含更少的核苷酸，但是仍然确保杂交。第三引物还可包括确保杂交的特定序列和与至少一种mrna上的第一引物的靶序列不互补的其它序列。
69.至于一种或多种rna的测序，在本发明的范围内有不同的选项。首先，在步骤g)之后，可以添加dna聚合酶以实现第二引物的链延伸，从而产生一种或多种“全长”第二链dna，包括与步骤b)中产生的一种或多种完整cdna互补的序列。可以按照已知的用于单分子测序方法(可以例如从pacific biosciences获得的系统和试剂盒，https://www.pacb.com/)对这些一种或多种第二链dna进行测序，而无需扩增。在步骤h)和i)中定义了该选项。
70.在替代实施方案中，在加入dna聚合酶后，测序可以与第二引物的链延伸同时进行。该替代选项由步骤h’)定义。测序可以例如根据公知的桑格测序法或基于该原理开发的方法进行，或者通过合成测序法(例如可从illumina获得的系统和试剂盒，https://illumina.com/)进行。
71.本发明的方法第一次允许产生特定rna样品的扩增的cdna，而不需要通常使用的方法所要求的rna的片段化和随机引发，图1中示意性地表示了所述方法之一。与此类现有技术的扩增过程相比，本发明的方法需要较少的过程步骤来获得例如完整的一种或多种目标mrna的完全代表性cdna文库，而无需对齐重叠片段的序列数据。此外，本发明的方法从随机启动或特异性启动产生全长文库。另外，本发明的方法可用标准聚合酶进行文库制备工作流程。使用poly(dt)启动的本发明方法的示意图显示在图2中。
72.作为第一引物，在本发明的上下文中可以考虑各种不同的替代物和相应的多核苷酸。首先，可使用现有技术方法中已知的随机引物。对于该第一替代方案，可使用具有随机序列的相当短的核苷酸序列，所述随机序列与一种或多种rna，优选一种或多种mrna中的随机部分杂交。使用此类随机第一引物的过程的产物具有不同的长度。
73.在本发明的第二替代和优选实施方案中，使用特异性引物代替随机引物。这种替代引物尤其适用于样品中包含的至少一种rna的序列或身份已知的情况。在分析样品中可能存在的一种或多种已知(m)rna的存在的情况下，可以使用相应的特异性引物并允许检测此类已知的一种或多种(m)rna。
74.在也是本发明的优选实施方案的另外的替代方案中，poly(dt)引物被用作至少一种用于mrna扩增的第一引物。多核苷酸引物通常包含6至30个dt核苷酸。在允许与样品中至少一种mrna的一种或多种poly(a)尾杂交的条件下，将引物加入到样品中。所有mrna分子在其3’端都包含poly(a)尾，其由多个单磷酸腺苷组成。poly(a)尾通过基因转录结束后发生的多腺苷酸化添加到真核生物的rna中。然而，poly(a)尾在翻译过程中没有编码功能。因此，poly(a)尾是引物杂交的理想靶标，并且提供相应的poly(dt)引物不需要任何关于靶mrna序列的知识。此外，使用poly(dt)引物允许反转录和扩增样品中包含的一种或多种mrna的完整编码序列。
75.在某些实施方案中，本发明还包括使用不同种类的引物，即随机引物和特异性引物或者随机引物和poly(dt)引物或者特异性引物和poly(dt)引物。这在引物也包含特定锚或捕获序列的情况下特别有用。例如，可以包括特异性引物来检测样品中已知mrna的存在。例如，附接至这种特异性引物的5’端的捕获序列的存在提供了在扩增后的后续步骤中，将针对这种已知mrna获得的扩增的cdna附接至固体支持物，将附接至固体支持物上的cdna与其它扩增产物分离，并检测这种cdna的存在的选项。通过包含附接至一种或多种第一引物
的捕获或锚定序列而提供的其它有用的选项是技术人员可容易识别的，并且也涵盖于本发明的上下文中。
76.在本发明用于mrna扩增的特别优选的实施方案中，poly(dt)引物用作至少一种第一引物，其包括锚定序列。该锚定序列提供了附加的通常为2至50个核苷酸的5
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末端延伸。优选地，锚定序列包含至少5个核苷酸，更优选至少8个核苷酸。在进一步优选的实施方案中，锚定序列包含最多40个，更优选最多30个核苷酸。这种锚定序列的该存在例如提供了确保本发明方法中使用的一种或多种poly(dt)引物的均匀定位的可能性。
