1.本发明涉及纳米材料与微生物领域,特别涉及一种光动力纳米抗菌材料及其制备方法和应用。
背景技术:
2.致病菌是危害人类生命与健康的重要问题,随着抗生素的滥用,细菌产生耐药性,药物的抗菌效率降低,致病菌感染加重,引发一系列危害。致病菌的问题加大对新型抗菌剂的需求。纳米材料由于其特殊的尺寸效应和化学反应位点,具有独特的抗菌机制,不易引发耐药性,成为新型抗菌剂的研究热点。其中二硫化钼(mos2),相比于金属、光催化型纳米材料,具有较高的比表面积、负载率、良好的生物相容性;相比于石墨烯,本实验发现mos2具有更好的抑菌性能,能够通过产生活性氧和氧化谷胱甘肽对细菌造成损伤,在抗菌领域具有极大的应用潜力。然而mos2表面带负电不能与细菌结合,抗菌效果不能满足目前的抗菌需求。
3.为了充分发挥mos2在抗菌领域的潜力,提高其抗菌性能,壳聚糖(chitosan,cs)作为一种自然界少见的碱性多糖,氨基带有正电荷,能够与带负电荷的细菌通过静电作用相结合,破坏细胞壁通透性,促使胞内生物活性物质泄露。目前研究发现mos2与有机抗菌材料通过混合、搅拌等吸附的方式结合,虽然在一定程度上提高抗菌活性,但是不能保证复合材料的稳定性,减少复合材料与细菌的接触,使材料不能发挥有效的抗菌效果。此外,由于细胞结构的不同,壳聚糖对革兰氏阴性菌具有抗菌优势,但对细胞壁较厚的革兰氏阳性菌抗菌性能较弱,这种差异致使其不能满足广谱抗菌需求。
技术实现要素:
4.针对现有技术的不足,本发明提供了一种光动力纳米抗菌材料及其制备方法和应用。本发明通过将壳聚糖与mos2共价结合后,将光敏剂ce6物理吸附到m
‑
cs的表面,所制备的光动力纳米抗菌材料展现出广谱、高效的抗菌效果,在抗菌领域具有广阔的应用前景。
5.本发明的技术方案如下:
6.一种光动力纳米抗菌材料,所述光动力纳米抗菌材料是通过在壳聚糖化学功能化mos2上负载光敏材制备得到。
7.所述光动力纳米抗菌材料的制备包括如下步骤:
8.(1)将疏基乙酸加入mos2分散液中,超声处理后,加入壳聚糖,再次超声得到胶体溶液;
9.(2)依次加入edc与nhs,超声、搅拌后,进行纯化、离心、干燥后得到m
‑
cs粉末,将m
‑
cs粉末加水得到m
‑
cs分散液;
10.(3)将ce6溶液加入步骤(2)制备的m
‑
cs分散液中,超声、搅拌后,离心、干燥,即得m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料。
11.进一步地,步骤(1)中,所述mos2分散液制备的具体方法为:将mos2加水后,于20~
25℃超声分散4~6h配制得到质量浓度为1~2mg/ml的mos2分散液;所述疏基乙酸与mos2分散液的体积比为1:100~150,所述超声的温度为20~25℃,时间为16~24h。
12.进一步地,步骤(1)中,所述壳聚糖与mos2的质量比为1~2:1;所述再次超声的温度为20~25℃,时间为10~20min。
13.进一步地,步骤(2)中,所述edc、nhs与mos2的质量比为2
‑
3:1
‑
1.5:1;所述edc的纯度98~99%;所述nhs的纯度98~99%。
14.进一步地,步骤(2)中,所述超声的温度为20~25℃,时间为10~15min;所述搅拌的速度为600~800rpm,搅拌时间为40~60min。
15.进一步地,步骤(2)中,所述纯化的具体方法为:使用8~14kda的透析袋,先加入1
×
103~1.5
×
103ml 5~10mm乙酸透析1~2天,然后加入1
×
103~1.5
×
103ml超纯水透析1~2天;所述离心的速度为1
×
104~1.2
×
104rpm,时间为15~30min;所述干燥为真空冷冻干燥,温度为
‑
60~
‑
70℃,时间为24~48h;所述m
‑
cs分散液的质量浓度为0.8~1.2mg/ml。
16.进一步地,步骤(3)中,所述ce6溶液中ce6的质量浓度为1.8~2.5mg/ml,ce6溶液与m
‑
cs分散液的体积比为0.4~0.8:1;所述超声的温度为20~25℃,时间为10~30min;所述搅拌的速度为600~800rpm,时间为16~24h;所述离心的速度为1~1.2
×
104rpm,时间为15~30min;所述干燥为真空冷冻干燥,温度为
‑
60~
‑
70℃,时间为24~48h。
17.一种所述光动力纳米抗菌材料的应用,其特征在于,所述光动力纳米抗菌材料对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌中的一种或两种具有抗菌性。
