用于靶向线粒体和杀死癌症干细胞的三联疗法的制作方法

用于靶向线粒体和杀死癌症干细胞的三联疗法
1.领域
2.本公开涉及用于治疗和/或预防癌症、肿瘤复发、转移和癌细胞耐药以及其他有益治疗用途的组合物和方法。
3.背景
4.研究人员一直在努力开发新的抗癌治疗。常规的癌症疗法(例如辐射，烷化剂如环磷酰胺和抗代谢物如5
‑
氟尿嘧啶)试图通过干扰参与细胞生长和dna复制的细胞机制来选择性地检测和根除快速生长的癌细胞。其他癌症疗法使用了免疫疗法，其选择性结合快速生长的癌细胞上的突变肿瘤抗原(例如，单克隆抗体)。不幸的是，在这些治疗之后，肿瘤经常在相同或不同的部位复发，这表明并非所有癌细胞都已被根除。特别地，癌症干细胞因各种原因而存活，并导致治疗失败。复发可能是由于化学治疗剂剂量不足和/或出现对疗法耐受性的癌症克隆。因此，需要克服常规疗法不足之处的新癌症治疗策略。
5.突变分析的进展已经允许深入研究癌症发展过程中出现的基因突变。尽管已经了解了基因组全景，现代肿瘤学仍难以鉴定跨癌症亚型的主要驱动突变。残酷的现实似乎是，每个患者的肿瘤都是独特的，而单一的肿瘤可能包含多种不同的克隆细胞。因此，需要一种重视不同癌症类型之间的共性的新方法。靶向肿瘤和正常细胞之间的代谢差异有望成为一种新的癌症治疗策略。对来自人乳腺癌样品的转录谱数据的分析揭示了超过95种与线粒体生物发生和/或线粒体翻译相关的升高的mrna转录物。sotgia等人，cell cycle,11(23):4390
‑
4401(2012)。此外，95种上调的mrna中有超过35种编码线粒体核糖体蛋白(mrp)。人乳腺癌干细胞的蛋白质组学分析同样揭示了几种线粒体糖体蛋白以及与线粒体生物发生相关的其他蛋白的显著过表达。lamb等人，oncotarget,5(22):11029
‑
11037(2014)。
6.使用某些抑菌抗生素或oxphos抑制剂的脱靶效应对线粒体生物发生的功能性抑制提供了额外的证据，即有功能的线粒体是癌症干细胞增殖所需的。本发明人最近证明，线粒体荧光染料(mitotracker)可以有效用于从活细胞异质群体中富集和纯化癌症干细胞样细胞。farnie等人，oncotarget,6:30272
‑
30486(2015)。具有最高线粒体质量的癌细胞具有最强的功能性能力，可以进行不依赖贴壁(anchorage
‑
independent)的生长，这一特征通常与转移潜能相关。如使用临床前模型所示，“高线粒体(mito
‑
high)”细胞亚群在体内也具有最高的肿瘤起始活性。本发明人还证明了几类无毒抗生素可用于阻止癌症干细胞(csc)增殖。lamb等人,oncotarget,6:4569
‑
4584(2015)。由于需氧细菌和线粒体之间保守的进化相似性，某些类别的抗生素或具有抗生素活性的化合物可以抑制线粒体蛋白翻译，作为脱靶副作用。现代医学普遍认为抗线粒体副作用是不希望的，并且那些脱靶结果通常会导致使用不同的药物。
7.概述
8.鉴于上述背景，本途径的一个目的是提供用于通过在诱导的线粒体氧化应激期间抑制线粒体生物发生来根除csc的组合物和方法。如下文将描述的，本途径的实施方案在csc中诱导线粒体灾变(catastrophe)。根据本途径的一些实施方案，抑制大线粒体核糖体的第一抗生素和抑制小线粒体核糖体的第二抗生素可以与助氧化剂或诱导线粒体氧化应
激的试剂一起施用。在一些实施方案中，一种或多种fda批准的抗生素可以与一种或多种常见的膳食补充剂结合使用。在一些实施方案中，助氧化剂可以是具有助氧化作用的治疗剂。例如，助氧化剂可以是治疗剂，其浓度使得该治疗剂充当还原剂。在一些实施方案中，一种或多种治疗剂可以与靶向信号缀合。本途径的实施方案可以用于以下一种或多种：治疗和/或预防癌症、肿瘤复发、转移、化学疗法耐受或耐药、放射疗法耐受和由于癌症或其他有益疗法的其他原因引起的恶病质。
9.在示意性抗癌实施方案中，强力霉素、阿奇霉素和维生素c的组合有效靶向线粒体并有效抑制csc增殖。癌症干细胞相对于正常细胞代谢过度活跃，至少部分是由于癌症干细胞中线粒体量的增加，因此这种方法选择性地靶向csc群体。阿奇霉素抑制大线粒体核糖体作为脱靶副作用。此外，强力霉素抑制小线粒体核糖体作为脱靶副作用。维生素c充当一种温和的助氧化剂，助氧化剂可以产生自由基并从而诱导线粒体生物发生。显著地，根据本途径的一个实施方案，使用mcf7 er( )乳腺癌细胞系作为模型系统，用强力霉素(1μm)、阿奇霉素(1μm)和维生素c(250μm)的组合治疗非常有效地抑制了约90％的csc增殖。使用代谢通量分析直接验证了这种三联疗法对线粒体耗氧量和atp产生的强抑制作用。因此，将轻度线粒体氧化应激的诱导与线粒体生物发生的抑制偶联，代表了一种有效的治疗性抗癌策略。与这些主张一致，已知维生素c被特定的转运蛋白，即scvct2，以钠偶联方式高度集中在线粒体内。
10.在初步研究期间，根据本途径的一个实施方案的组合物抑制了mcf7er( )细胞系中约90％的csc增殖，同时证实了线粒体耗氧量和atp产生的减少。此外，一些实施方案可以使用亚抗微生物抗生素浓度，从而最小化或避免抗生素耐药问题——这对医学界来说是一个极大的益处。
11.在一些实施方案中，本途径可以采用具有(i)红霉素家族成员，(ii)四环素家族成员，和(iii)助氧化剂的组合物的形式。在以下讨论的一些实施方案中，组合物包含阿奇霉素、强力霉素和维生素c作为治疗剂。阿奇霉素是一种广泛使用的抗生素，并且具有抑制大线粒体核糖体的通常不希望的副作用。强力霉素抑制小线粒体核糖体，这也是一种不希望的副作用。这些脱靶效应经常导致医师选择其他用于多种适应症的药物。然而，本途径有利地利用了这种脱靶线粒体抑制作用，以选择性地靶向和根除csc。维生素c在某些情况下充当温和的助氧化剂，并且作为助氧化剂，通过产生自由基和活性氧物质在csc中诱导线粒体氧化应激。(应注意的是，其他抗坏血酸衍生物可以具有类似的助氧化作用，特别是在低浓度。)csc通过线粒体生物发生对线粒体氧化应激作出反应。然而，在诸如阿奇霉素和强力霉素的线粒体的生物发生抑制剂的存在下，csc无法适应并经得住诱导的线粒体氧化应激。本途径是选择性的，靶向csc的同时对正常的健康细胞几乎没有影响。
12.在一个示例性实施方案中，用强力霉素(1μm)、阿奇霉素(1μm)和维生素c(250μm)的组合治疗抑制了mcf7 er( )乳腺癌细胞中约90％的csc增殖。这种三联疗法对线粒体耗氧和atp产生的强抑制作用已使用代谢通量分析直接验证。如本文所述，将轻度线粒体氧化应激的诱导与线粒体生物发生的抑制相结合，代表了一种有效的抗癌疗法。此外，本文讨论的实例中使用的亚抗微生物抗生素浓度引起极少的(如果有的话)与抗生素耐药发展相关的问题。因此，在一些实施方案中，可以亚抗微生物浓度施用抑制大线粒体核糖体的第一抗生素和/或抑制小线粒体核糖体的第二抗生素。例如，强力霉素的常见亚抗微生物剂量为
20mg，这在本途径的一些实施方案中可能是合适的。作为另一个实例，在一些实施方案中，足以在血液、血清和血浆中的至少一种中产生约1μm的峰值强力霉素浓度的强力霉素的量可能是足够的。作为另一个实例，阿奇霉素的常见口服亚抗微生物剂量是250mg，这在本途径的一些实施方案中可以是合适的。作为又一个实例，在一些实施方案中，足以在血液、血清和血浆中的至少一种中产生约1μm的峰值阿奇霉素浓度的阿奇霉素的量可以是足够的。应当理解，对于特定的实施方案，优化可能需要进一步细化，但是这种细化在本领域普通技术人员的水平之内。
13.fda批准的抗生素，且特别是四环素家族成员，例如强力霉素，和红霉素家族成员，例如阿奇霉素，具有抑制线粒体生物发生的脱靶效应。这种抗线粒体特性通常被视为副作用，在本领域被认为是不希望的，并且可能是现代医学中避免使用特定药物的基础。然而，这些化合物具有根除csc的功效。然而，当单独使用时，具有抗线粒体特性的抗生素并不能保证根除所有csc。如本文所证明的，一种或多种靶向大线粒体核糖体的治疗剂与一种或多种靶向小线粒体核糖体的治疗剂的组合更有效。然而，在暴露于线粒体生物发生抑制剂后，存活csc亚群可能存在从氧化代谢到糖酵解代谢的代谢转变，导致代谢不灵活性(metabolic inflexibility)。另一方面，助氧化剂化合物诱导使csc朝向线粒体生物发生转变的线粒体氧化应激。诱导线粒体氧化应激并同时抑制线粒体生物发生的双重方法使csc没有可选择的存活机制。因此，靶向大线粒体核糖体的治疗剂与靶向小线粒体核糖体的治疗剂和助氧化剂的三联组合，能够实现高度有效的抗癌策略。在一些优选的实施方案中，所述三联组合包括抑制大线粒体核糖体的第一抗生素，和抑制小线粒体核糖体的第二抗生素，和助氧化剂。在一些优选的实施方案中，三联组合包括至少一种来自四环素家族的抗生素、至少一种来自红霉素家族的抗生素和维生素c。有利地，本途径的一些实施方案要求抗生素浓度为亚抗微生物剂量。例如，对于给定的剂型，强力霉素和阿奇霉素可以以本领域已知的亚抗微生物剂量施用，例如强力霉素以20mg口服施用，而阿奇霉素以250mg口服施用。作为另一个实例，可以施用足以在血液、血清和血浆中的至少一种中导致峰值强力霉素浓度的强力霉素和阿奇霉素，所述峰值强力霉素浓度在一些实施方案中为约0.05μm至约5μm，且在一些实施方案中为0.5μm至约2.5μm，且在一些实施方案中为约1μm。对各种实施方案的合适剂量的进一步评价正在进行中，并且应当理解，在不脱离本途径的情况下可以使用其他量和浓度。
14.本文描述了用于治疗癌症以及许多其他有益的治疗用途的化合物和方法的实例。本途径可用作抗癌疗法，并且可以与其他抗癌疗法，例如化学疗法和/或放射疗法结合使用。例如，本途径可以在手术切除肿瘤之前、期间和/或之后使用，以防止或降低转移的可能性。作为另一个实例，本途径可以在化学疗法之前、期间或之后使用，以提高成功的可能性。作为另一个实例，本途径可以反复地使用(例如，每年)，以预防和/或降低复发和/或转移的可能性。与许多现代实施方案不同，本途径的实施方案可用于靶向癌症干细胞，从而直接解决肿瘤复发、转移、耐药和/或放射疗法耐受的可能性。例如，靶癌细胞表型可以是csc、高能癌症干细胞(ecsc)、循环肿瘤细胞(ctc)和治疗耐受性癌细胞(therapy
