代谢工程方法、产羊毛甾醇工程菌及其构建方法、应用与流程

1.本技术属于微生物技术领域，尤其涉及一种代谢工程方法、产羊毛甾醇工程菌及其构建方法、应用。


背景技术：

2.目前，构建微生物细胞工厂成为生产各类高价值天然产物的有效手段，随着代谢工程方法的发展与完善，各类天然产物和化工原料的异源微生物生产不断取得重大进展。例如，通过将β-胡萝卜素合成的相关基因导入酿酒酵母优化菌株中，通过解除底物抑制效应和平衡碳代谢流的平衡，可使β-胡萝卜素的产率达到39.5g/l；将灯盏花乙素的生物合成途径在酿酒酵母中重建，并进行相关代谢途径的优化，灯盏乙素的产量达到了108mg/l，初步具备工业化生产的潜能。其他高价值天然产物，如紫杉醇二烯、α-香树脂醇、苯乙醇等，也已通过代谢工程的方法获得了高产工程菌株，为它们的规模制备和产业化提供了物质基础。
3.酿酒酵母中含有丰富的三萜类化合物，包括角鲨烯(squalene)、羊毛甾醇(lanosterol)和麦角固醇(ergosterol)等，具有重要的生物活性和经济价值。例如，羊毛甾醇，是一种甾醇类和四环三萜类化合物。羊毛甾醇是麦角甾醇及多种具有抗癌、抗氧化、免疫调节等生物活性的三萜类化合物的重要前体，其类似物已经被证实是一种安全有效的降血胆固醇制剂。研究表明它具有缓解和抑制白内障进展的作用，另外它还被证明对结肠癌有一定的化学预防作用。除了这些内源性的三萜类化合物，酿酒酵母也是其他高价值三萜类天然产物异源生产的优势菌株，虽然该类化合物在酵母中的异源生产已经达到工业化制备标准，但这些工程菌株的构建过程中较多地使用了已有的经典代谢工程优化策略，如优化代谢途径中的关键限速酶和代谢途径
″
区室化
″
处理等，使得酵母细胞工厂的生产能力仍具有一定的提升空间。因此，探索和开发新的代谢工程策略，进一步提升微生物细胞工厂的三萜生产潜能，显得尤为重要。


技术实现要素：

4.本技术的目的在于提供一种基于m6a甲基转移酶ime4的代谢工程方法，旨在解决现有的代谢工程策略针对微生物细胞工厂的三萜生产潜能有待提升的问题。
5.本技术是这样实现的，一种基于m6a甲基转移酶ime4的代谢工程方法，包括：
6.将酵母内源性ime4基因的启动子替换为组成型启动子pgk1p。
7.本技术的另一目的在于一种上述的基于m6a甲基转移酶ime4的代谢工程方法在构建酿酒酵母工程菌中的应用。
8.本技术的另一目的在于一种产羊毛甾醇工程菌，所述产羊毛甾醇工程菌以酿酒酵母为出发菌株，过表达ime4、thmgr、upc2-1和erg9基因；其中，
9.替换酵母内源性ime4基因的启动子为组成型启动子pgk1p；
10.thmg1和upc2-1基因整合到酿酒酵母染色体ndt80位点；
11.替换酵母内源性erg9基因的启动子为组成型启动子tef1p；
12.所述upc2-1基因为upc2基因第888位的甘氨酸突变为天冬氨酸得到的upc2-1基因。
13.本技术的另一目的在于一种产羊毛甾醇工程菌的构建方法，包括如下步骤：
14.将启动子pgk1p和筛选标记met重叠，构建表达模块met-pgk1p；
15.将基因thmgr、启动子tdh2p和终止子adh1t重叠，构建基因表达模块tdh2p-thmer-adh1t；
16.将基因upc2-1、启动子tpi1p和终止子cyc1t重叠，构建基因表达模块tpi1p-upc2-1-cyc1t；所述upc2-1基因为upc2基因第888位的甘氨酸突变为天冬氨酸得到的upc2-1基因；
17.将所述基因表达模块tdh2p-thmer-adh1t、基因表达模块tpi1p-upc2-1-cyc1t和ura筛选标记重叠，构建基因表达模块ura-tdh2p-thmer-adh1t-tpi1p-upc2-1-cyc1t；
18.将启动子tef1p和筛选标记leu重叠，构建表达模块leu-tef1p；
19.将所述表达模块met-pgk1p转化酵母菌株，利用酵母缺陷型培养基筛选培养sd-met，得到菌株st01；
