一种单细胞悬液制备试剂盒的制作方法

技术特征：
1.一种单细胞悬液制备试剂盒，其特征在于，包括混合酶i、混合酶ii和混合酶iii，混合酶i由0.1％胶原酶、0.1％胶原酶i、0.01％透明质酸酶以及0.2％bsa溶于hbss液中制成，混合酶ii由0.25％胰蛋白酶溶于hbss液中制成，混合酶iii由0.1％中性蛋白酶、0.02％dnasei酶以及0.2％bsa溶于hbss液中制成。2.根据权利要求1所述的一种单细胞悬液制备试剂盒，其特征在于，所述hbss选用不含ca与mg离子型。3.根据权利要求2所述的一种单细胞悬液制备试剂盒，其特征在于，该试剂盒检测步骤如下；准备预冷的dpbs、hbss、混合酶i、混合酶ii与混合酶iii；s1：将手术或者穿刺获取的新鲜乳腺癌组织置于10cm圆皿中，将组织块切成约50mm3小碎块后剔除脂肪组织和血块，再将肿瘤组织碎块使用干净预冷的dpbs清洗2次，移入无核酶圆底的4ml的ep管中，使用剪刀将组织剪碎至<1mm3的糜状；s2：将预热的混合酶i加入剪碎的组织中，起始组织块直径在5mm内加入1ml混合酶i，组织体积较大时，增加混合酶i的量，于37℃消化30min，每隔10min使用巴氏管小心吹打10次，将消化完成的组织加入2
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4ml预冷的dpbs终止消化，取量400g，4℃环境离心5min，将离心过后的上清转移至新的ep管，置于冰上待用；s3：将离心得到的沉淀物加入1ml预热的混合酶ii，于37℃消化2min后立即加入步骤2中离心的上清液，取量500g，4℃离心7min，弃上清液；s4：将s3中得到的沉淀物加入1ml的混合酶iii，于37℃消化5min后，加入预冷的dpbs终止消化，使用70μm过滤筛过滤，再使用40μm过滤筛过滤，取量500g，4℃离心5min，弃上清液；s5：将s4中离心得到的细胞沉淀使用2
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3ml红细胞裂解液裂解3min，最后加入3倍红细胞裂解液体积的dpbs终止裂解，取量400g，4℃离心5min，弃上清液；s6：将s5中得到的细胞沉淀加入8ml预冷的dpbs清洗1次，取量350g，4℃离心5min，弃上清液；s7：加入适量的dpbs重悬，测量细胞数目和活率，活率<80％时，则进行去除死细胞步骤，去除死细胞过程按照美天旎清除死细胞磁珠分选试剂盒步骤执行。4.根据权利要求3所述的一种单细胞悬液制备试剂盒，其特征在于，所述dpbs中含有0.04％的bsa与0.1mm的edta。5.根据权利要求3所述的一种单细胞悬液制备试剂盒，其特征在于，所述s1中乳腺癌组织取出置于圆皿中同时加入预冷的dpbs避免组织表面干燥。6.根据权利要求5所述的一种单细胞悬液制备试剂盒，其特征在于，所述s1中，除使用剪刀剪碎组织过程外，其他步骤均置于冰上操作。7.根据权利要求3所述的一种单细胞悬液制备试剂盒，其特征在于，所述s2中组织消化时，若在30min内发现无明显组织块，即可终止消化，若仍有较大组织块，则延长消化时间，消化的时间控制在40min内。

技术总结
本发明公开了一种单细胞悬液制备试剂盒，包括混合酶I、混合酶II和混合酶III，混合酶I由0.1％胶原酶、0.1％胶原酶I、0.01％透明质酸酶以及0.2％BSA溶于HBSS液中制成，混合酶II由0.25％胰蛋白酶溶于HBSS液中制成，混合酶III由0.1％中性蛋白酶、0.02％DNaseI酶以及0.2％BSA溶于HBSS液中制成。本发明使用“三步酶解法”解离，对于机械韧性程度不同的乳腺癌组织均适用，这也是目前市场的解离试剂盒尚未达到的一项技术，使用该方法可明显提高细胞活率，降低细胞成团率，减少杂质的产生。减少杂质的产生。减少杂质的产生。


技术研发人员：靳焕 邱霓 李洪胜
受保护的技术使用者：广州医科大学附属肿瘤医院
技术研发日：2021.04.23
技术公布日：2021/10/19