‑
resistant cancer cell，trcc)中的至少一种。
15.进一步地，可以通过用一种或多种膜靶向信号和/或线粒体靶向信号对抗生素进行化学修饰来增强抗生素的抗线粒体特性。例如，脂肪酸靶向信号可以与抗生素缀合并产
生在本途径下具有改进功效的化合物。治疗剂可以与亲脂性阳离子如tpp部分缀合，并且具有改善的线粒体摄取和csc抑制活性。例如，强力霉素
‑
肉豆蔻酸酯缀合物的实施方案显示出比强力霉素更好的csc抑制特性和更低的毒性。与脂肪酸缀合并且也与tpp缀合的其他四环素和红霉素家族成员也发现类似的结果。下面讨论示意性的实例。对于其他实例，参见例如2018年5月18日提交的国际专利申请pct/us2018/033466、2018年11月21日提交的国际专利申请pct/us2018/062174和2019年11月29日提交的国际专利申请pct/us2018/062956中公开的方法，其各自通过引用整体并入本文。向治疗剂添加一种或多种靶向信号可以显著提高该药剂的有效性，在某些情况下，在靶细胞器中提高超过100倍。因此，本途径的一些实施方案可以具有用靶向信号化学修饰的一种或多种治疗剂。这种修饰可以允许更小的浓度或剂量，这是本途径的另一个有利的益处。
16.膜靶向信号的实例包括脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、短链脂肪酸(即，在化学结构中具有5个或更少的碳原子)、中链脂肪酸(在化学结构中具有6
‑
12个碳原子)和其他长链脂肪酸(即在化学结构中具有13
‑
21个碳原子)。本公开可以互换地以其盐或酯形式(例如，肉豆蔻酸、肉豆蔻酸酯、十四烷酸盐)表示这些靶向信号，并且应当理解，脂肪酸的碳酰基可以通过酰胺键连接到治疗剂。例如，本领域已知的用于形成肉豆蔻酰化蛋白质的肉豆蔻酰化方法可以用于形成符合本途径的治疗剂。线粒体靶向信号的实例包括亲脂性阳离子，例如三苯基鏻(tpp)、tpp衍生物、胍盐、胍盐衍生物和10
‑
n
‑
壬基吖啶橙。碳间隔臂和/或连接基团可以用于将线粒体靶向信号栓系(tether)到所述治疗剂。应当理解，这些实例并非旨在穷举。
17.本公开可以采用一种或多种药物组合物的形式。该组合物可以用于治疗和/或预防癌症、癌细胞的耐药、癌细胞化学疗法耐受性、肿瘤复发、转移和放射疗法耐受性中的一种或多种。本途径的实施方案可以用于制备用于以下一种或多种的药物组合物：治疗癌症、预防癌症、克服癌症的耐药性或治疗耐受性以及预防和/或降低肿瘤复发和/或转移的可能性。一些实施方案可以具有抗病毒活性、抗细菌活性、抗微生物活性、光增敏活性和放射增敏活性中的一种或多种。一些实施方案可以使癌细胞对化学治疗剂敏感，使癌细胞对天然物质敏感，和/或使癌细胞对热量限制敏感。
18.本途径还可以用于治疗和/或减少衰老的作用。作为实例，实施方案可以用于提高健康寿命和寿命。阿奇霉素是一种抗衰老药物，其作用类似于选择性地杀死和去除衰老的成纤维细胞的抗衰老药物(senolytic)。一些实施方案可以用于有利地越过正常的健康细胞而靶向和杀死衰老细胞。在一些实施方案中，所述组合物防止获得衰老相关的分泌表型。在一些实施方案中，所述组合物促进组织修复和再生。在一些实施方案中，所述组合物增加生物体寿命和健康寿命中的至少一种。
19.在一些实施方案中，本公开涉及治疗方法，其包括将药学有效量的一种或多种药物组合物和药学上可接受的载体施用有需要的患者。在一些实施方案中，第三药剂可以用驱动活性氧物质和/或线粒体氧化应激的产生的化学治疗剂或放射疗法代替。在这样的实施方案中，例如，线粒体抑制剂可以与化学疗法或放射治疗组合使用，以通过它们抑制线粒体生物发生和防止csc增殖的能力来降低肿瘤复发、转移和治疗失败的发生率。在一些实施方案中，例如，抑制大线粒体核糖体的第一抗生素和抑制小线粒体核糖体的第二抗生素的组合可以与传统化学疗法联合施用以减少或预防复发和/或转移。作为另外的实例，本途径
可用于根除整个csc群，从而消除原始csc群体转移和复发的可能性。
20.附图简述
21.图1a
‑
1c总结了强力霉素和阿奇霉素的不同浓度和组合的乳腺球形成数据。
22.图2a
‑
2d总结了用均1μm浓度的强力霉素、阿奇霉素以及强力霉素和阿奇霉素的组合预处理的mcf7细胞的代谢谱数据。
23.图3a
‑
3d分别总结了用均1μm浓度的强力霉素、阿奇霉素以及强力霉素和阿奇霉素的组合预处理的mcf7细胞的细胞外酸化率(ecar)、糖酵解、糖酵解储备和糖酵解储备能力数据。
24.图4a将1μm强力霉素和1μm阿奇霉素的组合的ecar数据与对照进行了比较，而图4b将该组合的ocr与ecar比率与对照进行了比较。
25.图5总结了用强力霉素、阿奇霉素以及强力霉素和阿奇霉素的组合处理的正常细胞的毒性数据。
26.图6a和6b总结了在根据本途径的多个实施方案同时处理之后的乳腺球形成。
27.图7a和7b是显示本途径的实施方案抑制氧化性线粒体代谢(图7a)和糖酵解功能(图7b)的海马曲线。
28.图8a
‑
8f显示了根据本途径的一个实施方案预处理的mcf7细胞的代谢谱数据。
29.图9a和9b总结了与对照相比，单独用250μm维生素c处理的mcf7细胞的海马曲线(分别为ocr和ecar数据)。
30.图10a
‑
10f显示了用250μm维生素c预处理三天的mcf7细胞的代谢谱数据。
31.图11a和11b显示了低剂量维生素c和根据本途径的实施方案的治疗剂三联组合的海马曲线(分别为ocr和ecar数据)。
32.图12a
‑
12f显示了并行的代谢谱数据，将低剂量维生素c与根据本途径的三联组合的实施方案进行了比较。
33.图13示出了根据本途径的实施方案的治疗机制。
34.图14是比较强力霉素和强力霉素
‑
脂肪酸缀合物的mcf7细胞的乳腺球测定结果的柱状图。
35.图15是显示强力霉素和强力霉素
‑
脂肪酸缀合物在一定浓度范围内的乳腺球测定结果的线图。
36.图16a
‑
16c是比较治疗剂和靶向信号的缀合物与未缀合的治疗剂的细胞保留的图像。
37.图17a和17b比较了治疗剂和靶向信号的缀合物与未缀合的治疗剂分别在mcf7和bj细胞中的细胞活力数据。
38.图18示出了根据本途径的实施方案的抗衰老试剂盒。
39.描述
40.以下描述以足以能够实施本途径的细节说明了本途径的实施方案。尽管参考这些具体实施方案描述了本途径，但是应当理解，本途径可以以不同形式体现，并且该描述不应被解释为将任何所附权利要求局限于本文阐述的这些具体实施方案。相反，提供这些实施方案是为了使本公开详尽和完整，并将本途径的范围充分传达给本领域技术人员。
41.本描述使用了本领域普通技术人员应当理解的各种术语。为了避免疑问，作出以
下澄清。如本文所用，术语衍生物是由述及的化学部分衍生或合成的化学部分。如本文所用，缀合物是通过结合两种或更多种化学化合物形成的复合物。例如，强力霉素和脂肪酸的缀合物产生具有强力霉素部分和衍生自脂肪酸的部分的复合物。如本文所用，脂肪酸是具有饱和或不饱和脂肪链的羧酸。脂肪酸的实例包括短链脂肪酸(即在化学结构中具有5个或更少的碳原子)、中链脂肪酸(在化学结构中具有6
‑
12个碳原子)和其他长链脂肪酸(即，在化学结构中具有13
‑
21个碳原子)。饱和脂肪酸的实例包括月桂酸(ch3(ch2)
10
cooh)、棕榈酸(ch3(ch2)
14
cooh)、硬脂酸(ch3(ch2)
16
cooh)和肉豆蔻酸(ch3(ch2)
12
cooh)。油酸(ch3(ch2)7ch＝ch(ch2)7cooh)是天然存在的不饱和脂肪酸的一个实例。还可参考脂肪酸的盐或酯，及其脂肪酰胺部分。例如，肉豆蔻酸可以表示为肉豆蔻酸酯，并且油酸可以表示为油酸酯。脂肪酸部分也可以是脂肪酸的碳酰基，即通过失去羧酸的羟基而形成的基团。在一些实施方案中，脂肪酸部分可以通过酰胺键与治疗剂结合。例如，肉豆蔻酸缀合物可以具有脂肪酸部分ch3(ch2)
12
co
‑
nh
‑
，其中叔氮键合到治疗剂：且n为1至20，且优选为10至20的整数。当肉豆蔻酸酯部分通过肉豆蔻酰化缀合时，可以产生这种情况，从而产生十四酰胺(或肉豆蔻酰胺)基团。
42.许多化学间隔臂和连接基团是化学领域中已知的并且是可获得的。如本文所用，“间隔臂”是指将治疗剂连接到连接基团和靶向信号部分之一的直链、支链和/或环状部分。存在本领域已知的多种间隔臂，且除非另有说明，否则本公开中该术语的使用优选是灵活的。间隔臂可以包括取代或未取代的c1‑
c
20
烷基和烯基。示意性间隔臂包括选自由
‑
(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
‑
o
‑
(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
‑
(nr
a
r
b
)
‑
(ch2)
m
‑
及其组合组成的组的部分。给定间隔臂中的r
a
和r
b
可以独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、杂环、杂芳基或其组合；或氮保护基团。在一些实施方案中，r
a
和r
b
中的至少一个可以不存在。在一些形式中，间隔臂可以包括诸如(
‑
(ch2)2‑
o)
m
‑
(ch2)2‑
的部分。任何给定的间隔臂中的下标“m”是从1到20的正整数。
43.如本文所用，术语“连接基团”是指包含能够与另一部分上的官能团共价反应(或已与其反应)的官能团的部分，包括治疗剂、间隔臂和靶向信号部分。示例性连接基团包括取代或未取代的c1‑
c4烯烃、
‑
o
‑
、
‑
nr
c
‑
、
‑
oc(o)
‑
、
‑
s
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)
‑
、
‑
c(o)nr
c
‑
和
‑
s(0)2nr
c
‑
，其中c是1到3的整数。
