后酸化控制提高的制备发酵乳产品的方法与流程

后酸化控制提高的制备发酵乳产品的方法
1.本技术是申请日为2015年6月18日、申请人为科.汉森有限公司、发明名称为“后酸化控制提高的制备发酵乳产品的方法”的中国专利申请201580033083.7的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及制备发酵乳产品的方法，其包括以下步骤：其中通过包含乳酸菌的起子培养物来发酵乳并且其中通过可被所述乳酸菌代谢的碳水化合物的浓度的降低来终止发酵。本发明的方法提高了后酸化的控制，所述后酸化即在发酵终止之后(例如在进一步加工和储存期间)由细菌引起的酸化。


背景技术：

3.当前用于制备发酵乳产品的大多数方法可以以下连续步骤为特征：
4.(a)使用包含能够代谢由乳中存在的乳糖获得的葡萄糖的乳酸菌(或lab)的起子培养物来发酵乳；
5.(b)所述发酵引起乳酸的产生，这导致ph从初始6.4至6.8(对于牛乳)降低至ph 3.8至ph 4.7的范围；
6.(c)一旦已达到所讨论发酵产品期望的ph，就通过快速冷却发酵乳产品来终止发酵。
7.该方法例如用于制备酸奶和酸奶饮料。
8.在预定的ph值下快速冷却发酵乳产品以终止发酵。如果不冷却发酵产品，发酵将继续进行下去。然而，快速冷却具有缺点，因为其导致质地损失。避免快速冷却步骤还节省了装置操作并且因此降低生产成本。
9.甚至在包括快速冷却步骤的方法中，也观察到后酸化，即在终止发酵之后(即在已达到期望的ph之后)lab产生乳酸。现今，认为后酸化代表在发酵乳产品期间最重要的问题之一。在发酵乳产品的加工和储存期间ph值的进一步降低导致酸度升高和货架期缩短的问题。
10.因此，后酸化还对酸奶的货架期具有不利影响。酸奶的货架期根据国家而为30天至50天不等。在此时间期间，后酸化改变酸奶的质量，从而导致酸味产品和高乳清分离。通常通过在储存期间将产品保持在4℃至8℃的温度来尽可能地维持酸奶的质量。在此温度下，细菌仅具有低活性。然而，在很多国家，难以在储存期间维持冷却链。
11.因此，制备货架期延长的酸奶(extended shelf life yoghurt，esl酸奶)受到高度关注，特别是在难以维持冷却链的国家。制备esl酸奶的现有技术方法包括发酵后的热处理步骤(通常为65℃/30秒)。该处理导致用于发酵的细菌的数量以及酵母和霉菌的数量显著降低。加热步骤还抑制酸奶中存在的酶的活性。因此，产品具有长达9个月的延长货架期，其中未观察到或者仅观察到低的后酸化和味道变化。
12.然而，热处理对酸奶的质量具有不利影响，并且改变所获得的味道和质地。热处理的另一不利影响是通过摄食活细菌获得的健康益处消除或损失。
13.用于控制后酸化的一种方法在于制备具有相对酸性ph的乳产品。在这些方法中，酸性ph抑制lab的进一步生长和乳酸的产生。然而，乳酸的进一步产生仅仅受到抑制但并未完全终止，并且该方法明显地不适于制备具有温和味道的发酵乳产品。
14.假定，后酸化受保加利亚乳杆菌(l.bulgaricus)的代谢活性控制且由肽摄取引起，并且产生氨基酸代谢缺陷的菌株控制后酸化(us2010/0021586和wo2006/042862a1)。用于控制后酸化的其他方法在现有技术中已有描述并且包括基于使用以弱后酸化活性为特征的特定lab菌株(wo2010/139765)。
15.用于使后酸化最小化的一种替代方法基于在发酵期间控制蛋白质与乳糖的比例、控制缓冲能力以及维持缓冲能力和维持ph在预定范围内(wo2013/169205)。然而，该方法需要在发酵期间确定大量的工艺参数并且可需要向发酵培养基添加蛋白质或乳糖或缓冲剂以确保在发酵期间维持预定的范围。
16.明显地，仍然需要改进用于制备发酵乳产品的方法，所述方法提供了发酵乳产品中后酸化活性的更佳控制。


技术实现要素：

17.这一问题现在通过本发明的方法而得以解决，所述方法提供了具有极低后酸化活性的乳产品。
18.特别地，本发明提供了制备发酵乳产品的方法，所述方法包括其中发酵乳的步骤，其中：
19.(a)所述发酵通过起子培养物来起始，所述起子培养物包含能够代谢乳中存在的一种或数种碳水化合物的乳酸菌，
20.(b)所述发酵通过在发酵期间该一种或数种碳水化合物的浓度的降低来终止，并且
21.(c)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起。
22.发明人令人吃惊地发现，可通过待发酵乳中碳水化合物的浓度来控制发酵的终止且不显著影响发酵效率或发酵所需的时间。这是令人吃惊的，因为设想减少乳中存在的可供lab发酵利用的碳水化合物将抑制或延迟发酵过程并且由此导致不能用于大规模生产发酵乳产品(例如酸奶)的低效率过程。发明人还吃惊地注意到，发酵过程快速地进行直至基本所有的碳水化合物都已被lab耗尽的点，并且随后几乎完全终止(图1，1％乳糖)。可以预期，存在非常低浓度之可供lab利用的碳水化合物的发酵过程将导致lab在延长的时间内具有低酸化活性。
23.在一个替代方案中，本发明提供了制备发酵乳产品的方法，其包括其中使用起子培养物来发酵乳的步骤，其中：
24.(i)所述起子培养物包含嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)，
25.(ii)所述发酵在22℃至45℃的温度下进行，
26.(iii)所述发酵通过在发酵期间碳水化合物浓度的降低来终止，
27.(iv)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起，并且
28.其中所述发酵乳产品的特征在于：如果在发酵终止之后储存在步骤(ii)中的发酵
用温度下，该产品的ph值在20小时的时间内维持在0.3个ph单位的范围内。这并非意味着，所述方法一定包括其中在发酵终止之后将发酵乳产品在步骤(ii)中的发酵用温度下维持20小时的时间的步骤。这仅仅是可用于确定低后酸化的一种功能性测试。如果储存在发酵温度下发酵乳产品的ph值在20小时的时间内维持在0.3个ph单位的范围内指示非常低的后酸化。
29.在另一个实施方案中，本发明涉及以基本无后酸化为特征的用于制备发酵乳产品的方法。制备发酵乳产品的相应方法包括其中使用起子培养物来发酵乳的步骤，其中：
30.(i)所述起子培养物包含嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种，
31.(ii)所述发酵在22℃至45℃的温度下进行，
32.(iii)所述发酵通过在发酵期间碳水化合物浓度的降低来终止，
33.(iv)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起，并且
34.其中所述发酵乳产品的特征在于：如果在发酵终止之后储存在步骤(ii)中的发酵用温度下，该产品的ph值在20小时的时间内维持在0.1个ph单位的范围内。如果储存在发酵温度下发酵乳产品的ph值在20小时的时间内维持在0.1个ph单位的范围内指示不存在后酸化。
35.在另一个替代方案中，本发明提供了制备发酵乳产品的方法，其包括：
36.(a)其中使用起子培养物来发酵乳的步骤，其中：
37.(i)所述发酵使用乳和起子培养物来起始，其中在发酵开始时，乳中的乳糖浓度为5mg/g至100mg/g，
38.(ii)所述起子培养物包含嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种，
39.(iii)所述发酵在22℃至45℃的温度下进行，
40.(iv)所述发酵通过在发酵期间乳糖浓度的降低来终止，
41.(v)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起；以及
42.(b)其中将发酵产品在15℃至45℃的温度下包装的步骤。
43.由于后酸化低，该方法不需要发酵之后的冷却步骤。
44.本发明还提供了能够通过这些方法获得的发酵乳产品。这些发酵乳产品的特征在于：如果储存在发酵用温度下，该产品的ph值在20小时的时间内维持在0.3个ph单位的范围内。所述产品的特征还在于：可被发酵用lab代谢的碳水化合物的浓度非常低。其他碳水化合物可以以显著较高的浓度存在。
具体实施方式
45.一般性地，本发明提供了制备发酵乳产品的方法，其包括其中发酵乳的步骤，其中：
46.(a)所述发酵通过起子培养物来起始，所述起子培养物包含能够代谢乳中存在的一种或数种碳水化合物的乳酸菌，
47.(b)所述发酵通过在发酵期间该一种或数种碳水化合物的浓度的降低来终止，并且
48.(c)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起。
49.在本技术的上下文中，术语“乳”以其常见含义广泛使用，指由动物的乳腺或者由
植物产生的液体。根据本发明，乳可已进行加工，并且术语“乳”包括全乳、脱脂乳、无脂乳、低脂乳、全脂乳、降乳糖乳或浓缩乳。无脂乳是非脂或脱脂乳产品。低脂乳通常定义为包含约1％至约2％脂肪的乳。全脂乳通常包含2％或更多脂肪。术语“乳”旨在涵盖来自不同哺乳动物和植物来源的乳。乳的哺乳动物来源包括但不限于乳牛、绵羊、山羊、水牛、骆驼、美洲驼、母马和鹿。乳的植物来源包括但不限于从大豆、豌豆、花生、大麦、稻、燕麦、藜麦、杏、腰果、椰子、榛子、大麻、芝麻籽和向日葵子提取的乳。
50.在本发明的方法和产品中，最优选地使用从乳牛获得的乳作为发酵的起始材料。
51.在本发明的一些实例中已使用降乳糖乳并且其是可商购获得的(例如，从select milk producers inc.,texas,usa商购获得)。降乳糖乳可根据本领域中已知的任何方法来制备，包括通过乳糖酶将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，或者通过纳米过滤、电渗析、离子交换色谱和离心。
52.术语“乳基质”在申请中广泛用于指可用作lab的生长和发酵用培养基的基于乳或乳组分的组合物。乳基质包含来源于乳的组分以及可用于生长或发酵lab的目的任何其他组分。