20.将所述基因表达模块ura-tdh2p-thmer-adh1t-tpi1p-upc2-1-cyc1t转化所述菌株st01，利用酵母缺陷型培养基sd-met-ura筛选培养，得到菌株st02；
21.将所述表达模块leu-tef1p转化所述菌株st02，利用酵母缺陷型培养基sd-met-ura-leu筛选培养，即得产羊毛甾醇工程菌。
22.本技术实施例的另一目的在于一种上述的产羊毛甾醇工程菌或者上述的产羊毛甾醇工程菌的构建方法所构建得到的产羊毛甾醇工程菌在生产羊毛甾醇中的应用。
23.本技术提供的基于酿酒酵母m6a甲基转移酶ime4的代谢工程方法，可有效促进单倍体酿酒酵母工程菌羊毛甾醇产量。
附图说明
24.图1为本技术实施例所构建的酿酒酵母工程菌株中羊毛甾醇的gc-ms检测结果；
25.图2为本技术实施例所构建的酿酒酵母工程菌株中羊毛甾醇的质谱图；
26.图3为本技术实施例所构建的酿酒酵母工程菌株中羊毛甾醇的产量柱状图。
具体实施方式
27.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
28.本技术提供了一种基于m6a甲基转移酶ime4的代谢工程方法，包括：
29.将酵母内源性ime4基因的启动子替换为组成型启动子pgk1p。
30.本技术提供了上述的基于m6a甲基转移酶ime4的代谢工程方法在构建酿酒酵母工程菌中的应用。
31.具体地，本技术提供了一种产羊毛甾醇工程菌，所述产羊毛甾醇工程菌以酿酒酵母为出发菌株，过表达ime4、thmgr、upc2-1和erg9基因；其中，
32.替换酵母内源性ime4基因的启动子为组成型启动子pgk1p；
33.thmg1和upc2-1基因整合到酿酒酵母染色体ndt80位点；
34.替换酵母内源性erg9基因的启动子为组成型启动子tef1p；
35.所述的thmgr基因为去掉hmgr基因编码蛋白的跨膜区得到的thmgr基因；
36.所述的酿酒酵母优选菌株为by4741。
37.所述的thmgr和upc2基因可从酿酒酵母by4741基因组克隆得到，其核苷酸序列分别为seq id no.1～2所示。
38.所述的upc2-1基因为upc2基因第888位的甘氨酸突变为天冬氨酸得到的upc2-1基因，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
39.所述的pgk1p和tef1p两个强启动子可从酿酒酵母by4741基因组克隆得到，其核苷酸序列分别为seq id no.4～5所示。
40.所述upc2-1基因为upc2基因第888位的甘氨酸突变为天冬氨酸得到的upc2-1基因。
41.本技术提供了上述的一种产羊毛甾醇工程菌的构建方法，包括如下步骤：
42.(1)利用重叠pcr分别构建以下模块：
43.(a)将启动子pgk1p和met筛选标记重叠，构建表达模块met-pgk1p，命名为模块i；
44.(b)将基因thmgr、启动子tdh2p和终止子adh1t重叠，构建基因表达模块tdh2p-thmer-adh1t，命名为模块ii；
45.(c)将基因upc2-1、启动子tpi1p和终止子cyc1t重叠，构建基因表达模块tpi1p-upc2-1-cyc1t，命名为模块iii；
46.(d)将模块ii、模块iii和ura筛选标记重叠，构建基因表达模块ura-tdh2p-thmer-adh1t-tpi1p-upc2-1-cyc1t，命名为模块iv；
47.(e)将启动子tef1p和leu筛选标记重叠，构建表达模块leu-tef1p，命名为模块v；
48.(2)构建菌株st01
49.将模块i转化菌株by4741，利用酵母缺陷型培养基sd-met筛选培养，得到菌株st01。
50.(3)构建菌株st02
51.将模块iv转化菌株st01，利用酵母缺陷型培养基sd-met-ura筛选培养，得到菌株st02。
52.(4)构建菌株st03
53.将模块v转化菌株st02，利用酵母缺陷型培养基sd-met-ura-leu筛选培养，得到菌株st03，即为高产羊毛甾醇的酿酒酵母菌株。