44.线粒体是尚未开发的治疗多种病痛的通道，所述病痛从癌症到细菌和真菌感染再到衰老。功能性线粒体是癌症干细胞的增殖所需的。抑制癌细胞中的线粒体生物发生和代谢会阻碍这些细胞的增殖。因此，线粒体抑制剂代表了一类新的抗癌治疗剂。
45.本发明人分析了在大范围的癌症类型中可被靶向的csc的表型特性，并确定了对于csc的克隆扩增和存活，csc对线粒体生物发生的严格依赖性。本发明人之前的工作表明，不同类别的fda批准的抗生素，且特别是四环素，如强力霉素和红霉素，具有抑制线粒体生物发生的脱靶效应。因此，这样的化合物具有根除csc的功效。然而，这些常见的抗生素并非旨在靶向线粒体，这为改善其抗癌功效留下了相当大的空间。类似地，现代医学认为这些脱靶效应是不希望的。在本途径下，具有内在抗线粒体特性的现有抗生素可以与一种或多种助氧化剂结合使用，以抑制线粒体氧化应激下的线粒体生物发生和csc代谢。在一些实施方案中，一种或多种治疗剂可以用膜靶向信号或线粒体靶向信号进行化学修饰，以进一步增加csc线粒体处治疗剂的摄取。线粒体靶向信号可以显著增加这种靶向摄取，通常增加100
倍，如果没有更多的话。
46.强力霉素通过抑制csc增殖来影响癌症生长，ic
‑
50为2至10μm。乳腺癌抗生素(abc)试验是在比萨大学医院(university of pisa hospital)进行的。abc试验旨在评估强力霉素在早期乳腺癌患者中的抗增殖和抗csc机制作用。abc试验的主要终点是确定i至iii期早期乳腺癌患者通过口服强力霉素进行短期(例如，2周)术前治疗是否会导致肿瘤增殖标志物的抑制，如通过肿瘤ki67从基线(治疗前)到治疗后(在手术切除时)的减少所确定的。次要终点用于确定在同一乳腺癌患者中使用强力霉素进行术前治疗是否导致csc增殖抑制和线粒体标志物减少。
47.abc试验的初步研究证实，强力霉素治疗成功地降低了乳腺癌肿瘤样品中csc标志物的表达。当与强力霉素前的肿瘤样品相比，强力霉素后的肿瘤样品显示干细胞性标志物cd44在统计学上降低了40％。接受强力霉素治疗的9名患者中有8名的cd44水平降低17.65％至66.67％。相比之下，只有一名患者显示cd44升高了15％。这代表了90％的积极反应率。干细胞性的另一种标志物aldh1也获得了类似的结果，尤其是在her2( )患者中。相比之下，线粒体、增殖、凋亡和新血管生成的标志物在两组之间都相似。这些结果表明强力霉素可以在体内选择性地根除乳腺癌患者中的csc。
48.本途径通过用靶向大线粒体核糖体的第二抗线粒体生物发生治疗剂，以及在csc中诱导线粒体氧化应激的助氧化剂放大强力霉素的影响，扩展了abc试验。本途径的实施方案通过具有至少一种抑制大线粒体核糖体的抗生素、至少一种抑制小线粒体核糖体的抗生素和至少一种助氧化剂的三联疗法，显著增强抑制线粒体生物发生的抗生素如强力霉素的csc增殖抑制作用。在以下讨论的示意性实施方案中，治疗剂包括阿奇霉素、强力霉素和维生素c。应当理解，可以使用其他线粒体生物发生抑制剂和线粒体氧化应激源。
49.以下段落讨论了本途径的选定实施方案的实验室数据和分析。在低浓度下单独和组合地测试强力霉素和阿奇霉素，以评价对乳腺球形成产生的抑制作用。图1a
‑
1c总结了不同浓度和组合的乳腺球形成数据。图1a显示了浓度为0.1μm至100μm的阿奇霉素的乳腺球形成测定结果。图1b比较了相当浓度的阿奇霉素(“azi”)和强力霉素(“dox”)的乳腺球形成测定结果。图1c显示了阿奇霉素和强力霉素在乳腺球形成测定中的联合作用。可以看出，单独的在低浓度(0.1μm和1μm)下的强力霉素和阿奇霉素对乳腺球形成的抑制具有很小的影响或没有影响。然而，图1c显示1μm强力霉素和1μm阿奇霉素的组合对乳腺球形成发挥非常显著的抑制作用。
50.相对于单独使用药物时，强力霉素和阿奇霉素的组合在抑制乳腺球形成方面具有显著增加的功效。例如，该组合的ic
‑
50比单独的阿奇霉素低约50倍，并且比单独使用强力霉素低2至5倍。这些结果表明强力霉素和阿奇霉素的组合比单独使用任一种治疗剂具有更高的治疗功效。
51.该组合对乳腺球形成的抑制作用与线粒体功能有关。检查了使用1μm强力霉素和1μm阿奇霉素的组合或使用单独的相同药物预处理3天的mcf7细胞单层的代谢谱以确认该关系。图2a
‑
2d总结了用均1μm浓度的强力霉素、阿奇霉素以及强力霉素和阿奇霉素的组合预处理的mcf7细胞的代谢谱数据。图2a显示了随时间推移的耗氧率，而图2b
‑
2d分别显示了基础呼吸、最大呼吸和atp产生。有趣的是，如使用seahorse xfe96分析仪评估的，组合预处理显著降低了氧化性线粒体代谢和糖酵解二者的速率。这导致呼吸(基础和最大)显著降低，
以及atp水平降低。图3a
‑
3d分别总结了用均1μm浓度的强力霉素、阿奇霉素以及强力霉素和阿奇霉素的组合预处理的mcf7细胞的细胞外酸化率(ecar)、糖酵解、糖酵解储备和糖酵解储备能力数据。强力霉素和阿奇霉素的组合降低了糖酵解和糖酵解储备二者。这种降低被认为是用线粒体生物发生抑制剂治疗的急性作用。随着时间的推移，预期存活的csc群体具有糖酵解代谢特征。图4a比较了该组合相对于对照的ecar，而图4b将该组合的ocr与ecar比率与对照进行了比较。图4a和4b中的数据显示mcf7癌细胞在联合治疗后从高能特征转变为代谢静止状态。
52.关于毒性，本途径的实施方案对正常的健康细胞是无毒的。图5以在不依赖贴壁的生长条件下剩余的活细胞百分比的形式总结了用1μm强力霉素、1μm阿奇霉素和1μm强力霉素和1μm阿奇霉素的组合处理的样品中的示意性毒性数据。在用单独的强力霉素、单独的阿奇霉素或其组合处理细胞单层48小时后，通过接种到低附着板上来富集csc群。在这些条件下，非csc群体会经历失巢凋亡(一种由细胞
‑
基质附着的缺乏诱导的细胞凋亡形式)，并且csc被认为可以存活。然后通过facs分析确定存活的csc分数。简言之，在6孔板中用抗生素或单独的溶媒处理1
×
104个mcf7单层细胞48小时。然后，将细胞用胰蛋白酶消化并接种在低附着板的乳腺球培养基中。12小时后，离心mcf7细胞。将细胞漂洗两次并与live/dead染料(fixable dead violet活性染料；invitrogen)一起孵育10分钟。然后通过facs(fortessa,bd bioscence)分析样品。然后通过使用本领域已知的live/dead染料染色测定来确定存活群体。使用flowjo软件分析数据。图5显示了所测试的治疗剂的最小细胞死亡。可以看出，1μm强力霉素与1μm阿奇霉素的组合在不依赖贴壁的生长条件下是无毒的。综上所述，实验结果表明，强力霉素和阿奇霉素的组合，特别是在低剂量时，对于csc根除比单独使用强力霉素更有效。
53.向该组合中引入助氧化剂为强力霉素和阿奇霉素的组合提供了甚至更强的抗癌作用。多个实验结果证实，抑制大线粒体核糖体的第一抗生素、抑制小线粒体核糖体的第二抗生素和助氧化剂的三联组合具有有效的抗癌特性。就抗癌活性而言，三种治疗剂的组合比其单独或成对的任一种治疗剂显著地更有效。在示意性实例中，已证实具有强力霉素、阿奇霉素和维生素c的组合的实施方案有效地抑制csc增殖。图6a总结了在用具有1μm强力霉素、1μm阿奇霉素和250μm维生素c的组合物同时处理后mcf7细胞中的乳腺球形成。图6b比较了在一个数据集中用具有5μm强力霉素、5μm阿奇霉素(az)和250μm维生素c的第一组合物，而在另一个数据集中的具有10μm强力霉素、10μm阿奇霉素和250μm维生素c的第二组合物同时处理后，mda
‑
mb
‑
468细胞(三阴性人乳腺癌细胞系)中的乳腺球形成。该数据表明，与对照相比，本途径的三联组合实施方案抑制多达～90％的csc增殖。因此，在非常低的治疗剂浓度下实现了3d肿瘤球形成能力的近乎完全消融，证明csc容易受到本途径的实施方案的影响。应当理解，本文描述的治疗剂浓度是说明性的，并且治疗剂的其他浓度可能是药学上有效的。有利地，本途径的实施方案即使在抗生素的亚微生物浓度下也保持有效。
54.另外的数据证实了抑制大线粒体核糖体的第一抗生素和抑制小线粒体核糖体的第二抗生素以及助氧化剂的三联组合对csc线粒体功能的抑制作用。图7a
‑
7b和8a
‑
8f分别显示用1μm强力霉素、1μm阿奇霉素和250μm维生素c的组合预处理3天的mcf7细胞单层的代谢特征，包括随时间推移的耗氧率、基础呼吸、最大呼吸、atp产生和备用呼吸能力。图7a和7b是显示本途径的实施方案抑制氧化性线粒体代谢(图7a)和糖酵解功能(图7b)的海马曲
线。可以看出，该三联组合抑制氧化性线粒体代谢(通过ocr测量)并诱导糖酵解功能(通过ecar测量)。图8a
‑
8f总结了用均以1μm浓度的强力霉素、阿奇霉素以及强力霉素和阿奇霉素的组合和250μm维生素c预处理的mcf7细胞的代谢数据。组合预处理明显降低了氧化性线粒体代谢和糖酵解的速率，如使用seahorse xfe96分析仪评估的。明显地，如使用seahorse xfe96分析仪评估的，氧化性线粒体代谢的速率降低超过50％，并且atp水平急剧降低。总的来说，这导致基础呼吸和最大呼吸二者显著降低。相反，在用测试的三联组合实施方案预处理的细胞单层中，糖酵解增加，但糖酵解储备降低。
55.包含助氧化剂对本途径的实施方案具有有价值的作用。图9a和9b总结了与对照相比，仅用250μm维生素c处理的mcf7细胞的ocr和ecar数据。如数据所示，用250μm维生素c(单独)治疗显著增加了mcf7癌细胞中的线粒体代谢和糖酵解二者。图10a
‑
10f显示使用250μm维生素c预处理三天的mcf7细胞的代谢谱数据。用250μm维生素c处理显著增加了基础呼吸、atp产生和最大呼吸。用250μm维生素c处理显著增加了糖酵解和糖酵解储备，同时降低了糖酵解储备能力。这些观察结果表明，单独的维生素c充当了温和的助氧化剂，并且通过线粒体氧化应激，该治疗剂刺激癌细胞中的线粒体生物发生，驱动增加的线粒体代谢(例如，增加线粒体蛋白合成和atp产生)。细胞中的细胞核线粒体蛋白和mt
‑