53.在本技术的上下文中，术语“乳酸菌”或“lab”用于指产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的食品级细菌。这些细菌通过其共同的代谢和生理特征而相关联并且通常是革兰氏阳性的、低gc的、耐酸性的、不形成孢子的、不呼吸的棒状杆菌或球菌。在发酵阶段期间，这些细菌消耗乳糖导致形成乳酸、降低ph并且导致形成蛋白质凝块。因此，这些细菌负责乳的酸化并且负责乳产品的质地。本文中使用的术语“乳酸菌”涵盖但不限于属于以下属的细菌：乳杆菌属(lactobacillus spp.)、双歧杆菌属(bifidobacterium spp.)、链球菌属(streptococcus spp.)、乳球菌属(lactococcus spp.)，例如德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、乳酸乳杆菌(lactobacillus lactis)、动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis)、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)、副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)、胚牙乳杆菌(lactobacillus plantarum)、瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、短双歧杆菌(bifidobacterium breve)，以及明串珠菌属(leuconostoc spp)。
54.用于制备发酵乳产品的方法中的发酵步骤包括向乳中添加起子培养物。在本发明上下文中使用的术语“起子”或“起子培养物”指负责乳基质酸化的一种或更多种食品级微生物(特别是乳酸菌)的培养物。起子培养物可以是新鲜的、冷冻的或冻干的。对于发酵乳产品的制备，可以以乳总量的按体积计0.01％至3％，优选0.01％至0.025％的量添加起子。
55.术语“能够代谢乳中存在的一种或数种碳水化合物”在本发明的上下文中用于描述lab导致产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的代谢活性。如在下文更详细说明的，lab可能够代谢乳中存在的一种、数种或全部碳水化合物。碳水化合物可存在于天然乳中或者可已添加至乳中。
56.在某些实施方案中，本发明提供了使用能够代谢乳糖和葡萄糖的lab的方法。在另一些实施方案中，本发明提供了使用葡萄糖代谢缺陷的lab的方法，所述lab能够代谢其他碳水化合物，例如乳糖和半乳糖。在另一些替代方案中，本发明提供了使用乳糖代谢缺陷的lab的方法，所述lab能够代谢其他碳水化合物，例如葡萄糖。
57.本发明的方法以这样的步骤为特征，其中发酵乳并且通过在发酵期间一种或数种
碳水化合物的浓度的降低来终止发酵。这意味着，发酵培养物中存在的lab由于可代谢的碳水化合物的浓度非常低而不再能够产生显著量的乳酸。在一个实施方案中，发酵的终止可以以下ph值为特征：当将培养物在发酵用温度下维持20小时时，ph值维持在小于0.3个ph单位的范围内。例如，如果进行上述包括其中发酵乳的步骤的制备发酵乳产品的方法，可容易地通过将产品在发酵用温度下持续20小时来测试发酵终止是否归因于发酵期间一种或数种碳水化合物的浓度的降低。如果在该时间期间ph改变不超过0.3个ph单位，则发酵的终止由发酵期间一种或数种碳水化合物的浓度的降低引起。
58.通过一达到期望的ph就冷却来终止发酵的现有技术方法不满足这一测试，因为可供代谢活性利用的残余碳水化合物在发酵用温度下可导致显著的后酸化(图1，3％曲线；图2和3，最下面的曲线)。
59.本发明方法的特征还可在于：碳水化合物浓度的降低至少还由乳酸菌的代谢活性引起。这意味着乳酸菌有助于碳水化合物的降低，但是其他组分(例如酶，例如乳糖酶)在发酵期间也可有助于可被代谢的碳水化合物的降低。
60.在一些实施方案中，本发明的方法包括其中将发酵产品在15℃至45℃的温度下包装的步骤。如上所述，现有技术的主要问题之一在于需要快速冷却发酵产品来终止发酵。本发明的方法可包括其中将发酵产品在15℃至45℃的温度下包装的步骤。这表明：与现有技术方法相反，快速冷却并不是绝对必需的。
61.根据一个替代方案，发酵的终止可以以能够被乳酸菌代谢的一种或数种碳水化合物的浓度为特征。在发酵终止时，可被乳酸菌代谢的碳水化合物的浓度可低于100mg/g，例如低于30mg/g，包括25mg/g至0.01mg/g的范围，或者5mg/g至0.01mg/g的范围。
62.如上所述，根据本发明的制备发酵乳产品的方法还可以以储存期间特别稳定的ph值为特征。发酵产品当储存在发酵用温度下时可在20小时的时间内维持在0.3个ph单位的范围内。
63.在另一个替代方案中，根据本发明的制备发酵乳产品的方法可以以发酵期间22℃至45℃的温度为特征。该温度范围包括用于嗜温培养物和嗜热培养物的范围。在本技术的上下文中，术语“嗜温”指在中等温度下，即在15℃至40℃的温度下生长最佳的微生物。工业上最常用的嗜温细菌包括乳球菌属和明串珠菌属。嗜温乳产品包括例如以下的乳产品：酪乳、酸乳(sour milk)、发酵乳、斯美塔那酸奶油(smetana)、酸奶油和新鲜乳酪，例如夸克奶酪、特沃劳格奶酪(tvarog)和奶油乳酪。在本技术的上下文中，术语“嗜热”指在高于40℃的温度下生长最佳的微生物。工业上最常用的嗜热细菌包括链球菌属和乳杆菌属。嗜热乳产品包括例如酸奶的乳产品。
64.根据一个实施方案，本发明提供了其中将嗜温培养物和嗜热培养物均在22℃至45℃的温度下进行发酵的上述方法。
65.本发明还提供了能够通过上述方法获得的发酵乳产品。本发明的发酵乳产品优选地是发酵食物产品，包括酸奶、水果酸奶、酸奶饮料或乳酪。
66.在本发明的最优选实施方案中，本发明的所有方法均是用于制备酸奶的方法，并且本发明的产品是酸奶。
67.在本技术的上下文中，术语“酸奶”指包含嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种以及任选地其他微生物的产品，所述其他微生物例如德氏乳酸杆菌乳酸亚种
(lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、动物双歧杆菌乳酸亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)、乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)和副干酪乳杆菌，或者由其衍生的任何微生物。包含除嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种之外的乳酸菌株以赋予最终产品多种特性，例如促进菌群平衡的特性。本文中使用的术语“酸奶”涵盖凝固型酸奶、搅拌型酸奶、饮用型酸奶、新鲜酸乳酪(petit suisse)、热处理酸奶、以高蛋白质水平为特征的脱乳清酸奶(strained yogurt)或希腊式酸奶，以及酸奶样产品。
68.特别地，术语“酸奶”涵盖但不限于根据法国和欧洲规定定义的酸奶，例如仅借助于特定嗜热乳酸菌(即德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌)通过乳酸发酵获得的凝固乳产品，所述嗜热乳酸菌同时进行培养并且发现以至少1千万个cfu(菌落形成单位)/g的量存活于终产品中。酸奶可任选地包含添加的乳原料(例如奶油)或其他成分，例如糖或甜味剂、一种或更多种矫味剂、水果、谷物或营养物质，尤其是维生素、矿物质和纤维，以及稳定剂和增稠剂。在一个替代方案中，酸奶满足afnor nf04
‑
600标准和/或codex stana
‑
lla
‑
1975标准对发酵乳和酸奶的规定。为了满足afnor nf 04
‑
600标准，产品在发酵之后必须尚未加热并且乳原料必须代表最终产品的最低70％(m/m)。
69.乳酪(例如mozzarella乳酪和pizza乳酪以及羊乳酪(feta))也可通过使用包含嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的起子培养物发酵来制备(hoier等(2010)，the technology of cheesemaking,第2版blackwell publishing,oxford；166
‑
192)。
70.本发明的方法涵盖多个不同的替代方案。下文将在一些细节方面对下述替代方案进行说明：
71.(a)使用具有低乳糖含量的乳来制备发酵乳产品的方法；
72.(b)乳糖缺陷型lab及使用乳糖缺陷型lab来制备发酵乳产品的方法；
73.(c)用于具有延长货架期的发酵乳产品的方法；
74.(d)使用葡萄糖缺陷型lab来制备发酵乳产品的方法；
75.(e)通过向发酵添加乳糖酶来制备发酵乳产品的方法；
76.(f)基于用方法(a)至(e)之一获得的产品来制备脱乳清发酵乳产品的方法；
77.(g)使用方法(a)至(e)之一来制备帕斯塔菲拉塔(pasta filata)乳酪产品的方法。
78.a：使用低乳糖乳来制备发酵乳产品的方法
79.根据该替代方案，本发明提供了制备发酵乳产品的方法，其包括其中发酵乳的步骤，其中:
80.(a)所述发酵通过包含乳酸菌的起子培养物来起始，所述起子培养物包含能够代谢乳中存在的乳糖的嗜热链球菌(st)和德氏乳杆菌保加利亚亚种二者，
81.(b)所述发酵通过在发酵期间乳糖浓度的降低来终止，并且
82.(c)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起，
83.其中在添加起子培养物之前，乳中的乳糖浓度低于30mg/g并且乳中的葡萄糖浓度低于15mg/g。在一个替代方案中，所述乳糖浓度低于25mg/g或低于15mg/g，并且所述葡萄糖浓度低于2mg/g。
84.在该方案的一个方面，本发明提供了制备发酵乳产品的方法，其包括其中发酵乳的步骤，其中：
