栀子柏皮汤在制备治疗治疗急性痛风性关节炎的药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及一种中药复方制剂的新用途，具体涉及栀子柏皮汤在制备治疗急性痛风性关节炎的药物中的应用。


背景技术：

2.急性痛风性关节炎是嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄减少致使尿酸沉积在关节囊、滑膜囊、软骨、骨质而引起的关节周围软组织出现明显红肿疼痛，局部不能忍受被单覆盖或周围震动，午夜足痛惊醒，痛如刀割的急性炎症反应。
3.目前治疗急性痛风性关节炎的方法主要以口服药物治疗，常用的药物包括非甾体抗炎药，秋水仙碱，糖皮质激素等等。一般认为秋水仙碱是治疗急性痛风性关节炎的首选药物，主要用于治疗痛风性关节炎的急性发作，预防复发性痛风性关节炎等。但在使用秋水仙碱时，一定要控制药量，注意监测药物不良反应，计算每天累计用量，不可过多。如果关节炎症状有所缓解，就可以马上停止使用秋水仙碱，防止发生药物不良反应。因此，寻找对急性痛风性关节炎具有良好治疗作用的中药制剂，对于发现急性痛风性关节炎的新型治疗药物具有重要意义。
4.栀子柏皮汤是由君药栀子，臣药黄柏、使药炙甘草组成，具有较强的清热之力及祛湿之效，是利胆退黄的经典方剂之一。其在现代临床医学中常用于治疗急性黄疸型肝炎、胆囊炎、胰腺炎、甚至原发性肝癌的术后等。而目前尚无将栀子柏皮汤用于治疗急性痛风性关节炎的研究报道。


技术实现要素：

5.鉴于此，本发明的目的在于提供栀子柏皮汤在制备治疗急性痛风性关节炎的药物中的新应用。
6.本发明所述的栀子柏皮汤，由下列中药原料制作而成：栀子、黄柏和炙甘草。
7.作为优选，所述的栀子柏皮汤，按重量份数计，由如下原料制成：栀子15
‑
20份、黄柏25
‑
35份、炙甘草10
‑
20份。
8.栀子柏皮汤是泄热利湿退黄的经典名方，而本发明经药效试验研究发现，栀子柏皮汤不仅能显著改善急性痛风模型小鼠踝关节肿胀状态以及步态异常情况；而且还能显著降低急性痛风发作较为核心的炎症因子(il
‑
1β、il
‑
6和tnf
‑
a)含量，降低急性痛风模型小鼠关节组织炎症因子mrna的表达，促进抑炎因子mrna的表达，表明栀子柏皮汤对msu晶体诱导的急性痛风性关节炎炎症具有明显的抑制作用。
9.本发明可根据实际需要，将栀子柏皮汤与合适的辅料按照常规方法制成相应的剂型，所述药物剂型可以为口服液剂、颗粒剂、滴丸、片剂、胶囊或配方颗粒等。
10.本发明提供一种栀子柏皮汤的新用途，为急性痛风性关节炎提供一种新的药物选择。栀子柏皮汤对于急性痛风性关节炎炎症具有明显的抑制作用，且短时间给药对小鼠无
急性毒性，可进一步开发为用于抗急性痛风性关节炎的药物，具有临床应用前景和很高的经济利用价值。
附图说明
11.图1为栀子柏皮汤(gp)改善急性痛风小鼠关节肿胀状态图(a)正常组小鼠；(b)痛风组小鼠；(c)阳性药组小鼠；(d)gp高剂量组小鼠；(e)gp低剂量组小鼠；(f)不同时刻的肿胀度；
12.图2为各组小鼠步态图(a)步长；(b)步宽；(c)旋转角度；
13.图3为各组小鼠关节液炎症因子含量图(a)il
‑
1β；(b)il
‑
6；(c)tnf
‑
α；
14.图4为各组小鼠关节组织炎症因子mrna表达水平图(a)il
‑
1β；(b)il
‑
6；(c)tnf
‑
α。
具体实施方式
15.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
16.实施例1：栀子柏皮汤(gp)抗急性痛风性关节炎实验
17.1.1实验设备与材料
18.1.1.1实验动物
19.雄性c57bl/6小鼠若干只，周龄5周，体重22
±
2g。购自广东省医学动物中心，合格证号：44007260091211，适应性喂养一周。
