靶向人B7-H3分子的人源化单克隆抗体及其应用的制作方法

靶向人b7-h3分子的人源化单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种靶向人b7-h3分子的人源化单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.近年来，诸多临床研究表明b7-h3蛋白在正常组织中几乎不表达，却高表达在多种肿瘤组织，包括胶质瘤、肺癌、肠癌、肾癌以及前列腺癌组织中。加之上世纪80年代一株识别肿瘤相关抗原的单抗(克隆号：376.96)被鉴定出其识别的分子就是b7-h3，因此b7-h3被认为是一个广泛表达在肿瘤细胞表面的标志，被称为“肿瘤相关抗原”。已有大量研究表明，b7-h3的异常表达与多种肿瘤的不良预后相关，包括与病人生存率、疾病进展和病理分级等，并促进肿瘤的生长、转移和复发。
3.干扰肿瘤细胞中b7-h3的表达后发现b7-h3分子参与肿瘤细胞的生物学行为、糖酵解能力以及与肿瘤血管生成。尽管由于b7-h3的受体或相互作用的分子尚未明确，肿瘤细胞表达b7-h3的作用和机制也有待进一步研究，但肿瘤细胞表达的b7-h3可以直接介导肿瘤细胞生物学行为和代谢的调节。b7-h3已成为肿瘤免疫治疗中的最受关注的免疫检查点分子，也为肿瘤靶向治疗提供极具临床价值的靶点。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供种一种靶向人b7-h3分子的人源化单克隆抗体及其应用，所提供的单克隆抗体可特异性识别人b7-h3分子，动物实验证实该单克隆抗体偶联碘131能有效抑制小鼠肿瘤的生长，从而为肿瘤细胞免疫治疗提供新治疗性抗体候选分子。
5.本发明所提供的特异性靶向人b7-h3的人源化单克隆抗体hu4g4，其包含有重链和轻链，其中重链cdr区包含有cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其序列信息如下：
6.cdr-h1：dyyin(seq id no：1)、
7.cdr-h2：firnrvngytteytasvkg(seq id no：2)、
8.cdr-h3：drgpgkhaidy(seq id no：3)；
9.轻链cdr区包含有cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其序列信息如下：
10.cdr-l1：raaqdleyyld(seq id no：4)、
11.cdr-l2：hsarmds(seq id no：5)、
12.cdr-l3：qngyilpyt(seq id no：6)；
13.更进一步的，所述的人源化单克隆抗体hu4g4，其重链可变区(vh)的氨基酸序列如下：
14.evqleesggglvrpggslrlscavsgftlsdyyinwvrqppgkalewlgfirnrvngytteytasvkgrftisrdnsqsilylqmntlraedsatyycardrgpgkhaidywgqgtsvtvss(seq id no：7)；
15.所述的人源化单克隆抗体hu4g4，其轻链可变区(vl)氨基酸序列如下：
16.diqmtqspsslsaslgdrvtiscraaqdleyyldwyqqktdttvklliyhsarmdsgvparfsgsgsg
rdysltisnlepedvgtyfcqngyilpytfgtgtkleik(seq id no：8)；
17.本发明所提供的单克隆抗体hu4g4可用于制备检测b7-h3蛋白的制品；
18.另一个方面，本发明所提供的单克隆抗体hu4g4还可用于制备用于阻断b7-h3蛋白的制品；
19.本发明还提供了一种药物组合物，其中包含有本发明的单克隆抗体hu4g4。
20.进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
21.本发明所提供的药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
22.进一步，所述肿瘤选自急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍金性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、结肠直肠癌、肾肿瘤、膀胱癌、胃肠道癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、神经内分泌癌、头颈癌、鼻咽癌、睾丸癌、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、皮肤纤维肉瘤突出症、梅克尔细胞癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、间皮瘤或骨髓发育不良综合征。