85.(a)所述发酵通过包含乳酸菌的起子培养物来起始，所述起子培养物包含能够代谢乳中存在的乳糖的嗜热链球菌(st)和德氏乳杆菌保加利亚亚种二者，
86.(b)所述发酵通过在发酵期间乳糖浓度的降低来终止，并且
87.(c)所述降低由所述乳酸菌的代谢活性引起，
88.其中所述方法还包括其中将发酵产品在15℃至45℃的温度下包装的步骤。
89.在一个替代方案中，所述方法的特征可在于如果在发酵终止之后储存在发酵用温度下，发酵产品的ph值在20小时的时间内维持在0.3个ph单位的范围内或者维持在0.1个ph单位的范围内。
90.乳糖可天然存在于乳中或者已添加至乳中。
91.在该替代方案中，发酵由能够代谢乳糖的lab引起，并且发酵的终止由如此低以至于终止lab发酵和产生乳酸的乳糖浓度来引起。本发明人令人吃惊地发现，乳中甚至这些非常低的乳糖浓度也提供用于快速发酵的足够碳水化合物源。还发现，一旦乳糖浓度降低至某一阈值以下，发酵快速终止(实施例1，图1)。
92.乳中的初始乳糖浓度可低于30mg/g，例如为30mg/g至5mg/g，或者为15mg/g至5mg/g，或者为10mg/g至5mg/g。
93.乳糖浓度降低的乳可商购获得或者根据本领域中公知的方法制备。
94.在该替代方案的一个实施方案中，乳包含降低的乳糖含量，并且不包含牛乳中非天然存在的另外碳水化合物。相应地，乳中的初始乳糖浓度可显著低于15mg/g，例如低于2mg/g。发酵可对乳糖含量降低并且未向天然牛乳添加任何碳水化合物的乳进行。
95.在该替代方案的另一个实施方案中，乳包含降低的乳糖含量并且包含牛乳中非天然存在的另外碳水化合物，例如葡萄糖或蔗糖。
96.b：乳糖缺陷型lab及使用乳糖缺陷型lab来制备发酵乳产品的方法
97.在另一个实施方案中，本发明提供了乳糖缺陷型lab。
98.术语“乳糖代谢缺陷”和“乳糖缺陷型”在本发明的上下文中用于表征部分或完全丧失利用乳糖作为细胞生长或维持细胞生存力的来源的能力的lab。相应的lab能够代谢选自蔗糖、半乳糖和/或葡萄糖或其他可发酵碳水化合物的一种或数种碳水化合物。由于这些碳水化合物并非以支持乳糖缺陷型突变体发酵的足够量天然存在于乳中，因此必须向乳中添加这些碳水化合物。乳糖缺陷型lab和乳糖部分缺陷型lab可表征为在包含乳糖和x
‑
gal的培养基上的白色菌落。
99.如下文的实施例2中详细描述的，本发明人分离到多种乳糖缺陷型lab，特别是嗜热链球菌(st)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(lb)的菌株。这些乳糖缺陷型lab代谢蔗糖。
100.所述菌株衍生自非乳糖缺陷型的菌株chcc15914。相应地，本发明提供了分离的嗜热链球菌菌株，所述菌株是以登录号dsm 28909于2014年6月12日保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124(deutsche sammlung von mikroorganismen und zellkulturen gmbh,inhoffenstr.7b,d
‑
38124braunschweig)的菌株。
101.根据另一个方面，本发明涉及以下乳糖缺陷型lab菌株：
102.(a)嗜热链球菌菌株，所述菌株是：
103.(i)以登录号dsm 28952于2014年6月12日保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124的菌株；
104.(ii)或者由dsm 28952衍生的菌株，其中所述衍生菌株进一步表征为具有在包含乳糖和x
‑
gal的培养基上产生白色菌落的能力；
105.(b)嗜热链球菌菌株，所述菌株是：
106.(i)以登录号dsm 28953于2014年6月12日保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124的菌株；
107.(ii)或者由dsm 28953衍生的菌株，其中所述衍生菌株进一步表征为具有在包含乳糖和x
‑
gal的培养基上产生白色菌落的能力；
108.(c)德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，所述菌株是：
109.(i)以登录号dsm28910于2014年6月12日保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124的菌株；
110.(ii)或者由dsm 28910衍生的菌株，其中所述衍生菌株进一步表征为具有在包含乳糖和x
‑
gal的培养基上产生白色菌落的能力。
111.本发明还涉及这些菌株在本文中所述的制备发酵乳产品的方法中的用途。另外，本发明涉及发酵食物产品，其包含以下一种或数种菌株：
112.(a)嗜热链球菌菌株，所述菌株是：
113.(i)以登录号dsm 28952于2014年6月12日保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124的菌株；
114.(ii)或者由dsm 28952衍生的菌株，其中所述衍生菌株进一步表征为具有在包含乳糖和x
‑
gal的培养基上产生白色菌落的能力；
115.(b)嗜热链球菌菌株，所述菌株是：
116.(i)以登录号dsm 28953于2014年6月12日保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124的菌株；
117.(ii)或者由dsm 28953衍生的菌株，其中所述衍生菌株进一步表征为具有在包含乳糖和x
‑
gal的培养基上产生白色菌落的能力；
118.(c)德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，所述菌株是：
119.(i)以登录号dsm28910于2014年6月12日保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124的菌株；
120.(ii)或者由dsm 28910衍生的菌株，其中所述衍生菌株进一步表征为具有在包含乳糖和x
‑
gal的培养基上产生白色菌落的能力。
121.所述发酵食物产品可以是酸奶、水果酸奶、酸奶饮料或乳酪。
122.根据该方案，本发明还提供了制备发酵乳产品的方法，其包括其中发酵乳的步骤，其中：
123.(a)所述发酵通过起子培养物来起始，所述起子培养物包含乳糖代谢缺陷的嗜热链球菌和乳糖代谢缺陷的德氏乳杆菌保加利亚亚种，
124.(b)向乳中添加可被(a)中限定的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种代谢的碳水化合物；
125.(c)所述发酵通过添加至乳的碳水化合物的浓度降低来终止，并且
126.(d)所述降低至少还由(a)中限定的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的代谢活性引起。
127.在一些实施方案中，所述方法还表征为包括其中将发酵产品在15℃至45℃的温度下包装的步骤。
128.在另一些替代方案中，所述方法的特征可在于如果在发酵终止之后储存在发酵用温度下，发酵产品的ph值在20小时的时间内维持在0.3个ph单位的范围内或者维持在0.1个ph单位的范围内。
129.可被(a)中限定的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种代谢的碳水化合物的总浓度可为30mg/g至2mg/g的范围，或者为20mg/g至3mg/g的范围，或者为10mg/g至4mg/g的范围。
130.这种进行方式具有以下优势：可在生产过程中使用乳糖浓度为约5％(50mg/g)的正常乳并且可通过添加的碳水化合物的量来精确地控制发酵。需添加的碳水化合物的浓度可在测试期望发酵条件(包括最终ph、温度、起子培养物等)的试验中来确定。
131.在该替代方案的一个优选实施方案中，使用能够代谢蔗糖的lab(suc )来进行发酵，并且在发酵之前向乳中添加蔗糖。在一个替代方案中，蔗糖的浓度为30mg/g至2mg/g的范围，或者为20mg/g至3mg/g的范围，或者为10mg/g至4mg/g的范围。
132.在一个方面，上述方法中的步骤(a)使用以下一种或数种菌株来进行：
133.(a)嗜热链球菌菌株，所述菌株是：
134.(i)以登录号dsm 28952于2014年6月12日保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124的菌株；
135.(ii)或者由dsm 28952衍生的菌株，其中所述衍生菌株进一步表征为具有在包含乳糖和x
‑
gal的培养基上产生白色菌落的能力；
136.(b)嗜热链球菌菌株，所述菌株是：
137.(i)以登录号dsm 28953于2014年6月12日保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124的菌株；
138.(ii)或者由dsm 28953衍生的菌株，其中所述衍生菌株进一步表征为具有在包含乳糖和x
‑
gal的培养基上产生白色菌落的能力；
139.(c)德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，所述菌株是：
140.(i)以登录号dsm28910于2014年6月12日保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124的菌株；
141.(ii)或者由dsm 28910衍生的菌株，其中所述衍生菌株进一步表征为具有在包含乳糖和x
‑
gal的培养基上产生白色菌落的能力。
142.c：用于具有延长货架期的发酵乳产品的方法
143.根据本发明的一个实施方案，使用上述用于控制后酸化的方法，特别是部分b中所述的方法来产生具有延长货架期的发酵乳产品。
144.制备发酵乳产品的相应方法可例如包括其中发酵乳的步骤，其中：
