一种利用发酵盐厌氧菌改善鱼露发酵品质的方法与流程

1.本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种利用发酵盐厌氧菌改善鱼露发酵品质的方法。


背景技术：

2.鱼露也称鱼酱油，是一种以低值鱼类或水产品加工副产物为原料，经过天然发酵制得的风味独特的水产调味品。鱼露色泽呈琥珀色，味道鲜美，富含牛磺酸、人体必需氨基酸、有机酸和微量元素，是东南亚地区和我国南方沿海一带最受欢迎的调味品之一。传统的鱼露发酵工艺通常采用高盐盐渍(加盐量一般20％
‑
30％)的自然发酵方式，在微生物和鱼体内源酶的协同作用下，对鱼体中的蛋白质、脂质等营养成分进行发酵分解，再经陈酿后熟酿造而成。由于鱼露完全依靠自然发酵过程，需要12
‑
24个月，生产周期长，造成鱼露产业发展落后。因此，如何缩短鱼露发酵周期，加快发酵速度，是目前鱼露生产企业亟待解决的重要难题。
3.采用添加微生物发酵剂的低盐快速发酵技术是目前加速鱼露发酵常用的方式。但是由于目前微生物发酵剂筛选的盲目性，大多选用的菌株不是在传统发酵鱼露风味和品质形成起关键作用的菌株，而且耐盐性较差，因此虽然鱼露发酵速度有所提高，但失去了传统鱼露的特征风味，同时低盐发酵容易造成杂菌污染，因此基本无法进行工业化应用。盐厌氧菌(halanaerobium)已被鉴定为我国传统发酵鱼露中的核心微生物菌群，在鱼露风味和品质形成过程中起着关键作用。而且该类微生物具有很强的耐盐性，避免由于鱼露发酵盐度过高导致发酵剂失活。然而，目前还没有关于鱼露中盐厌氧菌的筛选及应用于鱼露快速发酵的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种利用发酵盐厌氧菌改善鱼露发酵品质的方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法有利于缩短传统鱼露发酵周期，提升发酵速率，改善鱼露品质、风味和食用安全性。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种发酵盐厌氧菌(halanaerobium fermentans)yl9
‑
2，其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.22952，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2021年07月26日。
7.本发明还提供一种利用上述的发酵盐厌氧菌yl9
‑
2改善鱼露发酵品质的方法，包括采用所述发酵盐厌氧菌yl9
‑
2对鱼露原料进行加菌发酵的步骤。
8.进一步地，所述加菌发酵的加盐量为鱼露原料的20
‑
30wt％。
9.进一步地，所述加菌发酵的发酵温度为25
‑
35℃，发酵时间为10
‑
90d。
10.进一步地，在加菌发酵前，还包括发酵剂制备的步骤；所述发酵剂制备包括：将发酵盐厌氧菌yl9
‑
2厌氧培养1
‑
3d，于4℃、12000g离心10min，重悬。
11.进一步地，所述厌氧培养包括：将所述发酵盐厌氧菌yl9
‑
2接种到新鲜的lb改良培养基中，15
‑
37℃下恒温厌氧培养1
‑
3d。
12.进一步地，所述lb改良培养基包括以下质量百分比的组分：蛋白胨0.1
‑
3％、酵母浸粉0.1
‑
3％、氯化钠5
‑
20％、琼脂1.5
‑
2.5％，用0
‑
20％鱼露发酵稀释液溶解。
13.进一步地，所述发酵剂按照105‑
107cfu/g的终浓度加入到鱼露原料中。
14.进一步地，所述鱼露原料包括绞碎的新鲜小型低值鱼；所述小型低值鱼包括但不限于鳀鱼、蓝圆鲹、沙丁鱼、鲭鱼、青鳞鱼、凤尾鱼、虾虎鱼和黄花鱼中的一种或多种。
15.具体地，以上方法包括以下步骤：
16.(1)原料的处理：将新鲜小型低值鱼用绞肉机绞碎，按照20
‑
30％(w/w)的比例加入食用盐，混匀后备用；
17.(2)发酵剂的制备与添加：将发酵盐厌氧菌厌氧培养1
‑
3d，于4℃、12000g离心10min，无菌生理盐水重悬，将菌体按105‑
107cfu/g的终浓度加入到鱼露原料中，搅拌均匀；
18.(3)发酵鱼露：将加菌的原料在温度25
‑
35℃下保温发酵10
‑
90d，获得鱼露发酵液；
19.(4)过滤与灭菌：将鱼露发酵液用纱布过滤，去除未分解的鱼肉、鱼骨等固形物残留，得到的鱼露发酵液进行灌装杀菌，获得鱼露发酵产品。
20.本发明还提供一种上述的发酵盐厌氧菌yl9
‑
2的用途，其特征在于，用于改善鱼露发酵品质。
21.本发明公开了以下技术效果：
22.本发明利用筛选培养基从鱼露发酵液中定向筛选盐厌氧菌，通过加菌发酵的方式，提升传统鱼露发酵速率，改善鱼露发酵品质，为我国传统鱼露发酵产业转型升级提供重要理论基础和技术支撑；本发明利用发酵盐厌氧菌所生产的鱼露，具有传统发酵鱼露特有的香气，与自然发酵鱼露相比，发酵周期明显缩短，氨基酸态氮含量明显提升，挥发性盐基氮、组胺和总生物胺的含量显著降低，具有广阔的市场应用前景。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为利用发酵盐厌氧菌yl9
‑
2的16s rrna基因序列构建的系统进化树。
25.图2为发酵盐厌氧菌yl9
‑
2的革兰氏染色结果。
具体实施方式
26.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