23.本发明提供一种抗人b7-h3分子的人源化单克隆抗体，所述抗人b7-h3单克隆抗体为hu4g4，包括重链和轻链，所述hu4g4的重链可变区(vh)的氨基酸序列与seq id no.1相同；hu4g4的轻链可变区(vl)的氨基酸序列与seq id no.2相同；该人源化抗体在小鼠荷瘤模型中能特异识别肿瘤细胞，偶联碘131能有效抑制胶质瘤荷瘤小鼠的肿瘤生长，为靶向b7-h3分子的肿瘤免疫治疗提供治疗性抗体候选分子。
附图说明
24.图1：抗人b7-h3单抗hu4g4蛋白电泳染色鉴定图，其中重链：h chain；轻链：l chain；
25.图2：人源化b7-h3单抗hu4g4竞争结合m4g4单抗的抗原位点图，其中黑线为梯度加入母本抗体m4g4阻断后，hu4g4与抗原分子的结合；红线为梯度加入母本抗体m4g4阻断后，对照抗人b7-h3抗体与抗原分子的结合。
26.图3：人源化b7-h3单抗hu4g4竞争结合m4g4单抗细胞表面的抗原位点图，其中虚线峰为鼠源母本抗体m4g4与b7-h3转基因细胞的结合；实线峰为加入10ug/ml人源化抗体hu4g4阻断后，m4g4与b7-h3转基因细胞的结合；灰色峰为对照。
27.图4：人源化b7-h3单抗hu4g4的亲和力检测图，其中ka结合常数，kd解离常数，kd亲和常数。
28.图5.hu4g4结合u87细胞表面b7-h3分子
29.图6.抗人b7-h3抗体hu4g4利用89zr-免疫pet 72h扫描mip图
30.图7治疗性核素131i标记b7-h3抗体明显抑制脑胶质瘤肿瘤的生长
具体实施方式
31.本发明具体实施例中所使用的主要试剂有：人源抗体b7-h3(hu4g4)、鼠源抗体b7-h3(m4g4)；pbs、1640培养基、胎牛血清、pe-羊抗人fc二抗、pe-鼠抗人fc二抗、b7-h3抗原蛋白、89zr和131i均为市售产品，此外下述具体实施例中所采用的未特别提及的试剂、操作工具和仪器等均为本领域常规试剂、操作工具和仪器，不再赘述。
32.本发明方法的基本流程如下：
33.1.流式细胞术鉴定抗人b7-h3单抗
34.选用l929/b7-h3细胞株作为检测细胞，收集hu4g4纯化抗体作为一抗，以pe标记的羊抗人fc段抗体作为二抗，利用流式细胞仪对其进行检测。
35.2.protein g亲和层析柱分离纯化hu4g4和lowy法定量
36.采用cho真核细胞表达hu4g4单抗，起始细胞浓度调整至2
×
106/ml并培养7d后收集表达上清，经超滤浓缩系统浓缩，按phamacia公司提供的方案，采用protein g亲和层析柱分离纯化后经lowy法定量，抗体过滤除菌后分装于-20℃保存。
37.3.蛋白电泳对hu4g4重链和轻链的鉴定和纯度的初步检测
38.纯化后的抗体经12％的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析，考马斯亮蓝染色过夜，脱色液脱色后，成像摄片，设标准蛋白为分子量对照，比对分子量大小。
39.4.hu4g4抗原结合表位的鉴定
40.将l929/4g4细胞株和已制备的抗人b7-h3人源抗体(hu4g4)于4℃反应40min，充分洗涤后，再和母本鼠源抗体m4g4于4℃反应40min，充分洗涤后，加入pe-羊抗小鼠二抗，流式细胞术检测。
41.将b7-h3蛋白包板，加入不同浓度的母本鼠源抗体m4g4 4℃反应60min，再加入抗人b7-h3人源抗体(hu4g4)反应，再加入hrp-羊抗人二抗，elisa检测。
42.5.hu4g4识别u87细胞表面的b7-h3分子
43.取对数生长期的高表达b7-h3的人脑胶质瘤u87细胞与hu4g4单抗及相应的同型对照igg在4℃孵育40min，洗涤后再加入二抗4℃孵育20min，pbs缓冲液洗涤2次后，重悬细胞并经流式细胞仪检测细胞表面b7-h3的表达。
44.6.hu4g4体内靶向识别肿瘤细胞
45.构建胶质瘤荷瘤小鼠模型。抗体用89zr进行标记，通过尾静脉注射到小鼠体内，24h、72h、168h动态pet显像，观察核素在动物脏器、骨骼和肿瘤部位的聚集情况。
46.7.分析抗人b7-h3单抗偶联碘131对肿瘤生长的影响
47.构建胶质瘤荷瘤小鼠模型。抗体用治疗性核素碘131标记，通过尾静脉注射到小鼠体内，监测肿瘤大小和生长曲线。
48.下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。