dna编码的蛋白质产生增加。该解释与实验数据一致，所述实验数据直接显示，具有一种或多种抑制大线粒体核糖体的抗生素、一种或多种抑制小线粒体核糖体的抗生素和助氧化剂的实施方案有效地根除癌细胞。特别地，线粒体生物发生抑制剂防止维生素c诱导的线粒体代谢增加。该组合抑制线粒体dna(mt
‑
dna)编码的蛋白质的合成，导致csc中oxphos必需的必需蛋白质组分的耗尽。在没有这些蛋白质的情况下，csc经历异常线粒体生物发生和严重的atp耗尽。
56.图11a和11b显示了低剂量维生素c和根据本途径的实施方案的三联组合的海马曲线(分别为ocr和ecar数据)。这些并行的代谢比较表明，低剂量维生素c(例如，足以在血液、血清和血浆中的至少一种中达到约500μm或更低的峰值维生素c浓度)增加氧化性线粒体代谢，而三联组合导致严重的atp耗尽。低剂量维生素c和三联组合二者均增加糖酵解。图12a
‑
12f示出了比较图11a和11b的代谢数据。低剂量维生素c增加了基础呼吸、atp产生和最大呼吸，而三联组合降低了所有三个参数。此外，低剂量维生素c和三联组合均增加糖酵解，同时降低糖酵解储备能力。这些结果表明，包含两种线粒体生物发生抑制剂(一种抑制大线粒体核糖体，另一种抑制小线粒体核糖体)以及维生素c阻碍并逆转维生素c诱导的线粒体氧化性代谢的增加。所有三种治疗剂的组合导致显著改善的抗癌活性。在本途径的一些实施方案中，维生素c(其包括充当还原剂的抗坏血酸盐衍生物)可以用诱导线粒体氧化应激的另一种药剂，例如某些化学治疗剂和放射治疗代替。
57.使用csc增殖作为量度，在临床前环境中评价了对本途径的功效进行预处理的时间效应。这些评价在开始3d乳腺球干细胞分析之前，通过预处理分析部分考虑了同时共同施用三种治疗剂(例如，抑制大线粒体核糖体的抗生素、抑制小线粒体核糖体的抗生素以及本实施方案中的维生素c)的功效。mcf7细胞生长为单层培养物，并首先用单独的维生素c(“vit c”，250μm)或强力霉素和阿奇霉素(“d a”，各1μm)预处理7天的时间段。然后，用胰蛋白酶收获mcf7细胞，并在维生素c、强力霉素和阿奇霉素的各种组合的存在下，在不依赖贴壁的生长条件下重新铺板培养。下表1显示，单独使用维生素c或使用强力霉素和阿奇霉素的组合(d a)预处理7天使随后施用的三联组合的效果显著更低。在机理上，似乎预处理有
效地使mcf7细胞预适应了强力霉素、阿奇霉素和维生素c的三联组合的作用。这可能是由于mcf7细胞诱导氧化应激的能力(驱动抗氧化反应)引起的。鉴于这些临床结果，本途径的同时共同施用所有三种治疗剂的实施方案对csc群体具有最显著的影响，并且是优选的。例如，在一个实施方案中，同时共同施用强力霉素(1μm)、阿奇霉素(1μm)和维生素c(250μm)将比依次施用这些组分更有效。然而，一些实施方案可能要求在窄的窗口内，例如1
‑
3小时内，在多天(例如，在一些实施方案中3
‑
7天，在一些实施方案中4
‑
14天)内施用治疗剂。在一些实施方案中，抗生素可以以口服形式(例如，丸剂或片剂)施用，而维生素c静脉内施用。在其他实施方案中，所有三种治疗剂可以作为单独的丸剂或片剂，或作为包含每种治疗剂的单一调配物口服施用。
[0058][0059]
表1
‑
施用本途径的组分的时间效应。
[0060]
施用的组分包括强力霉素(1μm)、阿奇霉素(1μm)和维生素c(250μm)。上标**表示p<0.01，***表示p<0.001，而****表示p<0.0001。
[0061]
这些结果表明，可以通过与另一种fda批准的抗生素，即阿奇霉素和膳食补充剂维生素c(温和助氧化剂)的组合来加强强力霉素对csc群体的抑制作用。因此，本途径提供具有一种或多种抑制大线粒体核糖体的抗生素、一种或多种抑制小线粒体核糖体的抗生素和一种或多种助氧化剂的药物组合物。实施方案可以包括，例如，阿奇霉素、强力霉素和维生素c。计划了未来临床试验和进一步的评价，以对本文所公开和提出的实施方案产生另外的数据。
[0062]
一些实施方案可以采用组合物的形式，例如具有药学有效量的每种治疗剂的药物组合物。所述组合物可以通过根除癌症干细胞，包括例如高能癌症干细胞、循环肿瘤细胞和治疗耐受性癌细胞来治疗癌症。该组合物可以用于使癌症干细胞对放射疗法、光疗法和/或化学疗法敏感。该组合物可以用于治疗和/或预防肿瘤复发、转移、耐药、放射疗法耐受和恶病质。组合物的实施方案可以包括抑制线粒体生物发生并靶向大线粒体核糖体的第一治疗剂、抑制线粒体生物发生并靶向小线粒体核糖体的第二治疗剂和诱导线粒体氧化应激的第三治疗剂作为活性成分。例如，在一些实施方案中，第一治疗剂是阿奇霉素，第二治疗剂是强力霉素，并且第三治疗剂是维生素c(或抗坏血酸衍生物)。第一和第二治疗剂二者中的至少一种的浓度可以是亚抗微生物的并且在一些实施方案中二者都是亚抗微生物的。例如，在一些实施方案中，阿奇霉素和强力霉素二者的浓度是亚抗微生物的。在一些实施方案中，第三治疗剂是维生素c，其浓度足以在血液、血清和血浆中的至少一种中达到100μm至250μm
的峰值维生素c浓度。
[0063]
在本途径下，可以使用一种或多种抑制大线粒体核糖体的抗生素和一种或多种抑制小线粒体核糖体的抗生素。红霉素(或大环内酯)家族中的抗生素，包括红霉素、阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素和克拉霉素，抑制大线粒体核糖体。抑制大线粒体核糖体的其他治疗剂包括大环内酯家族的其他成员、酮内酯家族的成员，酰胺醇家族的成员、林可酰胺(lincosamide)家族的成员、截短侧耳素家族的成员以及这些化合物的衍生物。应当理解，衍生物可以包括一种或多种膜靶向信号和/或线粒体靶向信号，如本文所述的。四环素家族中的抗生素，包括四环素、强力霉素、替加环素、伊拉瓦环素(eravacycline)和米诺环素，抑制小线粒体核糖体。抑制小线粒体核糖体的其他治疗剂包括四环素家族的其他成员、甘氨酰环素家族的成员、氟环素(fluorocycline)家族家族的成员、氨基糖苷家族的成员、噁唑烷酮家族的成员以及这些化合物的衍生物。应当理解，衍生物可以包括一种或多种膜靶向信号和/或线粒体靶向信号。本途径的优选实施方案包括阿奇霉素和强力霉素，但是应当理解，可以使用其他抗生素。此外，在一些实施方案中，抗生素中的一种或多种可以用至少一种膜靶向信号和/或线粒体靶向信号化学修饰，如以下讨论的。
[0064]
如上所讨论的，本途径的实施方案可以包括一种或多种助氧化剂。助氧化剂是通过抑制抗氧化剂系统和/或产生活性氧物质在生物体中诱导氧化应激的化合物。线粒体氧化应激会损害细胞，并且在csc中引起朝向线粒体生物发生的转变。一些维生素当其作为还原剂起作用时，是助氧化剂。例如，维生素c是一种有效的抗氧化剂，防止对脂质和其他大分子的氧化损伤，但在不同条件下作为助氧化剂起作用。例如，在低浓度(例如，在口服施用的药物组合物中，维生素c可以以足以在血液、血清和血浆中的至少一种中达到约500μm至约100μm，在一些实施方案约400μm至约150μm，以及在一些实施方案中约300μm至约200μm，以及在一些实施方案中约250μm的峰值维生素c浓度的量或浓度施用)下并且在金属离子的存在下，维生素c诱导线粒体氧化应激。应当理解，来自口服施用的血液/血清/血浆中的峰值维生素c浓度为约250μm，而通过静脉施用的峰值浓度可以明显更高。因此，作为本途径的另一个实例，其中维生素c被口服施用的一些实施方案可以使用足够的维生素c以在血液、血清和/或血浆中达到约100μm至约250μm的维生素c浓度。在该上下文中，术语“约”应理解为
±
10μm的近似值，但可能取决于用于测量血液、血清和/或血浆浓度的方法的准确度和精密度。一些实施方案可以包括足以在血液、血清和/或血浆中达到100μm至250μm的维生素c浓度的维生素c。应当理解，维生素c的合适剂量可能取决于本途径中使用的其他组分，因此普通技术人员可以使用本领域已知的方法评价给定实施方案的适宜剂量。除了维生素c之外，许多抗坏血酸盐衍生物在某些条件下可能具有助氧化剂行为。例如，抗坏血酸盐可以减少金属离子并通过芬顿反应产生自由基。抗坏血酸根通常非常稳定，但在包括铁(fe)的金属离子的存在下变得反应性更强，允许抗坏血酸根成为更强的助氧化剂。由于线粒体特别富含铁，它们可能成为维生素c的助氧化剂作用的关键靶标。维生素c在线粒体内是高度集中的。例如，当u937细胞(人白血病细胞系)在含有3μm维生素c的培养基中仅孵育15分钟时，它有效地运输到线粒体，达到5mm的水平(表示相对于剂量增加约1,700倍)。维生素c的线粒体运输是通过钠偶联的维生素c转运蛋白2(scvct2)实现的，该维生素c转运蛋白2也称为slc23a2，但是已经提出了其他新的线粒体转运蛋白。
[0065]
可以使用与维生素c结合或作为维生素c的替代品的其他助氧化剂治疗剂。因为许
多当前的化学治疗剂以及靶向放射，都通过它们的助氧化剂作用杀死癌细胞，然后线粒体生物发生的联合抑制可以用作常规疗法的补充，并将被预料到改善其功效。已知还有其他治疗剂在癌细胞中起到助氧化剂的作用，产生活性氧物质。有9类与氧化应激相关的化疗药物：蒽环类、铂/钯复合物、烷化剂、表鬼臼毒素、喜树碱、嘌呤/嘧啶类似物、抗代谢物、紫杉烷和生物碱。例如，抗癌治疗剂阿霉素(和其他蒽环类药物)、博来霉素和顺铂已显示对癌细胞的特异性毒性。因此，在一些实施方案中，使用一种药剂诱导线粒体氧化应激，联合使用抑制大线粒体核糖体的抗生素和抑制小线粒体核糖体的抗生素。计划进一步研究以确定具有助氧化剂作用的另外的治疗剂，以及施用诱导线粒体氧化应激的该替代药剂的时机。然而，维生素c明显具有比化学治疗剂较少的副作用，而且通常具有比化学治疗剂更好的安全性。应当理解，在不脱离本途径的情况下可以使用多种助氧化剂。
[0066]
csc具有显著增加的线粒体质量，这有助于它们进行不依赖贴壁的生长的能力。因此，使用线粒体生物发生的抑制剂以及维生素c可以最终阻止csc线粒体从维生素c的助氧化剂作用中完全恢复，因为这些靶细胞将无法重新合成新的线粒体。在代谢受限的条件下，癌细胞将经历“受挫”或“不完整”的线粒体生物发生。该主张得到了图11a、11b和12a
‑