145.(a)所述发酵通过起子培养物来起始，所述起子培养物包含能够代谢乳中存在的一种或数种碳水化合物的乳酸菌，
146.(b)所述发酵通过在发酵期间该一种或数种碳水化合物的浓度的降低来终止，并且
147.(c)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起，
148.其中所述发酵产品的特征在于：如果在发酵终止之后储存6个月的时间，所述产品的ph值维持在0.3个ph单位的范围内。在一个特别优选的实施方案中，所述发酵产品的特征在于，如果在发酵终止之后储存12个月的时间，所述产品的ph值维持在0.3个ph单位的范围内。可将所述产品储存在2℃至室温的温度下。优选储存在冷藏温度下，即4℃至8℃。
149.如上所述，不要求将产品储存数个月。根据本发明的用于制备发酵乳产品的方法以能够通过该方法获得的在指定时间段内维持稳定性的产品为特征。在一个方面，本发明提供了制备发酵乳产品的方法，其包括其中使用起子培养物来发酵乳的步骤，其中能够通过该方法获得的产品储存6个月或12个月。
150.在一个替代实施方案中，制备发酵乳产品的方法包括其中使用起子培养物来发酵乳的步骤，其中：
151.(i)所述起子培养物包含嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种，
152.(ii)所述发酵在22℃至45℃的温度下进行，
153.(iii)所述发酵通过在发酵期间碳水化合物浓度的降低来终止，
154.(iv)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起，并且
155.其中所述发酵产品的特征在于：如果在发酵终止之后储存6个月或12个月的时间，该产品的ph值维持在0.3个ph单位的范围内。
156.在另一个替代方案中，提供了制备发酵乳产品的方法，其包括以下步骤：
157.(a)其中使用起子培养物来发酵乳的步骤，其中：
158.(i)所述发酵使用乳和起子培养物来起始，其中在发酵开始时，乳中的乳糖浓度为5mg/g至100mg/g，
159.(ii)所述起子培养物包含嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种，
160.(iii)所述发酵在22℃至45℃的温度下进行，
161.(iv)所述发酵通过在发酵期间乳糖浓度的降低来终止，
162.(v)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起；以及
163.(b)其中将发酵产品在15℃至45℃的温度下包装的步骤，
164.其中所述发酵产品的特征在于：如果在发酵终止之后储存6个月或12个月的时间，该产品的ph值维持在0.3个ph单位的范围内。
165.根据一个实施方案，这些方法使用不能够代谢乳糖的乳酸菌来进行发酵。所述乳酸菌可能够代谢蔗糖。在一个特别优选的实施方案中，这些方法利用包含以下一种或数种菌株的起子培养物：
166.(a)嗜热链球菌菌株，所述菌株是：
167.(i)以登录号dsm 28952于2014年6月12日保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124的菌株；
168.(ii)或者由dsm 28952衍生的菌株，其中所述衍生菌株进一步表征为具有在包含乳糖和x
‑
gal的培养基上产生白色菌落的能力；
169.(b)嗜热链球菌菌株，所述菌株是：
170.(i)以登录号dsm 28953于2014年6月12日保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124的菌株；
171.(ii)或者由dsm 28953衍生的菌株，其中所述衍生菌株进一步表征为具有在包含
乳糖和x
‑
gal的培养基上产生白色菌落的能力；
172.(c)德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，所述菌株是：
173.(i)以登录号dsm28910于2014年6月12日保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124的菌株；
174.(ii)或者由dsm 28910衍生的菌株，其中所述衍生菌株进一步表征为具有在包含乳糖和x
‑
gal的培养基上产生白色菌落的能力。
175.对于酸奶的发酵，优选地使用包含上述嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的起子培养物。
176.所述方法可进一步包括在发酵之后进行热处理。所述热处理可例如在30℃至65℃的温度下进行10秒至30秒，并且优选地在40℃至55℃的温度下进行10秒至25秒。
177.本发明还提供了能够通过上述方法获得的发酵乳产品。所述发酵乳产品可以是酸奶、水果酸奶、酸奶饮料或乳酪。因此，本发明提供了凝固型酸奶、搅拌型酸奶、饮用型酸奶、新鲜酸乳酪、热处理酸奶、以高蛋白质水平为特征的脱乳清酸奶或希腊式酸奶，以及能够通过这些方法获得的酸奶样产品。
178.(d)使用葡萄糖缺陷型lab来制备发酵乳产品的方法
179.在该替代方案中，本发明提供制备发酵乳产品的方法，其包括其中发酵乳的步骤，其中：
180.(a)所述发酵通过起子培养物来起始，所述起子培养物包含葡萄糖代谢缺陷的嗜热链球菌和葡萄糖代谢缺陷的德氏乳杆菌保加利亚亚种，
181.(b)所述发酵通过在发酵期间乳糖浓度的降低来终止，并且
182.(c)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起。
183.在一个优选方面，该方法可进一步表征为包括其中将发酵产品在15℃至45℃的温度下包装的步骤。
184.在另一些替代方案中，所述方法的特征可在于如果在发酵终止之后储存在发酵用温度下，发酵产品的ph值在20小时的时间内维持在0.3个ph单位的范围内或者维持在0.1个ph单位的范围内。
185.术语“葡萄糖代谢缺陷”和术语“葡萄糖缺陷型”二者在本发明的上下文中均用于表征部分或完全丧失利用葡萄糖作为细胞生长或维持细胞生存力的来源的能力的lab。葡萄糖代谢的相应缺陷可例如由基因突变引起，所述基因突变抑制葡糖激酶蛋白或葡萄糖转运蛋白的表达或活性或者使葡糖激酶蛋白或葡萄糖转运蛋白的表达或活性失活。葡萄糖代谢缺陷的lab可表征为当以乳糖作为碳水化合物源生长时提高培养基中的葡萄糖浓度。葡萄糖的增加由葡萄糖缺陷型lab的葡萄糖分泌引起。培养基中葡萄糖浓度的提高可通过hplc分析，例如使用dionex carbopac pa 20 3*150mm柱(thermo fisher scientific,产品号060142)来确定。
186.葡萄糖代谢缺陷的葡萄糖缺陷型lab的数种形式已在现有技术中进行了描述，包括能够代谢乳糖和半乳糖的lab(wo 2013/160413，pool等,2006)。相应的lab可消化乳中存在的主要碳水化合物乳糖，由此产生葡萄糖和半乳糖。葡萄糖缺陷型菌株(例如wo 2013/160413中所述的葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株)可代谢半乳糖并且进一步显示分泌葡萄糖。替代菌株在wo 2013/160413中进行了描述，例如2
‑
脱氧葡萄糖抗性德氏乳杆菌
(lactobacillus delbrueckii)突变体lab菌株，其不能摄取培养基中存在的葡萄糖或半乳糖。然而，该菌株可摄取乳糖，消化乳糖并使用由乳糖消化获得的葡萄糖来进行生长和酸产生。pool等,2006的公开公开了获得葡萄糖代谢缺陷的lab的另一种方法。使用这些出版物中描述的一般性原理，普通技术人员可获得具有相同或类似的葡萄糖代谢缺陷的多种其他lab。
187.由于葡萄糖的味道比半乳糖的味道更甜，因此使用这些葡萄糖缺陷型突变体来发酵乳可提高发酵产品的甜度，同时显著降低乳糖浓度而不提高碳水化物的总浓度(如wo2013/160413中更详细描述的)。
188.根据一个替代方案，葡萄糖代谢缺陷的乳酸菌可包括葡萄糖缺陷的但发酵半乳糖的嗜热链球菌菌株和/或葡萄糖摄取缺陷的德氏乳杆菌菌株。葡萄糖摄取缺陷的德氏乳杆菌菌株可代谢乳糖并且利用由细胞内乳糖水解获得的葡萄糖。
189.起子培养物可包含另外的lab或者可由这些菌株的混合物组成。
190.因此，本发明提供了制备发酵乳产品的方法，其包括其中发酵乳的步骤，其中：
191.(a)所述发酵通过起子培养物来起始，所述起子培养物包含选自chcc16731、chcc15757和chcc16404的一种或更多种嗜热链球菌菌株以及德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株chcc16159，
192.(b)所述发酵通过在发酵期间乳糖浓度的降低来终止，并且
193.(c)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起。
194.在本发明的方法中使用这些葡萄糖缺陷型lab提供由此制备的发酵乳产品具有甜味的额外优势。
195.本技术的这一实施方案可利用乳糖浓度降低的乳产品来进行发酵以使发酵由于在发酵期间乳糖浓度的降低而终止。因此，本发明还提供了制备发酵乳产品的方法，其包括其中发酵乳的步骤，其中：
196.(a)所述发酵使用乳和起子培养物来起始，其中在添加起子培养物之前，乳中的乳糖浓度低于30mg/g，并且其中所述起子培养物包含葡萄糖代谢缺陷的嗜热链球菌和葡萄糖代谢缺陷的德氏乳杆菌保加利亚亚种，
197.(b)所述发酵通过在发酵期间乳糖浓度的降低来终止，并且
198.(c)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起。
199.乳中的初始乳糖浓度(即，在添加起子培养物之前的浓度)可为50mg/g至5mg/g，或者25mg/g至5mg/g。
200.乳糖浓度降低的乳可商购获得或者根据本领域中公知的方法制备。e：通过向发酵添加乳糖酶来制备发酵乳产品的方法