18.进一步地,所述革兰氏阳性菌为蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌中的一种或两种;所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌o157:h7、鼠伤寒沙门氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌中的一种或多种。
19.本发明有益的技术效果在于:
20.(1)本发明先将壳聚糖与mos2共价键合得到m
‑
cs,然后将光敏材料ce6物理吸附在m
‑
cs表面,制备得到m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料。采用共价键的方式在mos2表面修饰壳聚糖,形成稳定的m
‑
cs复合材料,抗菌过程m
‑
cs与细菌表面静电结合,破坏细胞膜渗透性,并且加剧mos2氧化应激和片状结构对细菌的损伤,增强m
‑
cs的抗菌效果;同时采用吸附方式负载光敏剂ce6,相较于共价连接,表面吸附的ce6能够解离释放,使m
‑
cs复合材料暴露,与细菌表面相互作用,与此同时,光动力效应产生的单线态氧可近距离损害细菌细胞,进一步提高对致病菌的抗菌性能,展现出广谱、高效的抗菌效果,在抗菌领域具有广阔的应用前景。
21.(2)本发明通过负载光敏剂ce6构建mos2/cs/ce6三元复合纳米材料(即m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料),一方面m
‑
cs复合材料能够破坏革兰氏阴性菌的细胞壁渗透屏障,表面吸附的光敏剂ce6释放进入细菌胞内,缩短活性氧的作用距离,加剧对革兰氏阴性菌的氧化损伤;另一方面革兰氏阳性菌细胞壁上具有孔蛋白通道,释放的小分子ce6能够扩散进入胞内,对细胞壁较厚的革兰氏阳性菌发挥抗菌效果。因此m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料既能对革兰氏阳性菌发挥光动力抗菌优势,又能增强革兰氏阴性菌细胞壁的通透性进而增强抗菌效果,达到广谱、高效的抗菌目的。
22.(3)本发明中mos2具有良好的生物相容性,钼元素和硫元素是人体重要的元素,壳聚糖是一种天然抗菌剂,两者共价相连后采用物理吸附的方式负载ce6,通过较低的负载量
既提高广谱抗菌效率,同时对细胞不产生毒理性,实现安全的抗菌目标,拓宽m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料的应用范围。
附图说明
23.图1为本发明所述的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料的制备过程及光动力抗菌示意图。
24.图2为本发明对比例1的mos2、对比例5制备的m
‑
cs和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料的透射电镜图(tem)。
25.图3为本发明对比例1的mos2、对比例2的cs、对比例3的ce6、对比例5制备的m
‑
cs和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料的红外谱图(ftir)。
26.图4为本发明对比例1的mos2、对比例2的cs、对比例5制备的m
‑
cs和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料的x射线衍射图(xrd)。
27.图5为对比例1的mos2、对比例2的cs、对比例3的ce6、对比例5制备的m
‑
cs和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料的热重曲线图(tga)。
28.图6为对比例1的mos2、对比例2的cs、对比例3的ce6、对比例5制备的m
‑
cs和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料的zeta电位图。
29.图7为对比例1的mos2、对比例3的ce6、对比例5制备的m
‑
cs和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料的紫外可见光谱图(uv
‑
vis)。
30.图8为实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料在不同照射时间的单线态氧检测图。