12f所示的海马通量分析数据的直接支持，揭示了i)线粒体代谢降低，ii)代偿糖酵解功能增加，以及iii)严重的atp耗尽。先前的研究表明，在缺氧条件下，单独的维生素c使大鼠心脏中线粒体atp产生增加最多达1.5倍。此外，维生素c是内源性左旋肉碱生物合成的正调节剂，左旋肉碱是线粒体β
‑
氧化所需的必需微量营养素。因此，这些发现与目前的结果一致，表明单独的维生素c确实足以使mcf7细胞中线粒体atp产生增加最多达2倍。
[0067]
图13示出了根据本途径的实施方案的治疗机制。该过程可以用于例如根除样品或生物体中的csc、抗癌疗法、预防和/或消除复发和转移、治疗衰老和根除样品或生物体中的衰老细胞。在这种机制下，维生素c在促进助氧化剂行为s1301的条件下存在。施用的维生素c的浓度可被视为相对较低的剂量。例如，足以达到100μm至250μm的血液/血浆/血清水平的口服维生素c可能是合适的。线粒体富含铁，并且csc具有高的线粒体浓度。由于铁含量高，维生素c作为助氧化剂在csc中诱导线粒体氧化应激1303，产生活性抗坏血酸根。响应线粒体氧化应激，csc向线粒体生物发生转变1305。然而，抑制大线粒体核糖体的抗生素和抑制小线粒体核糖体的抗生素1307(如阿奇霉素和强力霉素)的存在防止csc获得足够的线粒体生物发生而从线粒体氧化应激中恢复。这导致csc中的线粒体灾变1309。然后csc经历atp耗尽1311，并(例如，通过细胞凋亡)最终死亡1313。
[0068]
本途径的实施方案中的治疗剂可以常用药物组合物的形式使用，所述药物组合物可以使用一种或多种已知方法制备。例如，药物组合物可以通过使用例如以下的稀释剂或赋形剂制备：例如本领域中已知的一种或多种填充剂、膨胀剂(bulking agent)、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等。可以根据一种或多种治疗目的选择不同类型的给药单元形式。药物组合物的形式的实例包括但不限于片剂、丸剂、粉剂、液体、悬浮液、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、栓剂、注射制剂(溶液剂和悬浮液)、局部乳膏剂、纳米颗粒、脂质体制剂以及本领域可能已知的其他形式。在一些实施方案中，治疗剂可以被包封在一起。作为另外的实例，在本途径下可以使用纳米颗粒或纳米载体形式的剂量，例如含有脂肪酸、胆固醇、磷脂(例如，磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱)、介孔二氧化硅和螺烯
‑
角鲨烯纳米装配体。为了将药物组合物成形为片剂形式，可以使用任何已知的赋形剂，例如载体，如乳糖、白糖、氯化钠、葡
萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、环糊精、结晶纤维素、硅酸等；粘合剂如水、乙醇、丙醇、单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液、羧甲基纤维素、虫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等。此外，可以使用崩解剂如干淀粉、藻酸钠、琼脂粉、海带粉、碳酸氢钠、碳酸钙、聚氧乙烯脱水山梨糖醇的脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸的甘油单酯、淀粉、乳糖等。可以使用崩解抑制剂，如白糖、硬脂精、椰子油、氢化油；吸收促进剂，例如季铵碱、十二烷基硫酸钠等。可以使用润湿剂，例如甘油、淀粉和本领域已知的其他润湿剂。可以使用吸附剂，例如诸如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶体硅酸等。可以使用润滑剂，如纯化滑石、硬脂酸盐、硼酸粉末、聚乙二醇等。如果需要片剂，可以进一步用常用的包衣材料进行包衣，以将片剂制成糖衣片剂、明胶薄膜衣片剂、肠溶衣包被的片剂、薄膜包被的片剂、双层片和多层片。适合用于局部给药的药物组合物可以配制成软膏剂、乳膏剂、悬浮液、洗剂、粉剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、泡沫剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。这样的药物组合物可包括常规添加剂，其包括但不限于防腐剂、帮助药物渗透的溶剂、助溶剂、润肤剂、推进剂、粘度调节剂(胶凝剂)、表面活性剂和载体。应当理解，如本领域已知的，维生素c或另一种抗坏血酸盐化合物可以通过经由注射器或静脉内导管直接施用到静脉循环中的溶液来施用。
[0069]
本途径可以用于治疗和/或预防肿瘤复发、转移、耐药、恶病质和/或放射疗法耐受。因为肿瘤复发或转移，尤其是在手术后，所以抗癌治疗经常失败。此外，耐药和放射疗法耐受是癌症治疗失败的常见原因。认为csc线粒体活性可能至少部分是造成治疗失败的原因。本途径的实施方案可用于常规癌症疗法失败的情况，和/或与抗癌治疗结合以防止由于肿瘤复发、转移、化学疗法耐受、耐药和/或放射疗法耐受导致的失败。
[0070]
如上所述，本途径的实施方案还可以用于预防、治疗和/或逆转癌细胞的耐药。耐药被认为至少部分基于癌细胞中线粒体功能的增加。特别地，预期对内分泌疗法，如他莫昔芬表现出耐药的癌细胞具有增加的线粒体功能。本途径的实施方案抑制线粒体功能，因此可用于降低和在某些情况下逆转癌细胞的耐药。因此，在显示耐药的情况下，可施用本途径的实施方案。可以在常规化学疗法治疗之前和/或与常规化学疗法治疗一起和/或在常规化学疗法治疗之后施用本文所讨论的药物组合物。此外，靶向线粒体核糖体的线粒体功能抑制剂还可以靶向细菌和致病酵母，靶向衰老细胞(从而提供抗衰老益处)，充当放射增敏剂和/或光增敏剂，使大量癌细胞和癌症干细胞对化学治疗剂、药物和/或其他天然物质，例如膳食补充剂和热量限制敏感。
[0071]
关于抗衰老的益处，衰老细胞对身体正常的健康生态系统是有毒性的。本途径在一些实施方案中可以选择性杀死衰老细胞，同时饶过正常组织细胞。选择性杀死衰老细胞可以：1)通过防止获得衰老相关的分泌表型(sasp)来预防衰老相关的炎症，所述衰老相关的分泌表型(sasp)将衰老的成纤维细胞转变为具有促进肿瘤进展能力的促炎细胞；2)促进组织修复和再生；和/或3)增加生物体寿命和健康寿命。实施方案也可以用于选择性地杀死由于致癌应激的发作而经历致癌基因诱导的衰老的衰老癌细胞。
[0072]
一些实施方案可以采用抗癌试剂盒的形式。抗癌试剂盒可以包含一种或多种根据本途径的组分。例如，抗癌试剂盒可以包含抑制大线粒体核糖体的第一抗生素、抑制小线粒体核糖体的第二抗生素和诱导线粒体氧化应激的助氧化剂或药剂。抗癌试剂盒可以包含足够剂量的每种组分持续特定的治疗周期或预定时间，例如一周或一个月。图18示出了根据一个实施方案的示例性抗癌试剂盒1401。在该实施方案中，抗癌试剂盒1801包括一周的剂
量；2片阿奇霉素片(“azith”)、14片强力霉素片(“doxy”)和7片维生素c片(“vit c”)。每个组分的量可以如本文所述。抗癌试剂盒1401可以包括确认每种组分应该何时被服用的时间、日期或天数指示物，以及其他可能合适的提醒。应当理解，抗癌试剂盒可以包括持续较短或较长时间段，例如两周治疗或一个月治疗的足够剂量。
[0073]
本途径有利地相对于正常健康细胞靶向csc表型。靶癌细胞可以是csc、高能癌症干细胞(e
‑
csc)、循环肿瘤细胞(ctc，种子细胞，导致肿瘤另外在远处器官中的的后续生长，一种导致大部分癌症相关死亡的机制)和治疗耐受性癌细胞(trcc，对化学疗法、放射疗法和其他常见癌症治疗中的产生一种或多种产生耐受的细胞)中的至少一种。如于2018年6月19日提交的本技术人的共同未决美国临时专利申请第62/686,881号和2018年9月14日提交的第62/731,561号专利申请中所述并且以引用方式整体并入，e
‑
csc代表与增殖相关的csc表型。除了主体(bulk)癌细胞和csc之外，应当理解，本途径可以用于靶向本发明人称为e
‑
csc的过度增生的细胞亚群，其显示干细胞性标志物(aldh活性和乳腺球形成活性)逐渐增加，线粒体质量高度升高，且糖酵解和线粒体活性增加。具有抑制大线粒体核糖体的第一抗生素和抑制小线粒体核糖体的第二抗生素的组合物可以与助氧化剂一起施用，以靶向这样的癌细胞表型，并有益地预防、治疗和/或减少肿瘤复发、转移、耐药、放射疗法耐受和/或恶病质。用膜靶向信号和/或线粒体靶向信号对这些治疗剂中的一种或多种进行化学修饰增强了被修饰的治疗剂在线粒体中的摄取，并因此增强该药剂的效力。
[0074]
因此，本途径的一些实施方案可以包括一种或多种用膜靶向信号和/或线粒体靶向信号化学修饰的治疗剂。膜靶向信号可以是脂肪酸，并且在优选的实施方案中，是棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸中的一种。线粒体靶向信号的实例包括亲脂性阳离子，例如tpp和tpp衍生物。于2018年11月21日提交的本技术人的共同未决国际专利申请第pct/us2018/062174号通过引用整体并入。三苯基鏻及其衍生物是有效的线粒体靶向信号，用于靶向“主体”癌细胞、癌症干细胞和“正常”衰老细胞(成纤维细胞)，而不会杀死正常的健康细胞。示例性tpp衍生物包括：(1)2
‑
丁烯
‑
1,4
‑
双
‑
tpp；(2)2
‑
氯苄基
‑
tpp；(3)3
‑
甲基苄基
‑
tpp；(4)2,4
‑
二氯苄基
‑
tpp；(5)1
‑
萘基甲基
‑
tpp。还应注意的是，tpp衍生物还可以具有衍生物。例如，靶向线粒体的化合物可以是tpp衍生物，其为以下中的至少一种：2
‑
丁烯
‑
1,4
‑
双
‑
tpp；2
‑
氯苄基
‑
tpp；3
‑
甲基苄基
‑
tpp；2,4
‑
二氯苄基
‑
tpp；1
‑
萘基甲基
‑
tpp；对亚二甲苯基双
‑
tpp；2
‑
丁烯
‑
1,4
‑
双
‑