77.在另外的优选实施方案中，在本发明方法的步骤d)中加入3
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炔烃-或3
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叠氮化物修饰的ddgtp或3
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炔烃或3
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叠氮化物修饰的ddctp。已经观察到，碱基g或c之一在cdna的3’端处的存在导致在下面的步骤g)中第二引物的特别高效的杂交和附接。当在步骤d)中，通过向cdna中添加3
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炔烃或3
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叠氮化物修饰的ddgtp，将cdna的3
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末端修饰为包含g，获得了最佳的结合结果，最优选的经修饰的双脱氧核苷酸是3
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叠氮基-2’,3
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双脱氧gtp(azddgtp)。
78.与步骤d)的上述优选实施方案相对应，进一步优选的是步骤g)中的第二引物在其3’端含有dg或dc，最优选dc。本发明的方法要求第二引物在其3’端处含有与一种或多种cdna的3’端核苷酸互补的核苷酸。因此，在优选实施方案中，其中在步骤d)中使用炔烃或叠氮化物修饰的ddgtp，第二引物在其3’端包含dc。在另一个优选实施方案中，其中炔烃或叠氮化物修饰的ddctp包含在步骤d)中，第二引物相应地在3’端含有dg。根据使用上述经修饰的ddgtp的上述公开的最优选实施方案，在这样的最优选实施方案中，使用在其3’端含有dc的第二引物。在本发明的另外的优选实施方案中，第二引物在其3’端的第二位置包含dc。本发明人已经认识到，dc在第二引物与通过点击反应形成的三唑键联重叠的位置处的存在显著促进了引物结合和随后的引物延伸。
79.作为步骤d)中的不依赖于模板的聚合酶，优选使用酶末端脱氧核苷酰转移酶(tdt)。所述酶是dna聚合酶的x家族的成员，并催化核苷酸至dna分子的3’末端的添加。与大多数其它dna聚合酶不同，tdt不需要模板。其可将核苷酸作为优选底物添加到3
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悬突，然而，也可以很好地将核苷酸添加到平端或凹陷的3
’‑
末端。因此，其在分子生物学中，即在快速扩增cdna末端(race)、pcr和最近的酶促从头基因合成中有重要而广泛的应用。
80.在本发明的上下文中，包括引物和衔接子分子中的至少一种是一种选择，也是一种优选实施方案，所述引物和衔接子分子包括含有可检测标记物或标签的部分，或者允许固定在固体支持物上的部分。上面已经针对一种或多种第一引物描述了此类选择之一。这种部分例如能够直接或通过其它分子间接与固体支持物形成共价键。例如，在旨在捕获扩增的核酸用于进一步检测或测序的情况下，固定至固体支持物可以是高度有利的，并且通常用于自动测序方法。根据这样的实施方案，本发明中使用的引物或衔接子之一也可以已经附接于固体支持物，并且该方法可以在这样的固体支持物存在的情况下进行。作为固体支持物，可以包括或直接或在后期添加任何材料，这使得能够从反应混合物中捕获并分离附接的分子。作为固体支持物，在本发明的上下文中可以包括和使用多种材料和分子。例如，平面或三维的表面可以作为固体支持物提供，例如，引物或衔接子所附接至或可通过随后的结合反应附接至的珠粒可以有利地用于这种情况。
81.此外，还可以使用呈标记形式(即包含可检测的标记物或标签以允许检测扩增产