20.1.1.2实验设备及实验试剂(表1
‑
2)：
21.表1.实验设备
[0022][0023][0024]
表2.试剂材料
[0025][0026]
1.2实验操作与步骤
[0027]
1.2.1准备相关实验材料：生理盐水、凡士林、注射器、毛细管等。
[0028]
1.2.2制备相关试剂：
[0029]
(1)微晶尿酸钠的制备：将约4g尿酸加入800ml含naoh(9ml/0.5n)的蒸馏水中加热至尿酸溶解，在60℃下调节ph至8.9，用磁力搅拌器缓慢搅拌6h，4℃冰箱放置过夜，次日抽滤获到粗品，经无水乙醇洗涤，进一步冻干处理得到针状的尿酸钠晶体成品，室温下密封保存。msu混悬液溶剂：按照体积9:1之比，用移液枪量取生理盐水与吐温80于玻璃瓶中，加热器上加热使吐温融化，轻轻摇动玻璃瓶使二者混匀。
[0030]
(2)msu混悬液(8mg/ml)：称量适量msu晶体，加入生理盐水与吐温80混合液中(9:1)，超声10min。
[0031]
(3)秋水仙碱(0.025mg/ml)：取一粒秋水仙碱(0.5mg)，溶于20ml纯水中，避光，4度保存。
[0032]
(4)墨水：向烧杯中倒入一定墨水，再加入凡士林少许。放到加热器加热，使凡士林融化。加热浓缩3min，停止加热。若冷却后，不够粘稠，可加入凡士林少许，重复上述步骤。
[0033]
(5)gp配方颗粒水溶液：分别称取栀子配方颗粒0.0938g、黄柏配方颗粒0.125g、炙甘草0.25g，置25ml量瓶中，加纯水适量，摇匀使充分溶解，加纯水至刻度，即为高剂量gp溶液，稀释1倍制成低剂量gp溶液。4℃保存。
[0034]
1.2.3小鼠随机分组如下：正常组(6只,n)、模型组(6只,m)、阳性药组(6只,y)、gp高剂量组(6只，gp1)、gp低剂量组(6只、gp2)、
[0035]
急性痛风造模前，测量小鼠关节直径和步态评分：用记号笔标记关节位置，用游标卡尺测量关节直径，测量3次取平均值。墨水标记小鼠后肢脚掌，让小鼠在黑暗通道(通道底部垫a4纸)里行走，足迹会留在a4纸上。
[0036]
1.2.4异氟烷麻醉小鼠后，用胰岛素针向小鼠右后肢关节腔注射25ml msu混悬液。注射后关节两侧鼓起提示造模操作成功。
[0037]
1.2.5造模后1h、7h时，0.2ml/10g给予药物灌胃。
[0038]
1.2.6造模后3h、6h、12h测量关节直径(测量3次取平均值)以及步态评分。
[0039]
1.2.7造模后12h时，处死小鼠结束动物实验。
[0040]
具体方法为：水合氯醛麻醉小鼠，拍照记录关节肿胀情况。眼球取血，然后处死小鼠。以右踝关节为中心，用剪刀剪去约1cm，去除皮毛和肌肉，置于1ml生理盐水中，研碎，冰水浴超声15min，3000rpm/min，15min离心，于
‑
20℃保存。剩余关节碎片加入500μl trizol，于
‑
20℃保存。
[0041]
1.2.8动物实验结束后，对以下指标进行数据处理：
[0042]
(1)步态测定方法参照文献进行。
[0043]
(2)肿胀度：肿胀度(％)＝(造模后某一时刻的关节直径
–
造模前的关节直径)/造模前的关节直径
×
100％。
[0044]
1.2.9动物实验结束后进行以下分子检测：
[0045]
按照elisa试剂盒说明书检测关节冲洗液il
‑
1β、il
‑
6、tnf
‑
α水平。
[0046]
1.2.10 real
‑
time pcr检测关节组织炎症因子mrna的表达
[0047]