54.步骤(1)中所述的thmgr、upc2基因可从酿酒酵母by4741基因组克隆得到，其核苷酸序列分别如seq id no.1～2所示。
55.步骤(1)中所述的upc2-1基因为upc2基因第888位的甘氨酸突变为天冬氨酸得到的upc2-1基因，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
56.步骤(1)所述的pgk1p、tef1p、tdh2p和tpi1p为启动子序列，可从酿酒酵母by4741基因组克隆得到，其核苷酸序列分别为seq id no.4～7所示。
57.步骤(1)中所述的adh1p和cyc1p为终止子序列，可从酿酒酵母by4741基因组克隆
得到，其核苷酸序列分别为seq id no.8～9所示。
58.步骤(1)中所述的筛选标记met的核苷酸序列如seq id no.10所示。
59.步骤(1)所述的筛选标记ura的核苷酸序列如seq id no.11所示。
60.步骤(1)所述的筛选标记leu的核苷酸序列如seq id no.12所示。
61.步骤(2)～(4)中所述的酵母转化为利用酵母转化试剂盒进行转化；优选为用sk2400经典酵母转化试剂盒(北京酷来搏科技有限公司)进行转化。
62.步骤(4)所述的产物为羊毛甾醇(c
30h50
o)，其结构式如下所示：
[0063][0064]
本技术还提供了一种上述的产羊毛甾醇工程菌或者上述的产羊毛甾醇工程菌的构建方法所构建得到的产羊毛甾醇工程菌在生产羊毛甾醇中的应用。
[0065]
本技术还提供了一种提高酵母羊毛甾醇的方法，为将所述的高产目的产物的酵母工程菌st03经活化后接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到羊毛甾醇；具体包括如下步骤：
[0066]
将所述的高产羊毛甾醇的酿酒酵母工程菌st03经活化后接种到发酵培养基中进行摇瓶发酵培养，得到羊毛甾醇。
[0067]
所述的摇瓶发酵通过如下步骤实现：为将所述的高产羊毛甾醇的酿酒酵母工程菌st03接种到sd met ura leu固体培养基上，30℃培养48h后挑取单克隆接种至5ml的sd met ura leu液体培养基中，在30℃条件下220rpm震荡培养至od值2～3，然后取1ml菌液接种到50ml ypd液体培养基的摇瓶中，在30℃条件下220rpm震荡发酵168h。
[0068]
下面结合实施例对本技术作进一步详细的描述，但本技术的实施方式不限于此。除非特别说明，本技术采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本技术所用试剂和原材料均可通过市售获得。
[0069]
本技术实施例中所涉及的培养基的配方如下：
[0070]
(1)ypd培养基：蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，葡萄糖20g/l(固体ypd培养基在配制时添加20g/l的琼脂粉)。
[0071]
(2)sd-met培养基：ynb培养基6.73g/l，met(甲硫氨酸)缺陷氨基酸(100x)10ml/l，葡萄糖20g/l(固体培养基配制时添加20g/l的琼脂粉)。
[0072]
(3)sd-met-ura培养基：ynb培养基6.73g/l，met(甲硫氨酸)和ura(尿嘧啶)缺陷氨基酸(100x)10ml/l，葡萄糖20g/l(固体培养基配制时添加20g/l的琼脂粉)。
[0073]
(4)sd-met-ura-leu培养基：ynb培养基6.73g/l，met(甲硫氨酸)、ura(尿嘧啶)和leu(亮氨酸)缺陷氨基酸(100x)10ml/l，葡萄糖20g/l(固体培养基配制时添加20g/l的琼脂粉)。
[0074]
his/met/leu/ura四缺氨基酸母液(100x)：精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，赖氨酸0.18g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，用蒸馏水定容到57ml，根据需要可不加任意一种氨基酸配置成缺陷氨基酸母