tpp的衍生物；2
‑
氯苄基
‑
tpp的衍生物；3
‑
甲基苄基
‑
tpp的衍生物；2,4
‑
二氯苄基
‑
tpp的衍生物；1
‑
萘基甲基
‑
tpp的衍生物；和对亚二甲苯基双
‑
tpp的衍生物。在一些实施方案中，亲脂性阳离子10
‑
n
‑
壬基吖啶橙也可以用作线粒体靶向信号。应当理解，这些靶向信号实例并非穷举。
[0075]
以下段落涉及与膜靶向信号缀合的治疗剂。膜靶向信号的实例包括脂肪酸，例如棕榈酸酯、硬脂酸酯、肉豆蔻酸酯和油酸酯。短链脂肪酸，即具有少于6个碳原子的脂肪酸，也可以用作膜靶向信号。短链脂肪酸的实例包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸。膜靶向信号也可以是一种或多种具有6
‑
12个碳原子的中链脂肪酸。缀合治疗剂的优选实施方案具有包含至少11个碳且至多21个碳的脂肪酸部分。
[0076]
在一些实施方案中，缀合化合物中的脂肪酸部分可包含通式其中x表示治疗剂上结合脂肪酸部分的取代位置，并且“n”为1
‑
20，且优选为10
‑
20的整数。如本
文所述并考虑到本技术使用术语“脂肪酸部分”，本途径的一些实施方案可以包括包含具有通式的脂肪酸部分的缀合化合物，其中x代表治疗剂上结合脂肪酸部分的取代位置，并且“n”为1
‑
20，且优选为10
‑
20的整数。
[0077]
可以使用本领域可用的技术合成具有脂肪酸部分的缀合物。例如，强力霉素和肉豆蔻酸的缀合物可以通过肉豆蔻酰化合成。可以使用本领域已知的用于合成缀合物的其他技术。应当理解，这不是膜靶向信号的完整列表，并且在不脱离本途径的情况下可以使用未列出的膜靶向信号。脂肪酸靶向信号在药物递送方面提供了额外的益处。脂肪酸促进缀合的化合物掺入基于脂质的纳米颗粒或由一个或多个同心磷脂双层组成的囊泡中。例如，于1988年8月2日颁发的美国专利4,761,288描述了可用于一些实施方案中的脂质体药物递送系统，并通过引用整体并入。这些脂质体药物递送实施方案提供更有效的药物递送，因为在递送和初始代谢期间消耗的活性成分较少。
[0078]
在本途径的实施方案中可以使用一种或多种与膜靶向信号例如脂肪酸部分缀合的治疗剂。尽管短链和中链脂肪酸可以用作靶向信号，但具有至少11个碳且最多21个碳的脂肪酸在治疗剂的csc抑制方面提供了最大的改善。具有月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸的缀合物显示出治疗剂抑制和优先保留特性的显著改善。作为示意性实例，强力霉素
‑
肉豆蔻酸酯缀合物的实施方案已显示出比单独的强力霉素更强的效力。图14比较了强力霉素(“dox”)和显示为化合物[1](注意，本技术也将化合物[1]称为强力霉素和肉豆蔻酸的缀合物)的强力霉素
‑
肉豆蔻酸酯偶联物(“dox
‑
m”)的mcf7细胞的乳腺球分析结果，见下文。数据代表暴露于化合物后的乳腺球计数，作为对照的百分比。测试了1.5μm、3μm、6μm和12μm浓度的化合物。可以看出，在每个浓度，强力霉素
‑
肉豆蔻酸酯缀合物都比未缀合的强力霉素更有效。在高于3μm的浓度，效力显著更明显。与脂肪酸，特别是具有11
‑
21个总碳的脂肪酸部分缀合的其他四环素家族成员和红霉素家族成员观察到类似的行为。
[0079]
图15是显示强力霉素和显示为化合物[1]的强力霉素
‑
肉豆蔻酸酯缀合物(doxy
‑
myr)在更宽的化合物浓度范围内的乳腺球分析结果的线图。顶部曲线代表暴露于强力霉素的mcf7细胞的乳腺球计数(作为相比于对照的百分比)。底部曲线代表暴露于强力霉素
‑
肉豆蔻酸酯缀合物的mcf7细胞的乳腺球计数。在2.5μm时，单独的强力霉素在对mcf7细胞的乳腺球测定中具有很小的影响或没有影响。相比之下，相对于对照，2.5μm的强力霉素
‑
肉豆蔻酸酯缀合物抑制了40
‑
60％的mcf7乳腺球形成。基于这些数据，强力霉素的半数最大抑制浓度(ic
50
)为18.1μm，强力霉素
‑
肉豆蔻酸酯缀合物的ic
50
为3.46μm。这表明强力霉素
‑
肉豆蔻酸酯缀合在抑制csc增殖方面是强力霉素的5倍以上。
[0080][0081]
图16a
‑
16c是比较强力霉素
‑
肉豆蔻酸酯缀合物与未缀合的强力霉素的细胞保留
的图像。在10μm浓度的任一种治疗剂(即强力霉素
‑
肉豆蔻酸酯缀合物或未缀合的强力霉素)的存在下，将mcf7细胞在组织培养基中培养72小时。然后，用pbs洗涤细胞，并通过来自四环素环结构的激发的绿色自发荧光观察细胞内保留的任何治疗剂。对照细胞与单独的溶媒一起孵育。图16a是未处理的对照，图16b显示强力霉素
‑
肉豆蔻酸酯缀合物化合物[1]的保留，而图16c显示强力霉素的保留。图像中的原始颜色已被反转以提高再现性，并且图16b的较暗区域表明缀合的治疗剂的细胞保留增加。通过比较图16a
‑
16c可以看出，图16b的暗度和强度表明与单独的强力霉素相比，强力霉素
‑
肉豆蔻酸酯缀合物具有显著改善的细胞保留。与缀合到其他靶向信号的其他治疗剂相当的结果应被预料到。
[0082]
与未缀合的治疗剂相比，与靶向信号缀合的治疗剂的实施方案在主体癌细胞和正常成纤维细胞中显示出较低的毒性。例如，图17a和17b分别显示了强力霉素和显示为化合物[1]的强力霉素
‑
肉豆蔻酸酯缀合物针对主体mcf7细胞和主体bj细胞的细胞活力数据。数据代表以对照百分比表示的细胞活力。从图17a和17b二者中可以看出，强力霉素
‑
肉豆蔻酸酯缀合物在测试的浓度范围内，甚至在20μm的浓度的毒性比强力霉素低。在与靶向信号缀合的其他治疗剂中也观察到了类似的行为。
[0083]
应当理解，化合物[1]的强力霉素
‑
肉豆蔻酸酯缀合物是根据本途径的缀合治疗剂的一个实例，并且考虑了许多其他的缀合治疗剂。以下所示的化合物[2]代表与脂肪酸部分缀合的强力霉素的通用结构。“n”为1
‑
20，且优选为10
‑
20的整数。例如，“n”为12产生具有肉豆蔻酸部分的缀合物。尽管在本实施例中使用了强力霉素，但应当理解，四环素家族的其他成员(即，靶向小线粒体核糖体的具有并四苯核的抗生素)可以用作治疗剂，包括例如但不限于，替加环素、米诺环素。化合物[3]是四环素衍生物的通用化学结构，在并四苯核环上带有用于当前描述的标记。应当理解，四环素衍生物具有连接到并四苯核的不同官能团，并且化合物[3]主要用于说明取代位置并提供标记系统。使用化合物[3]中所示的标记，化合物[2]中所示的脂肪酸部分取代在并四苯核的被称为d环上的r9位处。应当理解，也可以使用其他取代位置。例如如化合物[3]的通用结构所示，d环的r7和r8位是取代的另外选择。然而，通常a环上的二甲氨基和酰胺基团对抗生素活性很重要，这也取决于b环和c环的立体化学构型。
[0084][0085]
根据本途径，如上所示的化合物[4]是具有强力霉素和脂肪酸部分的缀合治疗剂的另一个实例。在该实施方案中，脂肪酸部分取代在d环的r8位处。“n”是1
‑
20，且优选为10
‑
20的整数。如下所示的化合物[5a]示出了根据本途径的另一个实施方案的四环素
‑
脂肪酸缀合物的实例。在该实例中，脂肪酸部分取代在d环的r9位处，但应当理解，如已经描述的，脂肪酸部分可以取代在其他位置。以下的化合物[5b]显示了与膜靶向信号缀合的四环素家族成员的另一个实施方案。在化合物[5b]中，米诺环素结构具有取代在d环的r9位处的脂肪酸部分。当然，如上讨论的，脂肪酸部分可以取代在别处。对于化合物[5a]和[5b]，“n”为1
‑
20，优选为10
‑
20的整数。
[0086][0087]
治疗剂缀合物的先前实例已涉及四环素家族成员。应当理解，本途径还考虑了具有膜靶向信号的红霉素家族成员的缀合物。以下化合物[6]、[7]和[8]显示了阿奇霉素、罗红霉素和泰利霉素的结构，它们是本领域已知的红霉素家族中fda批准的抗生素的实例。
[0088][0089]
大环内酯结构提供了几个潜在的取代位置。该描述提出了红霉素家族缀合物的两个系列的化学式。以下化合物[9a]、[9b]、[10a]、[10b]、[11a]和[11b]分别显示了阿奇霉素缀合物、罗红霉素缀合物和泰利霉素缀合物的通用结构。每个通用结构都显示具有多个r基团，表示可能的取代位置。在本途径的一些实施方案中，一个r基团可以是靶向信号，例如膜靶向信号或线粒体靶向信号，而剩余的r基团则是通常存在于该结构中的部分(例如，如化合物[6]
‑
[8]中所示)。在一些情况下，nh
‑
r基团可以是n(ch3)2，如下所讨论的。
[0090]
[0091]
[0092][0093]
红霉素家族缀合物的第一系列通式由化合物[9a]、[10a]和[11a]表示。从化合物[9a]开始，化合物[9a](阿奇霉素缀合物)中的r2可以是脂肪酸部分，然后r1、r3、r4和r5中的每一个可以是阿奇霉素通常存在的部分，如化合物[6]所示，即分别是h、h、脱氧糖(红霉脱氧糖胺)和脱氧糖(红霉支糖)。应当理解，靶向信号部分可以相反地取代另一个位置，而不是如本实施例中使用的r2。化合物[10a]显示了罗红霉素缀合物的第一个通式。化合物[10a]中的r1可以是脂肪酸部分，然后r2‑
r6中的每个可以是罗红霉素通常存在的部分，如化合物[7]所示。作为另一个实例，化合物[11a]的泰利霉素缀合物，r3可以包含靶向信号，然后r1和r2可以是罗红霉素通常存在的部分，如化合物[8]中所示(例如，r1是氨基甲酸酯环上的芳基
‑
烷基部分，而
–
nhr2变成
–
n(ch3)2，即红霉脱氧糖胺糖环)。
[0094]
以上显示的第二系列通式显示了根据本途径的另外的实施方案的缀合物。化合物[9b]显示了根据一些实施方案的阿奇霉素缀合物的第二通式，其中官能团r1和r2可以相同或可以不同，并且其一个或两者是靶向信号。例如，r1和/或r2可以是靶向信号，并且如果不相同，则另一个r保持与化合物[6]中所示的相同。例如，r1可以是甲基，且r2可以是靶向信号，例如脂肪酸部分。作为另一个实例，r1可以是靶向信号，且nh
‑
r2可以是
‑
n(ch3)2。
[0095]