49.实施例1：酶联免疫吸附测定法(elisa)流式细胞术鉴定人源化b7-h3单抗与母本鼠源抗体竞争识别抗原表位
50.纯化后的hu4g4 sds-page电泳显示人b7-h3抗体重链和轻链位置和大小如图1所示。
51.测序确定人b7-h3抗体重链cdr区包含有cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其序列信息如下：
52.cdr-h1：dyyin(seq id no：1)、
53.cdr-h2：firnrvngytteytasvkg(seq id no：2)、
54.cdr-h3：drgpgkhaidy(seq id no：3)；
55.轻链cdr区包含有cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其序列信息如下：
56.cdr-l1：raaqdleyyld(seq id no：4)、
57.cdr-l2：hsarmds(seq id no：5)、
58.cdr-l3：qngyilpyt(seq id no：6)；
59.其重链可变区(vh)的氨基酸序列如下：
60.evqleesggglvrpggslrlscavsgftlsdyyinwvrqppgkalewlgfirnrvngytteytasvkgrftisrdnsqsilylqmntlraedsatyycardrgpgkhaidywgqgtsvtvss(seq id no：7)；
61.所述的人源化单克隆抗体hu4g4，其轻链可变区(vl)的氨基酸序列如下：
62.diqmtqspsslsaslgdrvtiscraaqdleyyldwyqqktdttvklliyhsarmdsgvparfsgsgsgrdysltisnlepedvgtyfcqngyilpytfgtgtkleik(seq id no：8)；
63.为了鉴定人源b7-h3单抗hu4g4与母本鼠源b7-h3单抗m4g4识别抗原位点的差异，用10μg/ml的b7-h3蛋白铺板，分别加入0.625、1.25、2.5、5、10、20和40μg/ml的鼠源母本抗体反应1h，再加入人源化抗体hu4g4抗体进行elisa检测，结果显示，0.625μg/ml的m4g4就可以阻断hu4g4与抗原分子的结合，提示，hu4g4和m4g4识别同一个位点(图2)。
64.收集l929/b7-h3转基因细胞，pbs洗涤后重悬调整细胞浓度为5
×
105/管，采用免疫荧光标记竞争实验，加入10ug/ml的人源b7-h3单抗hu4g4，4℃作用40min并用pbs洗涤两遍后，加入鼠源b7-h3单抗m4g4(1.0μg/管)4℃作用40min，pbs洗涤两遍，pe标记羊抗鼠igg抗体作为二抗4℃反应20min，pbs洗涤两遍后流式细胞仪分析。
65.结果显示，人源b7-h3单抗hu4g4可以有效地阻断鼠源b7-h3 m4g4与转基因细胞上cd40分子的特异性结合，提示，hu4g4和m4g4识别同一个位点(图3)。
66.实施例2：人源化b7-h3单抗与抗原结合能力及亲和力检测
67.将b7-h3抗原蛋白配成100nm，50nm，25nm，12.5nm，6.25nm，3.13nm和1.56nm梯度稀释的7个浓度，96孔板上样，选择人protein g探针，固定相为抗原，流动相为人源b7-h3单抗hu4g4，根据实验方案将结合时间设定为180s，解离时间为300s。
68.检测人源单抗的结合及解离常数，计算亲和力，结果表明hu4g4亲和常数(kd)为2.625e-10(图4)。
69.实施例3：抗b7-h3单抗hu4g4识别b7-h3分子
70.取对数生长期的u87细胞和与hu4g4及相应的同型对照igg在4℃孵育40min，洗涤后再加入相应的二抗4℃孵育20min，用pbs缓冲液洗涤2次后，重悬细胞并经流式细胞仪检测细胞表面b7-h3的表达。流式分析结果显示本发明筛选的hu4g4能识别、结合u87细胞表面b7-h3分子(图5)。进一步鉴定了hu4g4在胶质瘤荷瘤小鼠模型体内对肿瘤细胞的结合，发现hu4g4抗体在肿瘤部位有特异性浓聚(图6)。
71.实施例4：抗人b7-h3人源化抗体偶联碘131抑制肿瘤生长
72.利用治疗性核素131i对hu4g4抗体进行核素标记，并在脑胶质瘤模型中研究其抗肿瘤药效。研究结果显示，给予131i-hu4g4治疗7天后(放射性剂量400-500μci/只)，瘤体积明显低于pbs和131i-igg组对照组(p《0.05)；131i-hu4g4抑瘤效果明显，d23天抑瘤率均＞80％，d20天相对肿瘤增殖率均《30％，抑瘤效果明显优于对照组131i-igg(图7)。显示131i-hu4g4具备治疗脑胶质瘤的潜能。