液(100x)。上述原料均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0075]
甲硫氨酸(met)0.12g，尿嘧啶(ura)0.12g，亮氨酸(leu)0.36g，组氨酸(his)0.12g
[0076]
实施例1酵母内源性基因和启动子的克隆
[0077]
1、酵母基因组的提取
[0078]
(1)将单克隆酿酒酵母by4741挑取到5ml ypd液体培养基中，30℃条件下220rpm培养过夜，然后3500rpm离心3min进行集菌。
[0079]
(2)将收集的菌体利用酵母基因组dna快速抽提试剂盒(b518227，生工生物工程股份有限公司)进行基因组dna的提取，具体操作过程见说明书。
[0080]
2、酵母内源性基因和表达元件的克隆
[0081]
(1)以上述获得的酵母基因组为模板，分别克隆以下两个基因、四个组成型启动子和两个终止子(扩增引物见表1)：
[0082]
基因thmg1(thmg1-f、thmg1-r)、基因upc2(upc2-f、upc2-r)、启动子pgk1p(引物pgk1p-f、pgk1p-r)、启动子tef1p(引物tef1p-f、tef1p-r)、启动子adh2p(引物adh2p-f、adh2p-r)、tpi1p启动子(引物tpi1p-f、tpi1p-r)、终止子cyc1t(引物cyc1t-f、cyc1t-r)、终止子adh1t(引物adh1t-f、adh1t-r)。
[0083]
pcr反应体系：primestar max premix(r045q，宝生物)10μl，正反向引物各0.5μl，ddh2o 8μl，模板1μl，总反应体系20μl。
[0084]
pcr扩增反应条件为：98℃ 1min；98℃ 15s，50-60℃ 15s，72℃ 30s-2min，32循环；72℃ 7min。
[0085]
pcr反应结束后，1％琼脂糖凝胶电泳检测，条带大小无误后，切下目的条带，使用dna凝胶回收试剂盒(tsp601，北京擎科生物科技有限公司)进行胶回收，具体操作过程见说明书。
[0086]
(2)dna片段连接亚克隆载体plb载体
[0087]
dna片段连接亚克隆载体plb(vt205，天根生化科技有限公司)，然后转化感受态大肠杆菌dh5α，具体操作见产品说明书。
[0088]
(3)37℃过夜培养后，挑选单菌落做菌落pcr。
[0089]
pcr反应体系：2x m5 hiper taq hifi pcr mix(mf002，聚合美)5μl，正反向引物(表1)各0.3μl，ddh2o 4.4μl。
[0090]
pcr扩增条件为：95℃ 3min；94℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 1-3min，30个循环；72℃ 7min。
[0091]
pcr反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测，挑取阳性克隆菌株测序。
[0092]
3、upc2的定点突变
[0093]
upc2是甲羟戊酸途径的正向调控因子，将其的第888位的甘氨酸突变为天冬氨酸，能进一步提高其调控作用。利用pcr的方法，以plb-upc2质粒为模板，进行upc2的定点突变(引物序列见表1)。
[0094]
(1)pcr反应体系：primestar max premix(r045q，宝生物)10μl，正反向引物各0.5μl，ddh2o 8μl，模板1μl，总反应体系20μl。
[0095]
(2)pcr扩增反应条件为：98℃ 1min；98℃ 15s，50-60℃ 15s，72℃ 30s-2min，32循环；72℃ 7min。
[0096]
(3)取以上pcr产物10μl，加入0.5μl限制性内切酶dpnι，37℃反应1h。