201.在该替代方案中，本发明提供了制备发酵乳产品的方法，其包括其中发酵乳的步骤，其中：
202.(a)所述发酵通过起子培养物来起始，所述起子培养物包含能够代谢乳中存在的一种或数种碳水化合物的乳酸菌，
203.(b)所述发酵通过在发酵期间该一种或数种碳水化合物的浓度的降低来终止，并且
204.(c)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起，
205.并且其中所述发酵在存在初始浓度为500nlu/l至5000nlu/l的乳糖酶的情况下进行。
206.在一个优选方面，该方法可进一步表征为包括其中将发酵产品在15℃至45℃的温度下包装的步骤。
207.在另一些替代方案中，所述方法的特征可在于如果在发酵终止之后储存在发酵用温度下，发酵产品的ph值在20小时的时间内维持在0.3个ph单位的范围内或者维持在0.1个ph单位的范围内。
208.乳糖酶是水解乳糖并生成葡萄糖和半乳糖的酶。乳糖酶可从很多来源商购获得并且可根据本领域中公知的方法制备而成。乳糖酶活性可确定为中性乳糖酶活性(neutral lactase activity，nlu)的单位数。根据本发明，使用food chemicals codex(fcc)iv方法所述的方法来确定乳糖酶活性。f：基于用方法(a)至(e)之一获得的产品来制备脱乳清发酵乳产品的方法
209.上述方法a至e特别地有利于制备脱乳清发酵乳产品，例如脱乳清酸奶(希腊式酸奶，黎巴嫩浓缩酸奶(labneh)、夸克奶酪、佛朗美格
·
福威斯干酪(fromage frais)和奶油乳酪。脱乳清发酵乳产品以以下制备步骤为特征，其中在发酵之后通过分离和/或过滤除去发酵乳中的乳清，得到具有高蛋白质浓度的相对浓稠产品。
210.在常规的发酵工艺之后使用超滤或使用分离器来浓缩发酵乳将在浓缩步骤期间导致后酸化。后酸化在分离工艺之前和期间可影响数个因素。首先，后酸化可导致ph的进一步降低。作为ph降低的一个结果，凝胶硬度将增大。作为ph降低的另一个结果，酸奶中颗粒尺寸将增大。最后，由于lab持续地产生和分泌胞外多糖(或者细胞外多聚体物质或eps)剪切应力将增大。
211.结果，用该方法制备的发酵乳缺乏均质性。这将影响分离工艺中与斯托克斯定律(stokes’s law)直接相关的主要参数，例如颗粒尺寸、颗粒水结合能力、蛋白质基质中浆液相和固定水的粘度。由于ph的进一步降低(例如从例如4.65降低至ph 4.30)，可获得较低的产品收率并且可观察到在味道、酸度和质地方面的产品质量变化。因此，在现有技术中，使用包括抑制后酸化的方法步骤的方法，最频繁地使用冷却步骤来制备脱乳清发酵乳产品。然而，冷却步骤需要显著量的能量并且对产品的进一步加工具有不利影响。
212.图7提供了关于使用蛋白质浓缩步骤来制备发酵乳产品的不同方法的概述。图7的左侧部分示出了在发酵之前使用浓缩步骤的方法，图7的右侧部分示出了在发酵之后使用浓缩步骤的方法，其通过使用离心或超滤来进行分离。
213.图8至图11示出了原理验证实验的结果，所述结果说明了通过将上述降低后酸化的方法与用于制备发酵乳产品的方法组合可实现的优势，所述用于制备发酵乳产品的方法包括其中通过分离和/或过滤来除去发酵乳中的乳清得到具有高蛋白质浓度的相对粘稠酸奶的步骤。这些结果是用以下实验设置获得的。
214.将以下两批商购培养物在相同类型的乳基质中进行发酵：
215.·
mild 2.0(来自于丹麦的科
·
汉森(chr.hansen))；
216.·
培养物类型premium 1.0(70％) 培养物类型ssc17(30％)(二者均来自于丹麦的科
·
汉森)。
217.所使用的乳基质为脱脂乳；发酵在40℃的温度下进行。
218.将两批料发酵至ph 4.60。采取样品以用于质地分析，并继续进行发酵直至达到4.45的ph。再次，对产品的质地进行分析。在达到指定的ph值后，将四份酸奶凝乳(在两个不同ph值4.60和4.45下的两种不同培养物)在后处理装置(fh scandinox)中进行处理。向培养物施加不同的反压力，4巴至9巴或者4巴至12巴。使用流变仪来确定剪切应力和复数模量。
219.图8至图11显示，剪切应力和复数模量二者在ph4.45下均比在ph4.60下高。进一步地，作为ph值从4.60下降至4.45的结果，发酵乳产品的质地提高。
220.在两个ph水平下，培养物premium 1.0 ssc17相比较于mild 2.0均产生较高的剪切应力和复数模量。
221.当施加4巴高至9巴或者4巴高至12巴的反压力时，质地显著降低。
222.因此，该原理验证实验表明，用上述控制后酸化的方法使用较小的剪切应力和复数模量来从发酵乳产品中分离乳清是可能且有利的。质地取决于培养物的类型、ph和在进入到分离器或uf中之前的工艺期间施加的反压力。即使已向酸奶凝乳施加高反压力，也不可能使ph 4.45下的质地降低至4.60下的质地。
223.因此，控制后酸化的方法提供了使用lab培养物基于向发酵添加的碳水化合物来将乳发酵至特定ph的可能性。这些方法改进了在后发酵处理期间酸奶中ph的控制，并且因此将特别地改进分离步骤。另外，由于冷却不是必需的，可优化速度，并且提高生产收率。
224.根据本发明的这一方面，除其他实施方案之外还提供了以下实施方案：
225.1.一种制备脱乳清发酵乳产品的方法，其包括其中发酵乳的步骤，其中：
226.(a)所述发酵通过起子培养物来起始，所述起子培养物包含能够代谢乳中存在的一种或数种碳水化合物的乳酸菌，
227.(b)所述发酵通过在发酵期间该一种或数种碳水化合物的浓度的降低来终止，
228.(c)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起，
229.(d)从发酵乳产品中分离至少部分乳清。
230.2.一种制备脱乳清发酵乳产品的方法，其包括其中使用起子培养物来发酵乳的步骤，其中：
231.(i)所述起子培养物包含嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种，
232.(ii)所述发酵在22℃至45℃的温度下进行，
233.(iii)所述发酵通过在发酵期间碳水化合物浓度的降低来终止，
234.(iv)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起，
235.(v)从发酵乳产品中分离至少部分乳清，并且
236.其中分离乳清之前的发酵乳产品的特征在于：如果在发酵终止之后在步骤(ii)中的发酵用温度下储存、加工或维持，该产品的ph值在20小时的时间内维持在0.3个ph单位的范围内或者维持在0.1个ph单位的范围内。
237.3.一种制备发酵乳产品的方法，其包括：
238.(a)其中使用起子培养物来发酵乳的步骤，其中：
239.(i)所述发酵使用乳和起子培养物来起始，其中在发酵开始时，乳中的乳糖浓度为5mg/g至100mg/g，
240.(ii)所述起子培养物包含嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种，
241.(iii)所述发酵在22℃至45℃的温度下进行，
242.(iv)所述发酵通过在发酵期间乳糖浓度的降低来终止，
243.(v)所述降低至少还由乳酸菌的代谢活性引起；以及
244.(b)其中在15℃至45℃的温度下从发酵乳产品中分离至少部分乳清的步骤，
245.(c)其中将发酵产品在15℃至45℃的温度下包装的步骤，
246.其中所述发酵乳产品的特征在于，如果在发酵终止之后储存在步骤(ii)中的发酵用温度下，该产品的ph值在20小时的时间内维持在0.3个ph单位的范围内或者维持在0.1个ph单位的范围内。
247.4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中所述分离通过过滤来进行，包括使用喷嘴分离器、离心机、或者利用螺旋过滤器或陶瓷过滤器的超滤。
248.5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述脱乳清发酵乳产品以6％至13％的蛋白质含量和0％至10％的脂肪含量为特征。
249.6.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中所述脱乳清发酵乳产品以6％至10％的蛋白质含量为特征。
250.7.根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其中所述脱乳清发酵乳产品是酸奶、希腊式酸奶、黎巴嫩浓缩酸奶、夸克奶酪、佛朗美格
·
福威斯干酪或奶油酸奶。
251.8.根据实施方案1至7中任一项所述的方法，其中在不主动冷却发酵乳产品的情况下从发酵乳产品中分离至少部分乳清。
252.9.根据实施方案1至8中任一项所述的方法，其中所述起子培养物包含乳糖阴性菌株。
253.10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中所述起子培养物包含选自菌株chcc18944、chcc17861和chcc17862的一种或更多种lab。
254.11.发酵乳产品，其能够通过根据实施方案1至10中任一项所述的方法获得。
255.12.根据实施方案11所述的发酵乳产品，其中所述发酵乳产品是酸奶、水果酸奶、酸奶饮料或乳酪。
256.乳清的分离可使用本领域中常用于从发酵乳产品中分离乳清的喷嘴分离器(离心机)来进行。可替选地或另外地，可使用超滤系统，通常为螺旋过滤器或陶瓷过滤器。在另一个替代方案中，板框式过滤器被用于高固体蛋白质和脂肪含量(例如，全脂奶油乳酪)的应用。
257.脱乳清酸奶以6％至13％的蛋白质含量为特征。所述产品还可具有0％至10％的脂肪含量。
258.可替选地，所述发酵产品可以是夸克奶酪或佛朗美格
·
福威斯干酪。夸克奶酪或佛朗美格
·
福威斯干酪一般以6％至10％的蛋白质含量为特征。夸克奶酪或佛朗美格
·
福威斯干酪还可以6％至10％的脂肪含量为特征。