物)的引物或衔接子之一。尤其是在使用特异性引物的情况下，通过本领域技术人员已知的方法容易对扩增的cdna的存在进行相应检测。此外，可将以上概述的选项可组合以提供扩增的cdna的捕获和检测。在本发明的特别优选的另外的实施方案中，本发明方法中使用的引物或衔接子中的至少一种附接至固体支持物，或者连接或结合至有助于与固体支持物结合的分子，并且引物和衔接子分子中的至少一种包含可检测的标记物或可通过其附接至可检测的标记物的分子。本发明的这些实施方案允许对扩增产物以及从而待分析的样品中特定mrna的存在进行简单且优选地也是自动的检测。
82.虽然上述优选实例不能穷尽地列出本发明方法的所有可能的变化和益处，但本领域技术人员可以容易地调整该方法，以最适合研究或诊断的特定目的。因此，尤其地本发明的方法与其它已知方法的组合包括在本发明的范围内。
83.图9示出了本发明的方法的变型和本发明的第二方面。在这种替代方法中，作为第一引物，在本发明的上下文中可以考虑各种不同的替代方案和相应的多核苷酸。首先，用一对叠氮化物和炔烃分子的第一配偶体在5’端修饰的引物可以通过已知的固相方法制备，并用于上述步骤a)和b)中所述的反转录。在步骤c)中纯化并在步骤d)中通过不依赖于模板的聚合酶加入经修饰携带叠氮化物和炔烃分子对的第二配偶体的ddntp后，将产生末端含有叠氮化物和炔烃残基的一种或多种cdna。除去过量的核苷酸后，可以在点击条件下进行点击连接以产生环状单链cdna(例如，v.cassinelli，等人angew.chem.int.ed.,2015,54,7795-7798)。为了防止串联，如前所述(r.kumar等人，j.am.chem.soc.,2007,129(21),6859-6864)，在点击连接之前稀释双修饰的cdna。然后，可使用与第一引物的至少一部分互补的替代的第二引物代替步骤g)的第二引物，以便在滚环扩增(bgi基因组ngs法)中扩增模板或测定其序列。因此，在该替代方法中，尽管针对第一发明方法所描述的大多数方面仍然适用，但添加本发明的第一方面的步骤f)中描述的衔接子分子不再适用或需要。然而，替代的第二引物在其3’端也含有与cdna的3’端的双脱氧核苷酸互补的核苷酸(在通过点击反应环化之前)。
84.在本发明方法和本发明上述第二方面的上下文中，代替通过步骤h)进行扩增，也可以根据步骤h’)中的已知方法直接进行测序。例如，桑格测序可以直接使用本发明方法的步骤g)中获得的产物或如图9底部针对替代方法所示的环状dna/引物构建体来进行。也可以使用通过本发明方法的步骤g)的产物或替代方法的环状dna/引物构建体的链延伸获得的产物来应用单核苷酸测序方法。
85.本发明的另外的主题和第三个方面是使用上述发明方法来扩增样品中包含的一种或多种mrna，以制备全长mrna文库。尤其是在其中使用poly(dt)引物作为至少一种第一引物的本发明的优选实施方案的上下文中，该方法允许扩增样品中包含的完整mrna序列。当样品中含有一种或多种类型的生物体的细胞的总mrna，或甚至生物体的全外显子组，也就是在特定细胞或生物体中将被翻译成蛋白质的总mrna时，这尤其有用。
86.本发明的另外的第四主题涉及如上详述的本发明的方法和用途，并且还包括确定扩增的mrna或获得的mrna文库的序列。这种方法允许对生物体细胞的总mrna以及甚至生物体的全外显子组进行可靠的测序，并确保在mrna库中也检测到稀有转录物。提供这样的方法在医学研究和临床诊断中特别有用，例如，用于复杂病症中的变体定位、遗传异常的研究、确定疾病的遗传基础或用于诊断门迪连病症(mendilian disorder)和其它用途。
87.本发明的另外的第五和第六主题提供了用于实施本发明的上述方法和用途中的至少一种的试剂盒。
88.根据本发明的第一方面的允许扩增样品中包含的至少一种(m)rna并且/或者测定所述(m)rna的序列的试剂盒包括
89.a)第一引物，其包含与位于至少一种待扩增的(m)rna的3’端或其附近的序列互补的序列，
90.b)逆转录酶，
91.c)双脱氧核苷酸，其在3’位置被修饰以包含一对叠氮化物和炔烃分子的第一配偶体，
92.d)不依赖于模板的聚合酶，
93.e)衔接分子，其包含多核苷酸序列和附接至其5’端的所述叠氮化物和炔烃分子对的第二结合配偶体
94.f)第二引物，其包含与衔接分子的5’部分的至少6个核苷酸互补并且在其3’端包含与c)的双脱氧核苷酸互补的核苷酸的核苷酸序列，
95.g)任选地第三引物，其与第一引物的至少一部分相同。