取关节组织置于1.5ml离心管中，加入1mltrizol，使用匀浆仪进行冰上匀浆，室温放置5min；4℃，14000rpm离心5min，取上清，trizol补充至1ml；加入0.2ml氯仿，剧烈震荡30s，室温放置5min；4℃，14000rpm离心15min，取上层水相400μl至新1.5ml离心管中；向离心管中加入1倍体积异丙醇，混匀室温放置5min；4℃，14000rpm离心15min，小心吸走上清，保留沉淀；加入75％乙醇1ml，震荡30s；4℃，7500rpm离心5min；小心吸走上清，保留沉淀；加入20ml depc水，使用掌式离心机离心30s，将所得到的溶液置于
‑
80℃保存；逆转录合成cdna，使用微量紫外分光光度计测定rna浓度。按照逆转录酶试剂盒说明书进行操作，按表3组份配制逆转录反应液，轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下:37℃，15min；85℃5s；4℃，∞。
[0048]
表3.rt
‑
qpcr反应液配制方法
[0049][0050]
表4.引物序列
[0051][0052]
样品real
‑
time pcr检测，将上一步得到的cdna稀释9倍，然后用目的基因和内参基因的引物分别进行扩增，引物序列见表4，按表3组份配制pcr反应液(冰上进行)，扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，退火60℃，10s，共40个循环，延伸95℃，15s，60℃，1min，95℃，15s。使用biorad cfx96 real
‑
time pcr detection systems进行检测。
[0053]
5.2.11统计学方法
[0054]
所有数据均采用graphpad prism 8软件进行分析处理，数据以平均值
±
标准差(x
±
s)表示，组间差异比较采用anov a方差分析，以p＜0.05有统计学意义。
[0055]
1.3实验结果
[0056]
1.3.1 gp降低急性痛风模型小鼠踝关节肿胀度
[0057]
表5.各组小鼠不同时刻的肿胀度(n＝6)
[0058][0059]
***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05vs模型组
[0060]
实验结束时，通过拍照记录各组的关节肿胀情况，如图1a
‑
d。从肿胀度数据结果(如表5所示)看：与正常组相比，痛风模型组小鼠踝关节肿胀度显著升高(p<0.001)；与模型组相比，阳性药和gp组小鼠肿胀度显著降低(p<0.001)；gp降低急性痛风模型小鼠踝关节肿胀度呈剂量依赖性。
[0061]
1.3.2 gp显著改善急性痛风模型小鼠步态异常
[0062]
表6.各组小鼠不同时刻的步长(n＝6)
[0063][0064]
***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05vs模型组
[0065]
表7.各组小鼠不同时刻的步宽(n＝6)
[0066][0067][0068]
***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05vs模型组
[0069]
表8.各组小鼠不同时刻的旋转角度(n＝6)
[0070][0071]
***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05vs模型组
[0072]
从步态数据结果上看(表6
‑
8)：与正常组相比，痛风模型组步长显著降低(p<0.001)、步宽显著升高(p<0.05)、旋转角度显著升高(p<0.001)；与模型组相比，阳性药组小鼠步长显著减小(p<0.001)、步宽显著增大(p<0.05)、旋转角度显著增大(p<0.001)，gp组小鼠步长显著减小(p<0.001)、旋转角度显著增大(p<0.001)。
[0073]
与正常组小鼠相比，模型组小鼠步态显著异常；与模型组小鼠相比，阳性药、gp高低剂量组小鼠显著改善步态异常；gp显著改善急性痛风模型小鼠步态异常，呈剂量依赖性。