259.在另一个替代方案中，所述发酵产品是奶油乳酪。奶油乳酪可以以6％至13％的蛋白质含量为特征。奶油乳酪还可以以0％至35％的脂肪含量为特征。
260.在本发明这一方面的一些优选实施方案中，在不主动冷却发酵乳产品的情况下从发酵乳产品中分离至少部分的乳清。这并非意指将产品维持在发酵用温度下，而仅仅只是不对产品进行冷却。
261.在另一个实施方案中，制备脱乳清发酵乳产品的上述方法使用包含乳糖阴性菌株的起子培养物来进行。如上述部分b中所述的，使用乳糖阴性菌株来控制后酸化是特别有利的。因此，提供了制备发酵乳产品的方法，其使用包含选自菌株chcc18944、chcc17861和chcc17862的一种或更多种lab的起子培养物。
262.该实施方案特别地适于希腊式酸奶、夸克奶酪或奶油乳酪的制备。
263.g：使用方法(a)至(e)之一来制备帕斯塔菲拉塔乳酪产品的方法。
264.上述部分(a)至(e)中所述的本发明方法特别地适于帕斯塔菲拉塔乳酪的制备。帕斯塔菲拉塔乳酪是通过包括凝乳的热处理步骤的方法制备的乳酪。所述热处理可以以多种不同的方式来进行，所述方式包括将凝乳在热水或乳清中浸渍。在另一个替代方案中，向凝乳中注入蒸汽。所述热处理步骤赋予成品乳酪以纤维结构和特别的伸展特性。典型的帕斯塔菲拉塔乳酪是马苏里拉奶酪(mozzarella)和帕尔玛乳酪(provolone)、卡西欧卡伐罗奶酪(caciocavallo)、pallone di gravina和斯卡莫扎奶酪(scamorza)。
265.根据本发明的这一方面，除其他实施方案之外还提供了以下实施方案：
266.1.一种制备帕斯塔菲拉塔乳酪的方法，其包括其中发酵乳的步骤，其中：
267.(a)所述发酵通过起子培养物来起始，所述起子培养物包含能够代谢乳中存在的一种或数种碳水化合物的乳酸菌，
268.(b)所述发酵通过在发酵期间该一种或数种碳水化合物的浓度的降低来终止，并且
269.(c)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起，
270.(d)对发酵产品进行热处理，例如通过将发酵产品放入热水中或者向发酵产品中注入蒸汽来对发酵产品进行热处理。
271.2.一种制备帕斯塔菲拉塔乳酪的方法，其包括其中发酵乳的步骤，其中：
272.(i)所述起子培养物包含嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种，
273.(ii)所述发酵在22℃至45℃的温度下进行，
274.(iii)所述发酵通过在发酵期间碳水化合物浓度的降低来终止，
275.(iv)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起，并且
276.其中发酵乳产品的特征在于：如果在发酵终止之后储存在步骤(ii)中的发酵用温度下，该产品的ph值在20小时的时间内维持在0.3个ph单位的范围内或者维持在0.1个ph单位的范围内；并且
277.其中对发酵产品进行热处理，例如通过将发酵产品放入热水中或者向发酵产品中注入蒸汽来对发酵产品进行热处理。
278.3.一种制备帕斯塔菲拉塔乳酪的方法，其包括其中发酵乳的步骤，其中：
279.(a)其中使用起子培养物来发酵乳的步骤，其中：
280.(i)所述发酵使用乳和起子培养物来起始，其中在发酵开始时，乳中的乳糖浓度为5mg/g至100mg/g，
281.(ii)所述起子培养物包含嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种，
282.(iii)所述发酵在22℃至45℃的温度下进行，
283.(iv)所述发酵通过在发酵期间乳糖浓度的降低来终止，
284.(v)所述降低至少还由所述乳酸菌的代谢活性引起；以及
285.(b)其中将发酵产品在15℃至45℃的温度下包装的步骤，
286.其中发酵乳产品的特征在于，如果在发酵终止之后储存在步骤(ii)中的发酵用温度下，该产品的ph值在20小时的时间内维持在0.3个ph单位的范围内或者维持在0.1个ph单位的范围内；并且
287.其中对发酵产品进行热处理，例如通过将发酵产品放入热水中或者向发酵产品中注入蒸汽来对发酵产品进行热处理。
288.4.根据实施方案1至3中任一项所述的制备帕斯塔菲拉塔乳酪的方法，其中所述乳酸菌能够代谢乳糖和葡萄糖，并且其中在添加起子培养物之前，乳中的乳糖浓度低于200mg/g，例如为100mg/g至5mg/g，或者为50mg/g至5mg/g，或者为25mg/g至5mg/g。
289.5.根据实施方案1至3中任一项所述的制备帕斯塔菲拉塔乳酪的方法，其中所述乳酸菌不能够代谢乳糖，并且其中在添加起子培养物之前，乳中可被所述乳酸菌代谢的碳水化合物的总浓度低于45mg/g。
290.6.根据实施方案1至3中任一项所述的制备帕斯塔菲拉塔乳酪的方法，其中所述乳酸菌能够代谢乳糖和半乳糖，但是是葡萄糖缺陷型的。
291.7.根据实施方案1至6中任一项所述的制备帕斯塔菲拉塔乳酪的方法，其中所述发酵在存在初始浓度为500nlu/l至5000nlu/l的乳糖酶的情况下进行。
292.8.根据实施方案1至7中任一项所述的制备帕斯塔菲拉塔乳酪的方法，其中发酵的终止通过可被所述乳酸菌代谢的所述一种或数种碳水化合物的总浓度降低至小于30mg/g的值来引起，所述值包括25mg/g至0.01mg/g的范围，或5mg/g至0.01mg/g的范围。
293.9.根据实施方案1至8中任一项所述的制备帕斯塔菲拉塔乳酪的方法，其中当储存在发酵温度下时所述发酵产品的ph值在20小时的时间内维持在0.3个ph单位的范围内。
294.10.根据实施方案1至9中任一项所述的制备帕斯塔菲拉塔乳酪的方法，其中所述发酵在30℃至45℃的温度下进行。
295.11.根据实施方案1至10中任一项所述的制备帕斯塔菲拉塔乳酪的方法，其中在发酵终止之后，将发酵产品在15℃至45℃的温度下包装。
296.12.根据实施方案1至11中任一项所述的制备帕斯塔菲拉塔乳酪的方法，其中所述发酵产品的特征在于：如果在所述发酵终止之后储存6个月的时间，该产品的ph值维持在0.3个ph单位的范围内，或者
297.所述发酵产品的特征在于：如果在发酵终止之后储存12个月的时间，该产品的ph值维持在0.3个ph单位的范围内。
298.13.发酵乳产品，其能够通过实施方案1至12中任一项所述的方法获得，其中所述乳产品是帕斯塔菲拉塔乳酪。
299.14.根据实施方案13所述的发酵乳产品，其中所述帕斯塔菲拉塔乳酪选自马苏里拉奶酪、帕尔玛乳酪、卡西欧卡伐罗奶酪、pallone di gravina和斯卡莫扎奶酪。
300.更详细地，本发明的制备帕斯塔菲拉塔乳酪的方法可包括以下方法步骤：
301.·
获得具有标准化的蛋白质、脂肪和固体的乳产品；
302.·
将温度调节至凝固温度(32℃至38℃)；
303.·
添加acidifix培养物(嗜热链球菌chcc17861和德氏乳杆菌保加利亚亚种chcc18944)；
304.·
添加凝固剂；
305.·
使乳在15分钟至60分钟内凝固，切割并搅拌凝乳；
306.·
任选地加热(热烫)凝乳；
307.·
酸化凝乳(覆盖有乳清或者脱乳清)；
308.·
在热水中或者通过蒸汽注入(在“干拉伸器中”)或者通过其他方式的加热并机械地处理凝乳来拉伸凝乳；
309.·
形成并冷却乳酪；
310.·
冷却乳酪并对乳酪加盐；
311.·
将乳酪包装。
312.在一个替代实施方案中，本发明的制备帕斯塔菲拉塔乳酪的方法可包括以下方法步骤：
313.·
获得具有标准化的蛋白质、脂肪和固体的乳产品；
314.·
添加足够用于酸化培养物的蔗糖；
315.·
将温度调节至凝固温度(32℃至38℃)；
316.·
添加acidifix培养物(嗜热链球菌chcc17861和德氏乳杆菌保加利亚亚种chcc18944)；
317.·
添加凝固剂；
318.·
使乳在15分钟至60分钟内凝固，切割并搅拌凝乳；
319.·
任选地加热(热烫)凝乳；
320.·
酸化凝乳(覆盖有乳清或者脱乳清)；
321.·
在热水中或者通过蒸汽注入(在“干拉伸器中”)或者通过其他方式的加热并机械地处理凝乳来拉伸凝乳；
322.·
形成并冷却乳酪；
323.·
冷却乳酪并对乳酪加盐；
324.·
将乳酪包装。
325.在一个替代实施方案中，本发明的制备帕斯塔菲拉塔乳酪的方法可包括以下方法步骤：
326.·
获得具有标准化的蛋白质、脂肪和固体的乳产品；
327.·
添加足够用于酸化培养物的蔗糖；
328.·
将温度调节至凝固温度(32℃至38℃)；
329.·
添加acidifix培养物(嗜热链球菌chcc17861和德氏乳杆菌保加利亚亚种chcc18944)；
330.·
添加凝固剂；
331.·
使乳在15分钟至60分钟内凝固，切割并搅拌凝乳；
332.·
任选地加热(热烫)凝乳；
333.·
酸化凝乳(覆盖有乳清或者脱乳清)；
334.·
在6℃至25℃的温度下储存所酸化的凝乳；
335.·
在热水中或者通过蒸汽注入(在“干拉伸器中”)或者通过其他方式的加热并机械地处理凝乳来拉伸凝乳；
336.·
形成并冷却乳酪；
337.·
冷却乳酪并对乳酪加盐；
338.·
将乳酪包装。
339.在所有实施方案中，可在包装之前将乳酪切片、切碎、切块、切丁或者通过其他方式分开。
340.附图标记
341.图1比较了嗜热链球菌(s.thermophilus)菌株chcc6008在用于接种包含1％和3％乳糖的乳时的酸化活性。
342.图2比较了当用于发酵补充有蔗糖的乳时，嗜热链球菌chcc15914和德氏乳杆菌保加利亚亚种chcc10019的酸化活性与嗜热链球菌chcc17862和德氏乳杆菌保加利亚亚种chcc18944的酸化活性。
343.图3示出了当用于发酵补充有蔗糖的乳并且与嗜热链球菌chcc15914的酸化活性相比时，不同比例的嗜热链球菌chcc17861和德氏乳杆菌保加利亚亚种chcc18944的酸化活性。
344.图4示出了使用本发明的方法(acidifix)和现有技术方法(yfl
‑
904)的后酸化，即发酵之后两种不同的发酵乳产品中的ph发展。