[0097]
(4)将以上反应体系转化感受态大肠杆菌dh5α，涂布平板，37℃过夜培养。
[0098]
(5)挑选单克隆，进行菌落pcr鉴定，将阳性菌落测序。
[0099]
表1实施例中克隆各基因和表达元件所用的引物序列
[0100][0101][0102]
实施例2各表达模块的构建
[0103]
利用重叠pcr构建基因表达模块i～v
[0104]
(1)第一轮重叠pcr反应体系：pcr反应体系：primestar max premix(r045q，宝生物)10μl，正反向引物各0.5μl，ddh2o 8μl，模板1μl，总反应体系20μl；其中引物序列见表2。
[0105]
第一轮重叠pcr反应条件：
[0106]
pcr扩增反应条件为：98℃ 1min；98℃ 15s，50-60℃ 15s，72℃ 1～3min，15个循环；72℃ 7min。
[0107]
(2)取1μl第一轮重叠pcr反应的产物作为第二轮重叠pcr反应的模板，反应体系：pcr反应体系：primestar max premix(r045q，宝生物)10μl，正反向引物各0.5μl，ddh2o 8μl，模板1μl，总反应体系20μl；其中引物序列见表2。
[0108]
第二轮重叠pcr反应条件：98℃ 1min；95℃ 30s，50～60℃ 30s，72℃ 1～4min，32个循环；72℃ 5min。
[0109]
(4)将pcr产物使用dna凝胶回收试剂盒(tsp601，北京擎科生物科技有限公司)进行胶回收，具体操作过程见说明书，并连接plb亚克隆载体(vt205，天根生化科技有限公司)测序。
[0110]
按上述步骤共构建以下5个模块：
[0111]
(a)将met筛选标记和pgk1p，构建基因表达模块met-pgk1p，命名为模块i；其中，第一轮pcr克隆met筛选标记引物为i-f1、i-r1，克隆pgk1p引物为i-f2、i-r2；第二轮pcr引物为i-f1、i-r2；引物序列见表2。
[0112]
(b)将tdh2p、thmg1和adh1t连接，构建基因表达模块tdh2p-thmg1-adh1t，命名为模块ii。其中，第一轮pcr克隆pgk1p的引物为ii-f1和ii-r1，克隆thmgr的引物为ii-f2和ii-r2，克隆adh1t的引物为ii-f3和ii-r3；第二轮的pcr引物为ii-f1和ii-r3；引物序列见表2。
[0113]
(c)将tpi1p、upc2-1和cyc1t连接，构建基因表达模块tpi1p-upc2-1-cyc1t，命名为模块iii。其中，第一轮pcr克隆tpi1p的引物为iii-f1和iii-r1，克隆upc2-1的引物为iii-f2和iii-r2，克隆cyc1t的引物为iii-f3和iii-r3；第二轮的pcr引物为iii-f1和iii-r3；引物序列见表2。
[0114]
(d)将ura筛选标记、模块ii和模块iii连接，构建基因表达模块ura-tdh2p-thmer-adh1t-tpi1p-upc2-1-cyc1t，命名为模块iv。其中，第一轮pcr克隆ura筛选标记的引物为iv-f1和iv-r1，克隆模块ii的引物为iv-f2和iv-r2，克隆模块iii的引物为iv-f3和iv-r3；第二轮的pcr引物为iv-f1和iv-r3；引物序列见表2。
[0115]
(e)将leu筛选标记和tef1p，构建基因表达模块leu-tef1p，命名为模块v；其中，第一轮pcr克隆leu筛选标记引物为v-f1、v-r1，克隆tef1p引物为v-f2、v-r2；第二轮pcr引物为v-f1、v-r2；引物序列见表2。
[0116]
表2
[0117]
[0118][0119]
实施例3构建工程酵母菌
[0120]
1、酿酒酵母菌株st01的构建
[0121]
(1)用引物i-f1和i-r2将模块i从plb-met-pgk1p(即上述模块i连接plb载体)上扩增下来，pcr扩增体系：2x m5 hiper taq hifi pcr mix(mf002，聚合美)25μl，正反向引物(表2)各0.5μl，plb-met-pgk1p载体1μl，ddh2o 23μl。经琼脂糖凝胶电泳检测大小无误后，回收目的pcr产物。