96.根据本发明的第二方面，用于对样品中包含的至少一种rna，优选mrna进行扩增和/或测序的试剂盒包括：
97.a)第一引物，所述引物包含与位于至少一种待扩增的mrna3’端或其附近的序列互补，并且所述引物在其5’端含有一对叠氮化物和炔烃分子的第一配偶体的修饰，
98.b)逆转录酶，
99.c)双脱氧核苷酸，其在3’位置被修饰以包含一对叠氮化物和炔烃分子的第二配偶体，
100.d)不依赖于模板的聚合酶，
101.e)第二引物，其包含与第一引物5’部分的至少6个核苷酸互补，并且在其3’端包含与c)的双脱氧核苷酸互补的核苷酸的核苷酸序列，
102.此外，在本发明的优选实施方案中，本发明的试剂盒可以包含用于实施本发明方法的其它有用试剂，尤其是以下试剂的至少一种
103.h)rna酶，
104.i)所有四种天然存在的核苷酸，
105.j)用于进行点击反应的试剂，
106.k)缓冲剂和溶剂，
107.l)用于进行cdna扩增的试剂
108.m)用于纯化的试剂
109.本领域技术人员可以很容易地调整试剂盒中包含的用于实施此类方法的试剂，以包括额外的试剂或留出特定方法不需要的试剂。
110.上面公开的关于本发明的一个主题的所有信息被认为同样适用于其它主题的上下文，即使没有明确重复，该信息在本发明的上下文中具有可识别的相关性。
附图说明
111.图1示出了用于文库制备的rna的普通现有技术pcr扩增的示意图。
112.使用超声波装置对rna样品进行片段化，(随机地)引发片段，并使用逆转录酶进行第一链合成(cdna合成)。产生掺入尿嘧啶而非dttp的第二链，并且纯化双链dna片段并使其末端成为平端。添加da尾以提高随后的酶促衔接子连接步骤的效率。另一个涉及大小选择的清理步骤是在pcr富集之前去除含u链。
113.图2示出了本发明方法的示意图，所述方法包括poly(dt)启动以扩增mrna并提供全长mrna文库。
114.图3a示出了由本发明方法产生的点击连接的cdna库产生的全长pcr片段。一个引物与点击连接的衔接子(衔接子引物1)结合，第二引物是用于启动反转录的poly(dt)(poly(dt)反向引物)的一部分。取决于延伸时间(1至10min)，pcr片段的分布向更长的扩增转移。
115.图3b、图3c示出了使用bioanalyzer仪(agilent)对全长pcr片段的分析与一分钟的延伸时间(b)相比，pcr期间延伸时间为三分钟(c)的样品的dsdna大小分布明显向更大的大小偏移。
116.图4示出了由本发明方法产生的点击连接的cdna库产生的pcr片段。引物覆盖了转录本的最5’端。除了像gapdh和β-gal这样的持家基因之外，将egfp、cas9和fluc的mrna掺入jurkat细胞总mrna库中，用于内部对照。
117.图5示出了由本发明方法产生的点击连接的cdna库产生的pcr片段。一个引物与点击连接的衔接子结合，第二引物与基因特异性反向互补序列结合(如图4中的int rev)。除了人工产生的β-gal基因片段，与图4相比，所有pcr产物都比预期的要大。
118.图6示出了用于本发明方法的单链cdna的末端脱氧核苷酰基转移酶介导的3
’‑
末端标记的示例性点击就绪核苷酸。
119.图7示出了用于本发明方法的衔接子寡核苷酸的示例性点击就绪5’端。
120.图8示出了与天然磷酸二酯(左)相比，用于本发明方法的示例性三唑骨架形式。
121.图9示出了用于全长mrna测序的替代工作流程的示意图。使用5
’‑
炔烃/叠氮化物修饰的引物进行逆转录，并纯化所得的cdna。通过末端脱氧核苷酰基转移酶(tdt)将叠氮化物/炔烃核苷酸掺入到3’末端，除去过量的核苷酸后，进行点击连接以产生环状ssdna。通过将至少部分互补的引物应用于初始引物，环状ssdna的扩增甚至测序将是可能的。
122.图10三唑超读的pcr产物(b)，在启动模型rna(a)上进行所述三唑超读。用含有3
’‑
叠氮基ddatp的核苷酸混合物反转录模型rna，去除核苷酸，并将cdna点击连接至5
’‑
炔烃衔接子(炔烃-寡聚物1)。粗点击反应混合物被用作涉及不同模板量、聚合酶和循环条件的pcr的模板。
123.图11示出了与两种合成制备的寡核苷酸(3
’‑n3-参考，炔烃寡聚物3和叠氮化物-寡聚物2)之间的点击相比，tdt介导的azddntp至未经修饰的寡核苷酸(寡聚物2)的掺入和随后利用短模型炔烃寡核苷酸(炔烃-寡聚物3)的点击的结果。