345.图5示出了在发酵终止之后经sweety发酵的培养物在6℃下在42天内的ph发展(即，后酸化)。该图示出了在这些条件下ph改变小于0.1个ph单位。
346.图6示出了在具有和不具有乳糖酶下发酵的不同培养物中，在于冷却温度下储存期间，在48天的时间内的ph发展。
347.图7显示具有高蛋白质、脂肪和固体水平的嗜热和嗜温应用的发酵乳的制备，其示出了关于在发酵之前使用蛋白质浓缩的方法(左侧)和在发酵之后通过利用超离心或超滤的分离来使用蛋白质浓缩的方法(右侧)的概述。其是在发酵之前使用浓缩的过程和在发酵之后通过乳清分离使用浓缩的过程的实例。
348.图8示出了在用ssc17发酵之后在从乳产品中分离乳清期间ph对剪切应力的作用。
349.图9示出了在用mild2.0发酵之后在从乳产品中分离乳清期间ph对剪切应力的作用。
350.图10示出了在用ssc17发酵之后在从乳产品中分离乳清期间ph对复数模量或凝胶硬度的作用。
351.图11示出了在用mild2.0发酵之后在从乳产品中分离乳清期间ph对复数模量或凝胶硬度的作用。
352.lab菌株：
353.后续的实施例使用ch菌株，其中一些菌株根据科
·
汉森的在先专利申请已经保藏。有关所述菌株的更多信息由下述相应的专利申请和保藏提供。
354.嗜热链球菌chcc6008针对wo2011/000879于2006年3月23日以登录号dsm 18111保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124。
355.德氏乳杆菌保加利亚亚种chcc10019针对wo2011/000879于2007年4月3日以登录号dsm 19252保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124。
356.嗜热链球菌chcc15757针对wo2013160413于2012年4月3日以登录号dsm 25850保
藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124。
357.嗜热链球菌chcc16404针对wo2013160413于2012年12月12日以登录号dsm 26722保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124。
358.德氏乳杆保加利亚亚种chcc16159针对wo2013160413于2012年9月6日以登录号dsm 26420保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124。
359.后续实施例中使用的剩余菌株已在本技术中保藏或者可从科
·
汉森商购获得。
360.实施例1：使用低乳糖乳来制备发酵乳产品的方法
361.获得包含1％乳糖(10g/l)的定制乳(从select milk producers,inc.,texas,usa获得)。通过向1％乳糖乳中添加2％乳糖(20g/l)来制备包含3％乳糖(30g/l)的乳。
362.向乳中接种嗜热链球菌菌株chcc6008(0.01％f
‑
dvs)并在37℃的温度下维持20小时。随时间自动地确定酸化(ph值)。
363.结果示于图1中。使用1％乳糖的发酵显示接近理想的酸化谱。最初，产品以高速率酸化，但是在约6小时之后酸化突然停止在ph 4.8，并且在接下来的14小时内培养物的ph保持不变，即使将培养物维持在37℃的温度下。这表明酸化完全终止。
364.利用使用3％乳糖的发酵作为对照。最初，产品以与基于1％乳糖的发酵相同的速率酸化。这表明，1％(10mg/g)的乳糖浓度并没有太低以致于抑制初始阶段的发酵。
365.但是使用3％乳糖的发酵在ph 4.8时未终止，而是继续进行酸化直至达到约4.5的ph，在此状态下由细菌产生的酸抑制进一步的发酵。因此，发酵以低率进行直至达到约4.2的ph。
366.这些结果证明，可令人吃惊地利用碳水化合物(在此为乳糖)浓度来控制发酵的终止。这种进行方式允许其中通过发酵来获得期望的ph值并且在此之后不会观察到后酸化的工艺。
367.实施例2：使用乳糖缺陷型lab来制备乳产品的方法
368.乳糖缺陷型突变体分离自eps阳性菌株嗜热链球菌(st)chcc15914和德氏乳杆菌保加利亚亚种(lb)chcc10019。所述菌株在uv诱变之后分别选择为在具有1％乳糖和200mg/ml x
‑
gal的m17上(对于chcc15914)上的白色菌落以及在具有1％乳糖和200mg/ml x
‑
gal的mrs琼脂板上(对于chcc10019)的白色菌落。
369.两种野生型菌株均具有β
‑
半乳糖苷酶活性，并且野生型菌落由于β
‑
半乳糖苷酶的活性而呈现为蓝色。
370.由chcc10019分离到一种乳糖缺陷型突变体并且命名为chcc18944(该突变体在欧洲专利申请14173196中被鉴定为chcc18994；但是申请人的内部登录号改变并且现在为chcc18944；dsmz登录号未改变并且因此仍为dsm28910)。
371.由chcc15914分离到两种乳糖缺陷型突变体并且分别命名为chcc17861和chcc17862。
372.分离的乳糖缺陷型突变体的生长特征确定如下：
373.lb chcc18944的表型：lac
‑
，suc
‑
，gal
‑
，glc
374.st chcc17861的表型：lac
‑
，suc ，gal ，glc
375.st chcc17862的表型：lac
‑
，suc ，gal ，glc
376.测序全部三种突变体的完整乳糖操纵子并与相应的野生型菌株进行比较以揭示
突变类型。
377.与母本菌株chcc15914进行比较揭示，chcc17861在lacz基因(编码β
‑
半乳糖苷酶)的开始具有额外的“t”核苷酸，导致在编码序列中在所述突变下游数个核苷酸处产生终止密码子。chcc17862显示缺失一个核苷酸，也中断lacz基因的编码序列。
378.对于chcc18944，鉴定到在lacz基因内部的突变。这导致lacz内8个核苷酸的交换(从5
’‑
ctt cca agc
‑3’
交换成5
’‑
cgc tac tat
‑3’
)并且因此导致3个氨基酸的改变(从leu
‑
pro
‑
ser变成arg
‑
tyr
‑
tyr)，说明乳糖缺陷型表型。
379.所有突变体当作为单独菌株或组合使用(st lb)时，基于不同于乳糖的可发酵碳水化合物的添加来使乳酸化。例如使用在mrs中的过夜培养物(lb野生型和lb lac
‑
突变体)、具有1％乳糖的m17中的过夜培养物(st野生型)或具有不同浓度蔗糖的m17中的过夜培养物(1％和0.5％；用st lac
‑
突变体进行发酵)来确定乳糖缺陷型培养物的酸化活性。接种乳并在37℃下通过ph发展来监测发酵。
380.图2和图3中分别示出了在发酵温度下在20小时和40小时内的ph发展，并且显示乳糖缺陷型菌株代谢蔗糖，产生与由能够代谢乳糖的亲本lab引起的过程几乎一样快的发酵过程。当蔗糖耗尽时，蔗糖驱动的发酵过程立即终止并且进入平线。在由碳水化合物耗尽引起的发酵终止之后，ph在约ph 4.5保持稳定。当作为单独菌株或者作为st突变体之一与lb突变体的混合物(混合物示于图3中)使用chcc17861、chcc17862或chcc18944时，发现非常稳定的最终ph。这类似于在制备典型酸奶的发酵方法中使用的起子培养物。
381.在菌株chcc17861和chcc17862之间未观察到显著差异。因此，蔗糖的添加提供了酸化活性的非常精确的控制。
382.在一些发酵中，在混合培养物的ph曲线中观察到的“肩”形成，表明在酸产生完全停止之前代谢转变(图3)。为了对其进行进一步研究，改变st:lb的比例并且这导致肩形成的改变。降低lac
‑
st的浓度并且增加lac
‑
lb菌株的浓度导致ph肩减小以及甚至更加水平的ph“曲线”。
383.另一方面，令人感兴趣的是，使用100％st chcc17861导致在蔗糖耗尽时酸产生完全中断并且消除了ph肩，但是ph下降停止在0.3点更高的ph值处(图3)。
384.在所有情况下，ph均在4.75处保持稳定，直至发酵期结束(48小时)。
385.在st/lb共发酵中，德氏乳杆菌保加利亚亚种部分负责最终的ph下降并且还负责后酸化的主要部分。因此，在大多数的酸奶发酵工艺中，lb的浓度低于st的浓度。
386.这表明，可通过添加的蔗糖或其他可发酵碳水化合物的浓度来完全控制ph值，因为保加利亚乳杆菌(lb.bulgaricus)可容易地增加。
387.lac
‑
培养物不仅在例如6小时之后导致较高的最终ph，而且还可具有显著更低的后酸化并且因此具有延长的货架期。
388.在一些实验中，观察到在发酵终止之后ph非常稳定持续约5小时，然后在接下来的10小时内略微降低(数据未示出)。这显然由自发回复体引起，即lab通过自发突变获取了利用乳糖的能力。
389.实施例3：制备具有延长货架期的发酵乳产品的方法
390.具有延长货架期的酸奶(els酸奶)通过用可商购获得的fd
‑
dvs yfl
‑
904来发酵乳来制备，并且在另外的发酵中使用新培养物f
‑
dvs acidifix 2.0(包含嗜热链球菌
chcc17861和德氏乳杆菌保加利亚亚种chcc18944，在实施例2中进行了描述)来制备。
391.表1
‑
配方esl酸奶：
392.乳基质
[0393][0394]
milkoscan分析：脂肪：3.70％蛋白质：3.05％
[0395]
在发酵之后向白色物料添加12％糖浆
[0396]
使用以下参数来进行发酵和加工：
[0397]
混合温度：45℃至50℃
[0398]
水化时间：20分钟
[0399]
过程：
[0400]
均化压力：150巴 30巴(总共180巴)
[0401]
巴氏灭菌条件：95℃/4分钟
[0402]
冷却温度：低于10℃
[0403]
发酵：
[0404]
发酵温度：43℃(对于yf
‑
l904)和39℃(对于acidifix)
[0405]
最终ph：4.35
±
0.05
[0406]
当达到期望的ph后人工破碎凝乳。