化合物[10b]显示根据一些实施方案的罗红霉素缀合物的第二通式，其中官能团r1和r2可以是相同的或可以是不同的，并且其一个或两者可以是靶向信号。例如，r1和/或r2可以是如上所讨论的脂肪酸部分，而其他的可以与化合物[7]中所示的相同。作为使用化合物[10b]的另一个实例，r1可以是甲氧基，例如在罗红霉素中存在的o
‑
ch2‑
o
‑
(ch2)2‑
och3，且r2可以是靶向信号，例如脂肪酸部分。作为另一个实例，r1可以是靶向信号，且nh
–
r2可以是n(ch3)2。
[0096]
化合物[11b]显示了泰利霉素缀合物的第二通式，其中官能团r1和r2可以是相同的或可以是不同的，并且其一个或二者可以是靶向信号。例如，r1和/或r2可以是如上所讨论的膜靶向信号或线粒体靶向信号。例如，r1可以是烷基
‑
芳基，例如存在于泰利霉素氨基甲酸酯环上的例如并且r2可以是靶向信号。作为另一个实例，r1可以是靶向信号，而
–
nh
‑
r2可以是
–
n(ch3)2。
[0097]
以下化合物[12a]、[13a]和[14a]显示了根据本途径的红霉素家族成员缀合物的具体实例，其使用上述缀合物的第一系列通用结构。在化合物[12]中，r5已被脂肪酸部分的通用结构取代，而其他取代位置具有在阿奇霉素结构上发现的正常成分。在化合物[13]中，
r5已被脂肪酸部分的通用结构取代，而其他取代位置具有在罗红霉素结构上存在的正常成分。在化合物[14]中，r3已被脂肪酸部分的通用结构取代，而其他取代位置具有泰利霉素结构上存在的正常成分。在这些实例中，“n”为1
‑
20，优选为10
‑
20的整数。例如，其中脂肪酸部分是肉豆蔻酸酯的化合物[12a]、[13a]和[14a]的实施方案已显示与未缀合的抗生素相比，在csc抑制活性和细胞保留方面的改善。应当理解，该方法可以用于形成红霉素家族成员和靶向信号部分的许多缀合物。
[0098][0099]
[0100]
以下化合物[12b]、[13b]和[14b]显示了根据本途径的红霉素家族成员缀合物的具体实例，并且使用了以上显示的第二系列的通用结构。在化合物[12b]中，r1已被脂肪酸部分的通用结构取代，其中“n”为1至20，优选10至20的整数，并且其他取代位置具有在阿奇霉素结构上存在的正常成分。在化合物[13b]中，r2已被与化合物[12b]中相同的脂肪酸部分的通用结构取代，而另一个取代位置r1具有罗红霉素结构上存在的正常成分。作为基于第二个泰利霉素缀合物通式的实例，化合物[14b]在r1处具有相同的脂肪酸通用结构，而nh
‑
r2相反地为在泰利霉素结构上存在的n(ch3)2。在这些实例中，“n”为1
‑
20，优选为10
‑
20的整数。例如，其中脂肪酸部分是肉豆蔻酸酯的红霉素和脂肪酸缀合物的实施方案，例如化合物[12a]、[12b]、[13a]、[13b]、[14a]和[14b]中所示的，已显示与未缀合的抗生素相比，在csc抑制活性和细胞保留方面的改善。应当理解，该方法可以用于形成红霉素家族成员和靶向信号部分的多种缀合物。
[0101]
[0102]
以下是使用如上式[11b]所示的通用结构的泰利霉素和脂肪酸部分的缀合物的具体实例的实施方案。在该实例中，如式[14c]所示，r1保持与未缀合的泰利霉素相同，而脂肪酸部分在r2处，其中n为1
‑
20，优选为10
‑
20的整数。在式[14c]的优选实施方案中，n为12，并且所得缀合物已显示与未缀合的抗生素相比在csc抑制活性和细胞保留方面的显著改善。
[0103][0104]
如下所示的化合物[15]示出了与肉豆蔻酸酯缀合的红霉素家族成员阿奇霉素的一个实施方案。脂肪酸部分取代在化合物[9b]中的r2位置处，而r1仍为甲基。与单独的阿奇霉素相比，如化合物[15]所示的缀合物已显示对csc具有改善的效力和选择性，并且可以在本途径的实施方案中用作治疗剂。
[0105][0106]
在转向具有亲脂性阳离子的缀合物之前，下面简要讨论抗坏血酸(维生素c)与脂肪酸的缀合物。一些实施方案可以使用与膜靶向信号缀合的助氧化剂治疗剂。其他治疗剂也可以与膜靶向信号缀合。特别地，维生素c的衍生物(例如，抗坏血酸盐)可以与脂肪酸部分缀合。例如，抗坏血酸棕榈酸酯是抗坏血酸和棕榈酸的酯，通常以大剂量作为脂溶性维生素c来源和抗氧化食品添加剂使用。本途径的实施方案可以使用抗坏血酸棕榈酸酯作为助氧化剂。本途径的一些实施方案可以使用与靶向信号缀合的维生素c的衍生物，与或不与也具有靶向信号部分的治疗剂一起使用。其中治疗性化合物与脂肪酸缀合用于脂质体药物递送的实施方案可以包括抗坏血酸棕榈酸酯或其他与脂肪酸的缀合物，用于在实施方案中共同改善每种治疗剂的包装和递送。以下化合物[s]是与脂肪酸缀合的维生素c衍生物的通用结构，其中n为1
‑
20，优选为10
‑
20的整数。
[0107][0108]
如上所述，一种或多种治疗性化合物可以采取与线粒体靶向信号缀合的抗生素的形式。以下段落描述了其中治疗剂与线粒体靶向信号缀合的实施方案，通常通过使用间隔臂和/或连接基团。线粒体靶向信号的实例包括亲脂性阳离子，例如tpp、tpp衍生物、基于胍盐的部分、基于喹啉鎓的部分和10
‑
n
‑
壬基吖啶橙。在一些实施方案中，胆碱酯、罗丹明衍生物、吡啶鎓、(e)
‑4‑
(1h
‑
吲哚
‑3‑
基乙烯基)
‑
n
‑
甲基吡啶鎓碘化物(f16)和磺酰脲衍生物，如二氮嗪，也可以用作线粒体靶向信号。tpp
‑
衍生物的实例包括例如，2
‑
丁烯
‑
1,4
‑
双
‑
tpp；2
‑
氯苄基
‑
tpp；3
‑
甲基苄基
‑
tpp；2,4
‑
二氯苄基
‑
tpp；1
‑
萘基甲基
‑
tpp；或对亚二甲苯基双
‑
tpp。tpp
‑
衍生物化合物2
‑
丁烯
‑
1,4
‑
双
‑
tpp可以用于一些优选的实施方案中。应当理解，这不是线粒体靶向信号的完整列表，并且在不脱离本途径的情况下可以使用未列出的线粒体靶向信号。
[0109]
以下实例用于显示四环素化合物与线粒体靶向信号的缀合物。先前对可能取代位置的描述(例如，关于化合物[3]和[9a]
‑
[11b])适用于具有线粒体靶向信号的缀合物。在一些实施方案中，治疗剂可以使用如上所述的连接基团和/或化学间隔臂与tpp缀合。此外，应当理解，许多连接基团是本领域已知的，并且可以用于形成具有本文所述的线粒体靶向信号的缀合物。例如，在此通过引用整体并入的对应于1998年11月25日提交的国际专利申请pct/nv98/00172的国际专利申请公开案wo 99/26582描述了式tpp
‑
x
‑
r z
‑‑
的用途，其中z是阴离子，x是连接基团，并且r是治疗剂。在一些实施方案中，x可以是c1‑6烷基。作为另一个实例，通过引用整体并入的对应于2010年4月16日提交的国际专利申请pct/us2010/031455的国际专利申请公开案wo 2010/141177描述了在本途径中使用的多个“连接部分”的实例。
[0110]
化合物[16a]示出了通过在被称为d环上的r9位处的连接基团
‑
nhc(o)
‑
和间隔臂(ch2)
n
与线粒体靶向信号(在这种情况下为tpp)缀合的四环素衍生物(在这种情况下为四环素)的通式，其中“n”是1
‑
20的整数。以下化合物[16a]示出了与tpp阳离子缀合的强力霉素的实例，所述tpp阳离子通过示意性5碳间隔臂和r9位的酰胺连接基团栓系(tether)。
[0111][0112]
使用化合物[9a]
‑
[11b]中所示的取代位置，也可以形成红霉素家族成员和线粒体靶向信号的缀合物。为简洁起见，不再赘述这些结构，并且将仅提供一个示意性实施方案。以下所示的化合物[17]示出了通过示意性4
‑
碳间隔臂和酰胺连接基团与tpp缀合的红霉素家族成员阿奇霉素。应当理解，如上所述，可以形成红霉素家族成员和线粒体靶向信号的许多其他缀合物。
3.02min。
[0119][0120]
实施例3
–
强力霉素和脂肪酸的缀合物。(4s,5s,6r,12as)
‑4‑
(二甲基氨基)
‑9‑
(十二酰基氨基)
‑
3,5,10,12,12a
‑
五羟基
‑6‑
甲基
‑
1,11
‑
二氧代
‑
4a,5,5a,6
‑
四氢
‑
4h
‑
并四苯
‑2‑
甲酰胺。以下所示的化合物[20]根据实施例1中的方法制备。lc
‑
ms 642.1[m h]

,rt 2.42min。
[0121][0122]
实施例4
–
强力霉素和tpp的缀合物(为草酸盐形式)。[6
‑
[[(5r,6s,7s,10as)
‑9‑
氨基甲酰基
‑7‑
(二甲基氨基)
‑
1,6,8,10a,11
‑
五羟基
‑5‑
甲基
‑
10,12
‑
二氧代
‑
5a,6,6a,7
‑
四氢
‑
5h
‑
并四苯
‑2‑
基]氨基]
‑6‑
氧代
‑
己基]
‑
三苯基鏻草酸盐。以下所示的化合物[21]根据实施例1中的方法制备，不同的是通过制备型hplc(方法b)纯化。lc
‑
ms 409.7[m1/2]

,rt 1.53min。
[0123][0124]
实施例5
–
阿奇霉素缀合物的前体。(2r,3s,4r,5r,8r,10r,11r,12s,13s,14r)
‑2‑
乙基
‑
3,4,10
‑
三羟基
‑
13
‑
[(2s,4r,5s,6s)
‑5‑
羟基
‑4‑
甲氧基
‑
4,6
‑
二甲基
‑
四氢吡喃
‑2‑
基]氧基
‑
11
‑
[(2s,3r,4s,6r)
‑3‑
羟基
‑6‑
甲基
‑4‑
(甲基氨基)四氢吡喃
‑2‑
基]氧基
‑
3,5,6,8,10,12,14
‑
七甲基
‑1‑
氧杂
‑6‑
氮杂环十五烷
‑
15
‑
酮。化合物[22]根据vujasinovic,ines等人的novel tandem reaction for the synthesis of n
’‑
substituted 2
‑
imino
‑
1,3
‑
oxazolidines from vicinal(sec
‑
or tert
‑
)amino alcohol of desosamine.eur.j.org.chem.2011,2507
‑
2518制备。lc
‑
ms 735.3[m h]

,rt 0.97min。