31.图9为对比例1的mos2、对比例2的cs、对比例3的ce6、对比例5制备的m
‑
cs和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料对大肠杆菌的抗菌效果图。
32.图中:a、b分别为大肠杆菌在没有光照以及660nm光照下的菌落平板图(5,10,20μg/ml);c为相对应的大肠杆菌的存活率图。
33.图10为对比例1的mos2、对比例2的cs、对比例3的ce6、对比例5制备的m
‑
cs和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料对金黄色葡萄球菌的抗菌效果图。
34.图中:a、b分别为金黄色葡萄球菌在没有光照以及660nm光照下的菌落平板图(5,10,20μg/ml);c为相对应的金黄色葡萄球菌的存活率图。
35.图11为实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料对蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌o157:h7、鼠伤寒沙门氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的抗菌效果平板图。
具体实施方式
36.下面结合附图和实施例,对本发明进行具体描述。
37.本技术m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米材料的制备过程及其光动力抗菌示意图如图1所示。由图1可知,光动力纳米抗菌材料的制备过程为:首先,通过在mos2表面共轭巯基乙酸,将羧基与壳聚糖的氨基共价相连,然后采用混合搅拌的方式负载ce6,即,通过化学功能化、物理吸附两步骤制备m
‑
cs
‑
ce6复合纳米材料,所制备的复合纳米抗菌材料在660nm光照下对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌发挥抗菌作用。
38.实施例1
39.一种m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料,其制备包括如下步骤:
40.先将50mg mos2分散在25ml超纯水中,20℃下超声处理6h,将200μl体积的巯基乙酸加入到上述mos2分散液中,25℃超声处理24h以实现巯基在mos2表面的修饰。然后将65mg壳聚糖添加到混合液中,超声处理20min以形成均匀的胶体悬浮液。
41.将150mg edc和65mg nhs逐步加入到混合液中于25℃超声15min,在25℃下以600rpm搅拌反应1h将羧基活化以进行酰胺反应,
42.然后将反应混合物转移至透析袋中(8~14kda),分别用10mm乙酸(1.5
×
103ml)透析2天,超纯水(1.5
×
103ml)透析2天。将混合液以1.2
×
104rpm离心30min,于
‑
60℃真空冷冻干燥48h得到m
‑
cs粉末,然后加水超声分散,配制成浓度为1mg/ml的m
‑
cs分散液。
43.将37.5mg ce6溶于20ml二甲基亚砜(dmso)中配制成ce6溶液,加入25ml m
‑
cs分散液(1mg/ml),在20℃下超声处理30min使混合均匀,然后将混合液在黑暗中、800rpm下搅拌反应24h,待第二天用超纯水洗涤,1.2
×
104rpm离心30min,于
‑
60℃真空冷冻干燥48h,得到m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料。
44.实施例2
45.一种m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米材料,其制备包括如下步骤:
46.将35mg mos2分散在25ml超纯水中,25℃下超声处理5h,将250μl体积巯基乙酸加入到mos2分散液中,20℃超声处理20h以实现巯基在mos2表面的修饰。然后将70mg壳聚糖添加到混合液中,超声处理15min以形成均匀的胶体悬浮液。
47.将70mg edc和55mg nhs逐步加入到混合液中于20℃下超声12min,在20℃下以660rpm搅拌50min将羧基活化以进行酰胺反应。
48.之后将反应混合液转移至透析袋中(8~14kda),分别用5mm乙酸(1.2
×
103ml)透析1.4天,超纯水(1.2
×