124.图12示出了桑格测序的毛细管电泳描迹线，其由根据本发明方法处理的pcr片段(图5，泳道4)产生。测序表明，在该方案后，mrna的5’端保持完整。此处是对fluc mrna(萤火虫荧光素酶)进行的，其在逆转录前被搀入到rna库中。平均质量值得分(qv)为54.34，即特定序列的确定性》99.999％。
125.以下实施例进一步举例说明了本发明：
实施例
126.实施例1(与图3相关)
127.关于内部对照，除了像gapdh这样的管家基因之外，还在2μg的jurkat细胞总rna库中加入了egfp(baseclick)、cas9(trilink)、β-gal(trilink)和fluc(trilink)的mrna(0.1μg)。向该rna库中加入1μl dntp混合物(10mm)和2μl poly(dt)引物(100μm))，用不含rna酶的h2o调整至总体积为13μl。将混合物在65℃孵育5min，冷却至0℃持续3分钟以允许杂交。对于cdna合成，加入4μl 5x superscriptiv缓冲液、1μl二硫苏糖醇(100mm)、200单位superscript iv逆转录酶，并用不含rna酶的水充满至20μl的总体积。将混合物在50℃孵育20分钟，在80℃孵育10分钟，以及冷却至4℃持续3分钟。cdna合成后加入3μl 10x rna酶h缓冲液、1μl rna酶a(10mg/ml)、1.4μl rna酶h(5u/μl)和4μl虾碱性磷酸酶(1u/μl)和0.6μl dh2o以去除rna和过量的核苷酸。将混合物在37℃孵育25min，在65℃孵育15min，以及冷却至0℃持续3分钟，然后按照制造商对pcr产物的说明，用旋转柱法(baseclean试剂盒)进行清洗，并用17μl dh2o洗脱。
128.纯化的混合物直接用于利用3
’‑n3-ddgtp的叠氮化物延伸。向17μl纯化的cdna混合物中加入5μl 5x tdt缓冲液、1μl 3
’‑n3-ddgtp(10mm)和2μl末端脱氧核苷酰基转移酶(20u/μl)。将溶液在37℃孵育1小时，然后冷却至0℃持续3分钟。按照制造商对pcr产物的说明，用旋转柱法(baseclean试剂盒)纯化经修饰的cdna，并用9μl进行洗脱
129.使用9μl纯化的且叠氮化物修饰的cdna、0.5μl炔烃衔接子(100μm)、2.5μl activator
240
(baseclick gmbh)、0.5μl dh2o和两个反应器丸粒进行点击连接。将反应混合物在45℃下以600rpm孵育40分钟。反应后，将上清液转移到新的小瓶中。用12.5μl水洗涤丸粒，并将上清液转移到之前的上清液中。按照制造商对pcr产物的说明，使用旋转柱法(baseclean试剂盒)清洗点击连接的cdna，并用10μl进行洗脱。
130.点击连接后，使用非靶向引物(衔接子引物1和poly(dt)反向引物)扩增cdna库，以获得全长mrna文库。在200μl反应小瓶中，将11.5μl dh2o、4μl 5x onetaq缓冲液、1μl衔接子引物1(10μm)、1μl poly(dt)反向引物(10μm)、0.4μl dntp混合物(10mm)、2μl纯化的点击连接混合物和0.13μl onetaq dna聚合酶(5000u/μl)(new england biolabs)组合。将样品在热循环器(biorad)中进行热循环程序。
131.作为标准循环，将以下条件用于不同的延伸时间(步骤4)：
[0132][0133]
按照制造商对pcr产物的说明，使用旋转柱法(baseclean试剂盒)清洗pcr混合物，并用10μl dh2o进行洗脱。在图3a中，在于tae缓冲液(20mm tris,10mm乙酸，0.5mm edta)中制备的1.5％琼脂糖凝胶(10x 15cm)上分析每个pcr的3μl等分试样。
[0134]
对于图3b和图3c所示的bioanalyzer测量，使用dna 1000试剂盒(agilent)和bioanalyzer装置(agilent 2100)测量了从mrna库中产生的全长pcr片段的1μl纯化的等分试样(图3a泳道1延伸时间1分钟，泳道2延伸时间3分钟)。
[0135]
寡核苷酸：
[0136][0137]
修饰：