27.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括
或排除在范围内。
28.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
29.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
30.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
31.实施例1
32.该发酵盐厌氧菌系从广东省汕头市汕头鱼露厂有限公司的传统鱼露发酵样品中筛选分离得到，筛选方法为：在改良的lb平板(蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠10％、琼脂2％，用10％鱼露发酵稀释液溶解)上涂布不同梯度稀释倍数(10
‑
106)的鱼露发酵液，35℃厌氧培养3d，挑选生长良好的单菌落，在改良的lb平板上连续划线纯化培养三次，获得疑似菌株，然后分别接种至改良的lb液体培养基(蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠10％，用10％鱼露发酵稀释液溶解)中，进行后续形态观察及鉴定。
33.对纯化出来的菌株进行形态学以及生长特性分析，筛选出特性明显的盐厌氧菌(革兰氏阴性菌、杆状)，该盐厌氧菌是一株可以改善鱼露发酵品质的新菌株，经系统分类鉴定及形态鉴定，系统进化树如图1所示，革兰氏染色后显微镜下形态如图2所示，鉴定为发酵盐厌氧菌(halanaerobium fermentans)。
34.该发酵盐厌氧菌命名为发酵盐厌氧菌yl9
‑
2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.22952，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2021年07月26日。
35.经16s rrna基因序列鉴定，测序拼接结果如下(seq id no.1)：
36.tcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacggtctaccctgacagataccttcgggttgaagacaggactagatagtggcggacgggtgagtaacacgtgaataatctgtcctcaagtctgggataacctggcgaaagtcgggctaaccccggataagctgagagtgtggcatcacacaatcagaaaaggtggctctgccatcgtttgaggaggagttcgcggtagattagctagctggtaaggtaatggcttaccagggcaacaatctatagctggtctgagaggacgatcagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatcttccacaatgggcgcaagcctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagacggtcttcggattgtaaagctctgtccttagggaagaaccgtgggtatagcaaatgatacccatctgacggtacctttggaggaagcactggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagagtgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggtacgcaggcggataatcaagtcaagcgtgaaaggtgtcggcttaaccgacagactgcgtttgaaactggttatcttgagtgtaacagaggagagtggaattcctagtgtagtggtgaaatacgtagatattaggaagaacaccagtggcgaaggcgactctctgggttaacactgacgctgaggtacgagagctgggggagcgaacgggattagataccccggtagtcccagccgtaaacgatggatactaggtgttggaggttcgaatccttcagtgccggagttaacgcattaagtatcccgcctggggattacgatcgcaagattgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaa
gaaccttaccgagaattgacatcccgtgaccatctatgaaagtagagtttagcactttgtgctacacggagacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgttcttagttgccagcgagtaatgtcggggactctaagaagactgccggtgaaagtcggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatgccctttatatctcgggctacacacgtgctacaatggttggtacagaggggagcaagaccgcgaggtggagcaaaacctttaaaaccaaccccagttcggattgcaggctgcaacccgcctgtatgaagttggaatcgctagtaatcgcaggtcagaatactgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccaatcgagttggatgcaccagaagtcatctgaggatgccaaaggtgtgtccggtaagaggggtgaagtc。