[0074]
1.3.3gp显著降低急性痛风模型小鼠踝关节液炎症因子含量
[0075]
表9.各组小鼠踝关节液中炎症因子含量(n＝6)
[0076][0077]
***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05vs模型组
[0078]
与正常组小鼠相比(表9)，模型组小鼠关节液il
‑
1β、il
‑
6和tnf
‑
α含量均显著升高(p<0.001)；与模型组小鼠相比，阳性药组和gp高低剂量组小鼠踝关节il
‑
1β、il
‑
6和tnf
‑
α水平均显著降低(p<0.001)；gp降低急性痛风模型小鼠踝关节液炎症因子含量呈剂量依赖性。
[0079]
1.3.4 gp显著降低急性痛风模型小鼠踝关节组织炎症因子mrna表达水平
[0080]
表10.各组小鼠踝关节组织炎症因子mrna表达水平(n＝6)
[0081][0082]
注：内参基因为gapdh，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05vs模型组
[0083]
与正常组小鼠相比(表10)，模型组小鼠关节组织炎症因子il
‑
1β、il
‑
6、tnf
‑
a mrna表达水平均显著升高(p<0.001)；与模型组小鼠相比，阳性药组、gp高低剂量组小鼠关节组织炎症因子il
‑
6、tnf
‑
a mrna表达水平均显著降低(p<0.001)；与模型组小鼠相比，阳性药组小鼠关节组织炎症因子il
‑
1βmrna表达水平显著降低(p<0.001)，gp高剂量组小鼠关节组织炎症因子il
‑
1βmrna表达水平显著降低(p<0.05)；gp降低急性痛风模型小鼠踝关节液炎症因子mrna的表达，呈剂量依赖性。
[0084]
1.3.5 gp不影响急性痛风小鼠脏器指数
[0085]
表11.各组小鼠脏器指数(n＝6)
[0086][0087]
***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05vs模型组
[0088]
试验结束时，称重各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾计算其脏器指数(表11)，评估gp短时间给药是否对脏器产生急性毒性而引起组织病理形态变化。脏器指数计算公式为：脏器
质量/体重
×
100％。如上表所示，各组的各个脏器指数与正常组比较未发现显著差异。这说明gp短时间给药不会对脏器产生急性毒性。
[0089]
1.4结论
[0090]
以上实验结果表明：本次实验急性痛风模型构建是成功的；gp可显著改善急性痛风模型小鼠踝关节肿胀状态以及步态异常情况；gp显著降低msu晶体诱导的小鼠关节液中炎症因子含量。gp可以显著抑制msu晶体诱导的急性痛风性关节炎模型小鼠炎症反应，对急性痛风性关节炎具有一定治疗作用。
[0091]
1.5总结
[0092]
急性痛风性关节炎是沉积在关节的msu晶体刺激机体免疫系统引发的急性炎症反应，所以人们普遍使用msu晶体注射入动物关节或者足趾中来模拟急性痛风性关节炎的临床情况。msu晶体在注射入关节后，会引发关节红肿、动物步态异常以及动物关节部位炎症因子水平显著升高。本次实验设计以msu晶体诱导的急性痛风性关节炎小鼠模型来评价gp的药效。在给予gp灌胃后，急性痛风性关节炎小鼠的关节红肿、动物步态异常情况显著改善，关节部位炎症因子水平显著下降，这些结果表明了gp对于急性痛风性关节炎的治疗作用。gp可以降低急性痛风模型小鼠关节组织炎症因子mrna的表达，进一步验证了gp对于急性痛风性关节炎炎症的抑制作用。前期预实验发现，高剂量的gp短时间给药对小鼠无急性毒性。这些实验数据预示着gp可进一步开发为抗炎药物，具有临床应用前景和很高的经济利用价值。