[0138][0139]
实施例2(与图4相关)
[0140]
点击连接(实施例3中描述的程序)后，使用靶向引物(各种反向和正向intern引
物，见下表)从cdna库中扩增特定基因，这产生了特定的pcr片段。在200μl反应小瓶中，将11.5μl dh2o,4μl 5x onetaq标准反应缓冲液、1μl intern反向引物(10μm)、1μl正向intern引物(10m)、(10μm),0.4μl dntp混合物(10mm)、2μl纯化的并点击连接的cdna混合物和0.13μl onetaq dna聚合酶(5000u/μl)(new england biolabs)混合。将样品在热循环器(biorad)中进行热循环程序。
[0141][0142][0143]
在于tae缓冲液(20mm tris,10mm乙酸，0.5mm edta)中制备的1.5％琼脂糖凝胶(10x15cm)上分析每次pcr扩增的5μl未纯化的等分试样。
[0144]
寡核苷酸：
[0145][0146][0147]
实施例3(与图5和图12相关)
[0148]
点击连接(图3实施例中描述的程序)后，使用基因特异性引物和共同的衔接引物靶向引物(各种intern反向引物和衔接引物1，见下表)从cdna库中扩增特定基因，这产生了特异性pcr片段。在200μl反应小瓶中混合11.5μl dh2o,4μl 5x onetaq标准反应缓冲液、1μl intern反向引物(10μm)、1μl衔接子引物1(10μm)、0.4μl dntp混合物(10mm),2μl纯化的并点击连接的cdna混合物和0.13μl onetaq dna聚合酶(5000u/μl)(new england biolabs)。将样品在热循环器(biorad)中进行热循环程序。
[0149][0150]
在于tae缓冲液(20mm tris，10mm乙酸，0.5mm edta)中制备的1.5％琼脂糖凝胶(10x 15cm)上分析每次pcr扩增的5μl未纯化等分试样。
[0151]
对于图12所示的sanger测序，按照制造商对pcr产物的说明，使用旋转柱法(baseclean试剂盒)清洗产生的fluc(萤火虫荧光素酶)pcr片段，并用20μl dh2o洗脱。该模板和特异性引物(fluc intern反向引物)是根据eurofins genomics(ebersberg,germany)制备的，并发送至该公司进行sanger测序。
[0152]
寡核苷酸：
[0153][0154][0155]
实施例4(与图10相关)
[0156]
三唑超读的可行性被例证为模型rna序列的反转录。该rna与引物1杂交，然后在
200μm dttp、dgtp、dctp和3
’‑
叠氮基-ddatp存在的情况下使用mulv逆转录酶进行反转录。按照制造商的说明，通过使用核苷酸去除试剂盒(qiagen)纯化cdna来去除核苷酸和酶。
[0157]
将炔烃寡聚物1点击到于200μl反应小瓶中的纯化的cdna上，在总共12.5μl反应混合物中加入单个反应器丸粒(600-800μm，含元素铜)，并在45℃孵育60分钟。该反应混合物由800μm thpta,20mm mgcl2,5％dmso,7μm的炔烃寡聚体1和约4μm纯化的cdna组成。如有必要，使用dh2o将体积调节至最终12.5μl。
[0158]
孵育后，将样品短暂旋转，上清液转移到新的小瓶中以停止反应。将粗点击反应物以1:1000、1:5000和1:10000(最大值4nm、0.8nm和0.4nm)稀释以进行pcr扩增，无需进一步纯化。
[0159]
在200μl的反应小瓶中，以20μl的总体积制备pcr扩增物。将点击反应稀释液与200μm dntp、10pmol引物2和引物3以及1u聚合酶混合。对于各种聚合酶，按照制造商的建议使用pfu、phusion、q5、one taq和dream taq缓冲液。将样品在热循环仪(biorad)中进行热循环程序。
[0160]
作为标准循环条件，使用了以下条件：
[0161][0162]
对于pfu聚合酶，研究了不同的模板稀释度和替代循环条件：
[0163][0164]
孵育后，将样品短暂旋转，并在于tae缓冲液(20mm tris,10mm乙酸，0.5mm edta)中制备的3％琼脂糖凝胶(10x15cm)上分析等分试样。用20％紫色加样染料(neb)制备样品，并据此制备低分子量dna梯带(25-766bp,neb,n3233)；通常在0.5μl装载体积中使用0.0.5μl标记。