[0122]
(2)将回收的目的pcr片段转化酿酒酵母菌株by4741，使模块i替换酵母by4741染色体中ime4基因的启动子序列，用甲硫氨酸缺陷型固体培养基(sd-met培养基)平板进行筛选，经菌落pcr验证，得到酿酒酵母工程菌株st01。
[0123]
2、st02菌株的构建
[0124]
(1)将模块iv从plb-ura-tdh2p-thmer-tpi1p-upc2-1-cyc1t(即上述模块iv连接plb载体获得)上用引物iv-f1和iv-r3扩增下来，pcr扩增体系：2x m5 hiper taq hifi pcr mix(mf002，聚合美)25μl，正反向引物(表2)各0.5μl，plb-ura-tdh2p-thmer-tpi1p-upc2-1-cyc1t载体1μl，ddh2o 23μl。经琼脂糖凝胶电泳检测大小无误后，回收目的pcr产物。
[0125]
(2)将回收的目的pcr片段转化酿酒酵母菌株st01，使模块iv替换酵母by4741染色体中的ndt80位点，用甲硫氨酸和尿嘧啶缺陷型固体培养基(sd-met-ura培养基)平板进行筛选，经菌落pcr验证，得到酿酒酵母工程菌株st02。
[0126]
3、高产羊毛甾醇酿酒酵母菌株st03的构建
[0127]
(1)将模块v从plb-leu-tef1p(即上述模块v连接plb载体获得)上用引物v-f1和v-r2扩增下来，pcr扩增体系：2x m5 hiper taq hifi pcr mix(mf002，聚合美)25μl，正反向引物(表2)各0.5μl，plb-leu-tef1p载体1μl，ddh2o 23μl。经琼脂糖凝胶电泳检测大小无误后，回收目的pcr产物。
[0128]
(2)将回收的目的pcr片段转化酿酒酵母菌株st02，使模块iv替换酵母by4741染色体中的ndt80位点，用甲硫氨酸、尿嘧啶和亮氨酸缺陷型固体培养基(sd-met-ura-leu培养基)平板进行筛选，经菌落pcr验证，得到酿酒酵母工程菌株st03。
[0129]
实施例4菌株st03发酵合成羊毛甾醇
[0130]
1、菌株st03发酵合成羊毛甾醇
[0131]
(1)挑取菌株st03的单菌落到5ml sd-ura-met-leu培养基中，30℃条件下220rpm震荡培养od值至2～3。
[0132]
(2)取1ml培养液接种到含有50ml的培养基sd-ura-met-leu的250ml摇瓶中，30℃条件下220rpm震荡发酵120h。
[0133]
2、菌株st03发酵产物的检测
[0134]
(1)取st03的发酵液在4℃条件下3000rpm离心，分别获得上清和菌体。
[0135]
(2)向菌体加入10ml的20％koh碱裂解液，95℃加热15min进行裂解。
[0136]
(3)裂解结束后，将裂解的菌体混合液和(1)中所得的上清混合，加入250ml锥形瓶中。
[0137]
(4)向上述锥形瓶中加入等体积的乙酸乙酯，超声萃取20min，静置72h。
[0138]
(5)将上述静置分层的有机层旋蒸，然后加入干净的液相小瓶中，用氮吹仪吹干，加入100μl硅烷化试剂mstfa，80℃条件下温浴30min。
[0139]
(6)利用气质联用仪(优选为安捷伦7890b-5977b)进行gc-ms检测羊毛甾醇产量。检测方法：hp-5ms毛细管柱；进样量1μl，不分流；进样口温度250℃，起始温度50℃保持3min，而后以20℃/min的速率升到70℃保持1min，接着15℃/min的速率升到300℃保持3min；electron ionization离子源，能量强度70ev；ms溶剂延迟设为12min，开启电压倍增模式，增益因子设为1。检测结果见图1-3所示。
[0140]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。