[0407]
向88％的发酵乳基质中添加12％糖浆。人工搅拌以使其充分混合。
[0408]
通过gea中试装置来对酸奶进行热杀菌(thermise)：
[0409]
均化压力：0巴
[0410]
热杀菌条件：65℃/30秒
[0411]
填充到瓶中(填充温度：28℃至33℃)。
[0412]
在发酵之后立即、在热杀菌之后以及在于不同的温度下储存6天之后分析两种产品的后酸化活性。结果示于图4中并且显示用acidifix获得的产品的ph在加工和储存期间具有高稳定性。
[0413]
实施例4：使用葡萄糖缺陷型lab来制备发酵乳产品的方法
[0414]
材料和方法
[0415]
乳基质(1.0％脂肪和4.5％蛋白质)
[0416]
成分：市售乳(1.5％脂肪 0.5％脂肪 脱脂奶粉以达到所需的脂肪和蛋白质水平)9.5％w/w脱脂奶粉 90.5％自来水的混合物
[0417]
市售乳：arla harmonie(0.5％脂肪)和arla harmonie(1.5％脂肪)
[0418]
脱脂奶粉：arla foods,gin 990214
[0419]
操作：将乳和奶粉混合，搅拌，热处理90℃，20分钟
[0420]
乳糖：
[0421]
产品：乳糖一水合物(gin 500449,批次0005078607)
[0422]
生产商：german lac
‑
sachsenmilch
[0423]
作为19％w/w溶液添加至酸奶基质，以获得指定的正确水平
[0424]
配方：0.6kg乳糖一水合物 2.4kg自来水
[0425]
过程：在搅拌的同时加热，之后进行巴氏灭菌(95℃，5分钟)
[0426]
起子培养物：
[0427]
f
‑
dvs sweety 1.0由以下菌株的共混物组成：
[0428]2‑
脱氧葡萄糖抗性菌株
[0429]
嗜热链球菌chcc16731(chcc11976的超乳糖发酵葡萄糖分泌突变体)
[0430]
嗜热链球菌chcc15757(chcc14944的2
‑
脱氧葡萄糖抗性突变体)
[0431]
嗜热链球菌chcc16404(chcc15757的超乳糖发酵葡萄糖分泌突变体)
[0432]
德氏乳杆菌保加利亚亚种chcc16159(chcc10019的2
‑
脱氧葡萄糖抗性突变体)
[0433]
嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的超乳糖发酵葡萄糖分泌突变体的低后酸化特性。
[0434]
嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的超乳糖发酵葡萄糖分泌突变体的选择如名称为“乳酸菌用于制造具有增强的天然甜度的发酵食品的用途”的wo2013/160413中所述来进行。
[0435]
为了显示培养物在用于酸奶制备的标准设置中的低后酸化特性，使用0.024％的sweety 1.0培养物共混物之冷冻直投式培养物(frozen direct vat set culture，f
‑
dvs)来接种3升乳基质并在43℃下发酵乳。
[0436]
用具有标准ph电极和cinac 4.0软件的cinac ph记录器(alliance仪器)来追踪酸化。当在43℃下ph达到4.55时，发生乳的凝固。随后，将酸奶冷却并在7℃
±
1.5℃下温育42天。随后，在42天的时间内追踪ph发展(图5)。由图5可见，在7℃
±
1.5℃下储存42天之后的ph发展小于0.1个ph单位，表明极低的后酸化水平。
[0437]
该数据表明，葡萄糖分泌菌株的酸奶共混物和本发明方法的使用将使乳凝固，使最终ph在7℃
±
1.5℃下维持非常稳定持续43天并且增加发酵产品的甜度。
[0438]
分泌葡萄糖的链球菌(streptococcus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种的混合培养物在发酵期间代谢乳中存在的全部或几乎全部乳糖。因此，lab不再引起后酸化。
[0439]
实施例5：在发酵酸奶中使用乳糖酶时的低后酸化
[0440]
令人吃惊地发现，与在无乳糖酶下制备的酸奶相比，在制备酸奶的方法中添加乳糖酶显著降低后酸化。
[0441]
材料和方法
[0442]
乳基质(0.1％脂肪和4.5％蛋白质)
[0443]
成分：商购乳(0.1％脂肪) 脱脂奶乳粉的混合物以达到所述蛋白质水平
[0444]
商购乳：arla(0.1％脂肪)
[0445]
脱脂乳粉末：milex 240,arla foods,批号990214
[0446]
操作：将奶粉和乳混合，在5℃下水化过夜，热处理90℃/20分钟
[0447]
乳糖酶：
[0448]
产品：ha
‑
乳糖酶5200(gin 450805)
[0449]
生产商：科
·
汉森有限公司(chr.hansen a/s)
[0450]
起子培养物：
[0451]
f
‑
dvs yf
‑
l706,gin 685141
[0452]
f
‑
dvs yf
‑
l901,gin 685142
[0453]
f
‑
dvsmold1.0,gin 702897
[0454]
f
‑
dvscreamy1.0,gin 706168
[0455]
f
‑
dvspremium1.0,gin 706161
[0456]
全部均来自于科
·
汉森有限公司
[0457]
以3升规模进行发酵。将培养物以0.02％接种，并在43℃下发酵样品。将3500nlu/l用量的乳糖酶与培养物一起添加至乳基质。用ph计1120(mettler
‑
toledo ag,52120653)监测酸化，并且发酵停止在ph 4.55。将发酵乳产品以标准化方式进行搅拌，进一步加压并冷却(2巴，25℃)，之后储存在6℃。然后，使用ph计1120(mettler
‑
toledo ag,52120653)在1天、7天、14天、21天和48天时监测样品的ph。使用hplc用dionex carbopac pa 20 3*150mm柱(thermo fisher scientific，产品号060142)来确定在发酵后第一天酸奶中乳糖、葡萄糖和半乳糖的浓度(mg/g)。
[0458]
结果示于图6中，图6示出了在储存期间ph值的发展并且由此示出了后酸化。进一步的结果示于表1中，在表格下方示出了有关在用不同培养物于具有和不具有乳糖酶下制备的酸奶中获得的ph值的差异的概述。该差异由后酸化引起并且使用f
‑
dvsmild1.0酸奶作为实例来确定：具有3500nlu/l乳糖酶的f
‑
dvsmild1.0酸奶在21天后ph为4.44，而不具有乳糖酶的f
‑
dvsmild1.0酸奶的ph为4.36。对于两种酸奶而言，发酵均停止在4.55。经乳糖酶处理的酸奶的后酸化为4.55
‑
4.44＝0.11，对于不具有乳糖酶的酸奶，后酸化为4.55
‑
4.36＝0.19。因此，在具有和不具有3500nlu/l乳糖酶下用f
‑
dvsmild1.0发酵的酸奶之间的后酸化差异为0.19
‑
0.11＝0.08。
[0459]
表2：在具有和不具有3500nlu/l乳糖酶下用0.02％的表格中的培养物制备的酸奶之间的后酸化差异
[0460][0461]
所示数据表明可使用与乳糖酶组合的选定科
·
汉森商购培养物来获得后酸化降低的酸奶。f
‑
dvsmild1.0、f
‑
dvscreamy1.0和f
‑
dvspremium1.0全部均显示出低后酸化。在培养物yf
‑
l901中后酸化的降低较不显著，并且对f
‑
dvs yf
‑
l706未观察到后酸化的降低。
[0462]
表3：使用hplc确定在发酵后第1天在具有和不具有3500nlu/l乳糖酶下制备的酸奶中乳糖、葡萄糖和半乳糖的浓度(mg/g)
[0463]
[0464][0465]
表3显示，在乳糖酶存在下发酵的培养物具有非常低的残余乳糖，但是残余葡萄糖和半乳糖的浓度较高。因此，对菌株观察到后酸化的事实可通过可供lab代谢利用的碳水化合物的高总残余量来解释。
[0466]
鉴于碳水化合物的残余浓度，后酸化的程度仍然非常低并且因此是令人吃惊的。低后酸化显得由微生物中碳水化合物源的代谢转变的需求引起。换言之，显示低后酸化的培养物包含对碳水化合物源从乳糖至葡萄糖的转变进行抗争的菌株。
[0467]
保藏和专家解决方案
[0468]
申请人要求，本技术保藏的下述微生物样品在授予专利权日之前仅可供专家利用。
[0469]
嗜热链球菌chcc16731于2014年6月4日以登录号dsm 28889保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124。
[0470]
嗜热链球菌chcc15914于2014年6月12日以登录号dsm 28909保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124。
[0471]
德氏乳杆菌保加利亚亚种chcc18944于2014年6月12日以登录号dsm 28910保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124。
[0472]
嗜热链球菌chcc17861于2014年6月12日以登录号dsm 28952保藏在dsmz
‑
德国微生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124。
[0473]
嗜热链球菌chcc17862于2014年6月12日以登录号dsm 28953保藏在dsmz
‑
德国微
生物菌种保藏中心，因霍芬路7b，布伦瑞克d
‑
38124。
[0474]
保藏根据布达佩斯条约基于用于专利程序目的的微生物保藏的国际认可进行。
[0475]
参考文献
[0476]
us2010/0021586
[0477]
wo2006/042862a1
[0478]
wo2010/139765
[0479]
wo2013/169205
[0480]
wo2011/000879
[0481]
pool等,metabolic engineering,第8卷,2006,456
‑
464