37.实施例2
38.(1)原料的处理：将新鲜鳀鱼用绞肉机绞碎，按照30％(w/w)的比例加入食用盐，混匀后备用。
39.(2)发酵剂的制备与添加：将发酵盐厌氧菌在lb改良培养基(蛋白胨2％、酵母浸粉0.5％、氯化钠15％、琼脂1.8％，用15％鱼露发酵稀释液溶解)中厌氧培养3d，于4℃、12000g离心10min，无菌生理盐水重悬，将菌体按107cfu/g的终浓度加入到预处理过的原料中，搅拌均匀。向原料中只加相同体积的生理盐水作为对照组，用于鱼露的自然发酵。
40.(3)发酵鱼露：将加菌发酵组和对照组的原料在温度30℃下保温发酵90d，获得鱼露发酵液。
41.(4)过滤与灭菌：鱼露发酵液用纱布过滤，去除未分解的鱼肉、鱼骨等固形物残留，得到的鱼露发酵液进行灌装杀菌，获得鱼露发酵产品。
42.鱼露发酵产品的理化指标结果如表1所示。加入该发酵盐厌氧菌发酵鱼露的品质显著提升，其中氨基酸态氮含量可达到0.905g/100ml，总氮含量为1.657g/100ml，根据中国鱼露行业标准该鱼露划分为一级鱼露；此时自然发酵鱼露的氨基酸态氮含量仅为0.570g/100ml，总氮含量为1.412g/100ml，根据中国鱼露行业标准该鱼露仅为三级鱼露。同时加入该发酵盐厌氧菌发酵鱼露的质量安全显著提升，组胺含量为24.084mg/100ml，低于欧盟标准40mg/100ml；与自然发酵鱼露相比，加菌发酵鱼露的组胺、挥发性盐基氮和总生物胺含量分别下降了22.84％、26.78％和27.15％。此外，利用发酵盐厌氧菌发酵的鱼露中鱼腥味大大减少，与自然发酵鱼露相比，风味有显著改善。
43.实施例3
44.(1)原料的处理：将新鲜蓝圆鲹用绞肉机绞碎，按照20％(w/w)的比例加入食用盐，混匀后备用。
45.(2)发酵剂的制备与添加：将发酵盐厌氧菌在lb改良培养基(蛋白胨2％、酵母浸粉0.5％、氯化钠10％、琼脂2％，用10％鱼露发酵稀释液溶解)中厌氧培养2d，于4℃、12000g离心10min，无菌生理盐水重悬，将菌体按106cfu/g的终浓度加入到预处理过的原料中，搅拌均匀。向原料中只加相同体积的生理盐水作为对照组，用于鱼露的自然发酵。
46.(3)发酵鱼露：将加菌发酵组和对照组的原料在温度35℃下保温发酵10d，获得鱼露发酵液。
47.(4)过滤与灭菌：鱼露发酵液用纱布过滤，去除未分解的鱼肉、鱼骨等固形物残留，得到的鱼露发酵液进行灌装杀菌，获得鱼露发酵产品。
48.鱼露发酵产品的理化指标结果如表1所示。加入该发酵盐厌氧菌发酵鱼露的品质显著提升，其中氨基酸态氮含量可达到1.034g/100ml，总氮含量为2.547g/100ml，根据中国
鱼露行业标准该鱼露划分为一级鱼露；此时自然发酵鱼露的氨基酸态氮含量仅为0.730g/100ml，总氮含量为2.566g/100ml，根据中国鱼露行业标准该鱼露仅为二级鱼露。同时加入该发酵盐厌氧菌发酵鱼露的质量安全显著提升，组胺含量为8.806mg/100ml，低于欧盟标准40mg/100ml；与自然发酵鱼露相比，加菌发酵鱼露的组胺、挥发性盐基氮和总生物胺含量分别下降了33.90％、26.85％和30.12％。此外，利用发酵盐厌氧菌发酵的鱼露中鱼腥味大大减少，与自然发酵鱼露相比，风味有显著改善。
49.实施例4
50.(1)原料的处理：将新鲜蓝圆鲹用绞肉机绞碎，按照20％(w/w)的比例加入食用盐，混匀后备用。
51.(2)发酵剂的制备与添加：将发酵盐厌氧菌在lb改良培养基(蛋白胨2％、酵母浸粉0.5％、氯化钠10％、琼脂2％，用10％鱼露发酵稀释液溶解)中厌氧培养2d，于4℃、12000g离心10min，无菌生理盐水重悬，将菌体按106cfu/g的终浓度加入到预处理过的原料中，搅拌均匀。向原料中只加相同体积的生理盐水作为对照组，用于鱼露的自然发酵。
52.(3)发酵鱼露：将加菌发酵组和对照组的原料在温度35℃下保温发酵45d，获得鱼露发酵液。
53.(4)过滤与灭菌：鱼露发酵液用纱布过滤，去除未分解的鱼肉、鱼骨等固形物残留，得到的鱼露发酵液进行灌装杀菌，获得鱼露发酵产品。
54.(5)鱼露理化指标结果如表1所示。加入该发酵盐厌氧菌发酵鱼露的品质显著提升，其中氨基酸态氮含量可达到1.357g/100ml，总氮含量为3.011g/100ml，根据中国鱼露行业标准该鱼露划分为一级鱼露；此时自然发酵鱼露的氨基酸态氮含量仅为1.039g/100ml，总氮含量为2.967g/100ml，氨基酸态氮与加菌发酵鱼露相比下降了23.43％。同时加入该发酵盐厌氧菌发酵鱼露的质量安全显著提升，组胺含量为20.252mg/100ml，低于欧盟标准40mg/100ml；与自然发酵鱼露相比，加菌发酵鱼露的组胺含量、挥发性盐基氮含量和总生物胺含量分别下降26.40％、27.64％和25.26％。此外，利用发酵盐厌氧菌发酵的鱼露中鱼腥味大大减少，与自然发酵鱼露相比，风味有显著改善。
55.表1
56.[0057][0058]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。