[0165]
将凝胶在tae缓冲液中运行，施加恒定功率(10w，最高500v，最大100ma)持续60分钟。然后，将凝胶在新制备的1∶10000溴化乙锭稀释液中孵育15分钟，然后在dh2o中脱色15分钟。为了可视化，使用了gel doc ez成像仪(bio rad)。
[0166]
寡核苷酸：
[0167][0168][0169]
反转录后所得的cdna：(seq id no.20)
[0170]5’‑
fam-tgg tcg att aca tgt act gtt ttc tgt ttg gtt tgt gtt tgt gtt ttc gtt tgt cga-n3[0171]
所得点击产物：(seq id no.21)
[0172]5’‑
fam-tgg tcg att aca tgt act gtt ttc tgt ttg gtt tgt gtt tgt gtt ttc gtt tgt cga taa tga tac ggc gac cac cgagat cta cac tct ttc cct aca cga cgc tct tcc gat ct-3’[0173]
at＝通过主链模拟物连接的a和t
[0174]
所得pcr产物：(seq id no.22)
[0175]5’‑
tgg tcg att aca tgt act gtt ttc tgt ttg gtt tgt gtt tgt gtt ttc gtt tgt cga taa tga tac ggc gac cac cga gat cta cac tct ttc cct aca cga cgc tct tcc gat ct-3’[0176]
修饰：
[0177][0178]
实施例5(与图11相关)
[0179]
在最终25μl的体积中，样品在1x末端核苷酰基转移酶缓冲液(25mm tris-hcl(ph 7.2),200mm二甲砷酸钾,0.01％(v/v)triton x-100,1mm cocl2)中包含1μm寡聚物2、1mm 3
’‑
叠氮基-2’,3
’‑
双脱氧鸟苷-5
’‑
三磷酸或3
’‑
叠氮基-2’,3
’‑
双脱氧尿苷和tdt-酶(2u/μl)以进行tdt-反应。将反应在37℃孵育过夜(12-15小时)，并通过加热至70℃持续10分钟来停止反应。使用qiaquick nucleotide removal试剂盒纯化混合物，并在30μl水中洗脱。
[0180]
在200μl反应小瓶中，将两个反应器丸粒(600-800μm，含元素铜)与12.5μl反应混合物混合，并在45℃孵育60min。点击反应混合物由800μm thpta,40mm mgcl2,5％(v/v)dmso in h2o,1μm炔烃-寡聚物3和约0.3μm来自tdt反应的纯化的叠氮化物寡核苷酸组成。作为参考，将由800μm thpta,40mm mgcl2,5％(v/v)的于h2o中的dmso,1μm炔烃-寡聚物3和约1μm叠氮化物-寡聚物2组成的反应混合物混合。
[0181]
孵育后，将样品短暂旋转，上清液转移到新的小瓶中以停止反应。将样品在20％聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。使用低分子量的dna梯带25-766bp,neb,n3233)作为参考。
[0182]
对于寡核苷酸的变性page，将样品与尿素(50v/v)混合，并装载在20％变性聚丙烯酰胺凝胶(7.5ml测序凝胶浓缩物，750μl测序缓冲液浓缩物，2.09ml双蒸水，3ml 6m尿素溶液，1.5ml 10
×
tris-硼酸盐-edta (tbe)缓冲液(1m tris,1m h3bo3,25mm edta)，150μl过硫酸铵(10％(w/v),10μl四甲基乙二胺))(w x d x h＝7.5x0.1x8.3cm)上。凝胶电泳在150v下于0.5 x tbe缓冲液中进行2小时。将凝胶在溴化乙锭溶液中染色，并用水洗涤。然后，使用biorad的gel doc
tm ez系统对条带进行可视化，并使用image lab
tm
软件进行分析。
[0183]
寡核苷酸：
[0184][0185]
修饰：