[0125]
[0126]
实施例6
–
阿奇霉素
‑
脂肪酸缀合物。n
‑
[(2s,3r,4s,6r)
‑2‑
[[(2r,3s,4r,5r,8r,10r,11r,12s,13s,14r)
‑2‑
乙基
‑
3,4,10
‑
三羟基
‑
13
‑
[(2s,4r,5s,6s)
‑5‑
羟基
‑4‑
甲氧基
‑
4,6
‑
二甲基
‑
四氢吡喃
‑2‑
基]氧基
‑
3,5,6,8,10,12,14
‑
七甲基
‑
15
‑
氧代
‑1‑
氧杂
‑6‑
氮杂环十五烷
‑
11
‑
基]氧基]
‑3‑
羟基
‑6‑
甲基
‑
四氢吡喃
‑4‑
基]
‑
n
‑
甲基
‑
十四酰胺。化合物[23]根据实施例1中的方法由(2r,3s,4r,5r,8r,10r,11r,12s,13s,14r)
‑2‑
乙基
‑
3,4,10
‑
三羟基
‑
13
‑
[(2s,4r,5s,6s)
‑5‑
羟基
‑4‑
甲氧基
‑
4,6
‑
二甲基
‑
四氢吡喃
‑2‑
基]氧基
‑
11
‑
[(2s,3r,4s,6r)
‑3‑
羟基
‑6‑
甲基
‑4‑
(甲基氨基)四氢吡喃
‑2‑
基]氧基
‑
3,5,6,8,10,12,14
‑
七甲基
‑1‑
氧杂
‑6‑
氮杂环十五烷
‑
15
‑
酮制备，不同的是使用hctu代替hbtu，并在硅胶上进行最终纯化(2.5％nh3于meoh(7m)/dcm中)。lc
‑
ms 946.4[m h]

,rt 2.48min。
[0127][0128]
在一些实施方案中，治疗剂中的一种或多种可以是具有环糊精化合物例如α
‑
环糊精、β
‑
环糊精、γ
‑
环糊精及其衍生物的包合复合物的一部分。在一些实施方案中，环糊精衍生物可包括之前段落中描述的一种或多种靶向信号。在一些实施方案中，环糊精包合复合物可以增加治疗剂向靶组织的递送。
[0129]
应当理解，本途径的实施方案可以具有除了抗癌活性之外的有利益处。在一些实施方案中，例如，组合物具有放射增敏活性和光增敏活性中的至少一种。在一些实施方案中，组合物使癌细胞对化学治疗剂、天然物质和热量限制中的至少一种敏感。在一些实施方案中，组合物选择性地杀死衰老细胞。本途径的实施方案也对提高健康寿命和寿命具有意义，因为衰老是许多人类癌症类型发展的最重要的风险因素之一。阿奇霉素本身是一种fda批准的药物，具有显著的抗衰老药物活性，靶向并去除衰老的成纤维细胞，如肌成纤维细胞。这种抗衰老药物活性具有相当高的效率，几乎接近97％。促炎衰老细胞的累积被认为是许多衰老相关的疾病，例如心脏病、糖尿病、痴呆和癌症的主要原因。由于癌症相关的成纤维细胞(caf)是衰老的肌成纤维细胞，具有肿瘤促进活性，因此本途径的具有阿奇霉素的三联组合实施方案也可以有效地靶向侵袭性和转移性癌症的糖酵解肿瘤基质，尤其是那些携带“反向沃伯格效应”的代谢标志的癌症。在一些实施方案中，组合物防止获得衰老相关的分泌表型。在一些实施方案中，该组合物促进组织修复和再生。在一些实施方案中，该组合物增加生物体寿命和健康寿命中的至少一种。
[0130]
本途径的实施方案还可以采取用于治疗肿瘤复发、转移、耐药、恶病质和放射疗法耐受中的至少一种的方法的形式。应当理解，本途径可以用来提供制备用于治疗肿瘤复发、转移、耐药、恶病质和放射疗法耐受中的至少一种的药物的化合物。在一些实施方案中，可以在常规癌症治疗之后施用根据本途径的方法。在其他实施方案中，本途径可以先于常规癌症治疗，例如以预防或降低复发、转移和/或耐药的可能性。在其他实施方案中，本途径可
以与常规癌症治疗结合使用。
[0131]
以下段落描述了与以上提供的实验室结果和分析关联使用的方法和材料。细胞系和试剂：mcf7细胞为er( )人乳腺癌细胞系，最初购自美国典型培养物保藏中心(atcc)，目录号为htb
‑
22。强力霉素、阿奇霉素和抗坏血酸(维生素c)自sigma
‑
aldrich,inc商购获得。
[0132]
乳腺球形成分析：使用酶促解聚(1x胰蛋白酶
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edta,sigma aldrich,#t3924)和手动解聚(25号针)制备单细胞悬浮液。在称为“肿瘤球板”的预涂覆(2
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羟乙基甲基丙烯酸酯)(聚
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hema，sigma，#p3932)的培养皿中，在非贴壁条件下，将细胞以500个细胞/cm2的密度铺在乳腺球培养基(dmem
‑
f12 b27 20ng/ml egf penstrep)中。单独的溶媒(dmso)并行处理对照细胞。使细胞生长5天并保持在37℃的加湿培养箱中。培养5天后，使用目镜(“格子线(graticule)”)对>50μm的3d乳腺球进行计数，并计算形成球体的铺板细胞百分比，并称为乳腺球形成百分比(mfe，并标准化为1(1＝100％msf)。
[0133]
代谢通量分析：使用海马细胞外通量(xfe96)分析仪(seahorse bioscience,usa)测定mcf7细胞的实时耗氧率(ocr)和细胞外酸化率(ecar)。简言之，将每孔1.5x104个细胞接种到xfe96孔细胞培养板中，并孵育过夜以允许细胞附着。然后，用抗生素处理细胞72小时。单独的溶媒并行处理对照细胞。孵育72小时后，将细胞在预热的xf测定培养基中洗涤(或对于ocr测量，为补充有10mm葡萄糖、1mm丙酮酸、2mm l
‑
谷氨酰胺并调节至7.4ph的xf测定培养基)。然后将细胞维持在37℃的非co2培养箱中的175μl/孔的xf测定培养基中，培养1小时。在孵育时间期间，我们将在xf测定培养基中的25μl的80mm葡萄糖、9μm寡霉素和1m 2
‑
脱氧葡萄糖(用于ecar测量)或10μm寡霉素、9μm fccp、10μm鱼藤酮、10μm抗霉素a(用于ocr测量)上样到xfe96传感器盒的进样口。测量通过蛋白质含量(bradford测定)标准化。使用xfe96软件和graphpad prism软件，使用单因素方差分析和学生t检验计算分析数据集。所有实验一式五份，独立进行三次。
[0134]
失巢凋亡耐受的存活/死亡分析：在用单独的强力霉素、单独的阿奇霉素或组合处理单层细胞48小时后，通过接种到低附着板上来富集csc群。在这些条件下，非csc群经历失巢凋亡(一种由缺乏细胞
‑
基质附着诱导的细胞凋亡形式)，而csc被认为活下来。然后通过facs分析确定存活的csc分数。简言之，1
×
104个mcf7单层细胞在6孔板中用抗生素或单独的溶媒处理48小时。然后，将细胞用胰蛋白酶消化并接种在低附着板的乳腺球培养基中。12小时后，离心mcf7细胞。将细胞漂洗两次并与live/dead染料(fixable dead violet活性染料；invitrogen)一起孵育10分钟。然后通过facs(fortessa,bd bioscence)分析样品。然后通过使用live/dead染料染色分析来确定存活群体。使用flowjo软件分析数据。
[0135]
在描述本途径的实施方案时使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而不旨在进行限制。在说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和“该(the)”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确指示。本途径包括通过通过所伴随的详细描述而变得显而易见的许多替代方案、修改方案和等同方案。
[0136]
将理解的是，虽然在本文中可以使用术语“第一”、“第二”、“第三”、“a)”、“b)”和“c)”等来描述本途径的各种要素，但权利要求书不应受这些术语的限制。这些术语仅用于将本途径的一个要素与另一个要素区分开来。因此，在不脱离本途径的教导的情况下，以下讨论的第一要素可以被称为一个要素方面，并且类似地，可以被称为第三要素。因此，术语“第一”、“第二”、“第三”、“a)”、“b)”和“c)”等并不一定旨在传达相关要素的顺序或其他层
次结构，而是仅用于识别目的。操作(或步骤)的顺序不限于权利要求书中提出的顺序。
[0137]
除非另外定义，否则本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。将进一步理解，术语，例如在常用词典中定义的那些，应被解释为具有与其在本技术的上下文和相关技术中的含义一致的含义，而不应以理想化或过度正式的意义解释，除非本文明确地如此定义。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。
[0138]
此外，如本文所用，“和/或”是指并涵盖一个或多个列出的相关项目中的任一个和所有可能的组合，并且当以替代方式(“或”)解释时不组合。
[0139]
除非上下文另有说明，否则特别意图本文描述的本途径的各种特征可以以任何组合使用。此外，本途径还考虑了在一些实施方案中，可以排除或省略关于示意性实施方案描述的任何特征或特征的组合。
[0140]
如本文所用，过渡性措辞“主要由
……
组成”(和语法变体)应被解释为包括所列举的材料或步骤以及“那些不会实质性地影响权利要求的一个或多个基本特征和新特征”的材料或步骤。因此，本文使用的术语“主要由
……
组成”不应被解释为等同于“包含”。
[0141]
本文所用的术语“约”在指可测量的值，例如诸如量或浓度等时，意在涵盖规定量的
±
20％、
±
10％、
±
5％、
±
1％、
±
0.5％或甚至
±
0.1％的变化。本文提供的可测量值的范围可以包括其中的任何其他范围和/或各个值。
[0142]
虽已如此描述了本途径的某些实施方案，但应当理解，所附权利要求的范围不受上述描述中阐述的特定细节的限制，因为在不脱离下文要求保护的其精神或范围的情况下，其许多明显的变化是可能的。