103ml)透析1.4天。将混合液以1.0
×
104rpm离心20min,于
‑
70℃真空冷冻干燥32h得到m
‑
cs粉末,然后加水超声分散,配制成浓度为1.2mg/ml的m
‑
cs分散液。
49.将30mg ce6溶于15ml dmso中,加入25ml m
‑
cs分散液(1.2mg/ml),在20℃下超声处理25min使混合均匀,然后将混合液在黑暗中、700rpm下搅拌反应18h,待第二天用超纯水洗涤3次,1.2
×
104rpm离心25min,于
‑
70℃真空冷冻干燥48h,得到m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料。
50.实施例3
51.一种m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米材料,其制备包括如下步骤:
52.将25mg mos2分散在25ml超纯水中,22℃下超声处理4h,将167μl体积的巯基乙酸加入到上述mos2分散液中,22℃超声处理16h以实现巯基在mos2表面的修饰。然后将25mg壳聚糖添加到混合液中,超声处理10min以形成均匀的胶体悬浮液。
53.将60mg edc和25mg nhs逐步加入到混合液中于22℃超声10min,在22℃下以800rpm搅拌反应40min将羧基活化,
54.然后将反应混合液转移至透析袋中(8~14kda),分别用5mm乙酸(1.0
×
103ml)透析1天,超纯水(1.0
×
103ml)透析1天。将混合液以1.1
×
104rpm离心15min,于
‑
65℃真空冷冻干燥24h得到m
‑
cs粉末,然后加水超声分散,配制成浓度为0.8mg/ml的m
‑
cs分散液。
55.将25mg ce6溶于10ml dmso中,加入25ml m
‑
cs分散液(0.8mg/ml),在22℃下超声
处理10min使混合均匀,然后将混合液在黑暗中、600rpm下搅拌反应16h,待第二天用超纯水洗涤,1.0
×
104rpm离心15min,于
‑
65℃真空冷冻干燥30h,得到m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料。
56.对比例1
‑357.对比例1
‑
3分别为mos2、壳聚糖、ce6的原材料。
58.对比例4
59.cs
‑
ce6复合材料,其制备方法包括如下步骤:
60.将30mg ce6溶于15ml dmso中配制成质量浓度为2mg/ml的ce6溶液,将30mg cs加25ml 0.5%的乙酸超声处理,配制成1.2mg/ml的cs分散液,将15mlce6溶液加入25ml cs分散液中,在20℃下超声处理25min使混合均匀,然后将混合液在黑暗中、700rpm下搅拌反应18h,待第二天用超纯水洗涤3次,1.2
×
104rpm离心25min,于
‑
70℃真空冷冻干燥48h,得到cs
‑
ce6复合材料。
61.对比例5
62.一种m
‑
cs复合材料,其制备包括如下步骤:
63.先将50mg mos2分散在25ml超纯水中,20℃下超声处理6h,将200μl体积的巯基乙酸加入到上述mos2分散液中,25℃超声处理24h以实现巯基在mos2表面的修饰。然后将65mg壳聚糖添加到混合液中,超声处理20min以形成均匀的胶体悬浮液。
64.将150mg edc和65mg nhs逐步加入到混合液中于25℃超声15min,在25℃下以600rpm搅拌反应1h将羧基活化以进行酰胺反应,
65.然后将反应混合物转移至透析袋中(8~14kda),分别用10mm乙酸(1.5
×
103ml)透析2天,超纯水(1.5
×
103ml)透析2天。将混合液以1.2
×
104rpm离心30min,于
‑
60℃真空冷冻干燥48h得到m
‑
cs复合材料。
66.测试例1
67.材料结构及性能测试:
68.使用tem在200kv的加速电压下验证对比例1中的mos2原料、对比例5制备的m
‑
cs复合材料和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料的形貌和化学结构,如图2所示,mos2呈现出光滑的单层纳米片结构,而对比例5制备的m
‑
cs复合材料呈现出粗糙、模糊的厚状纳米结构,说明高分子壳聚糖的化学修饰导致mos2的表面形态和粗糙度发生明显变化,进一步负载ce6制备得到的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料,表面模糊、不清晰,这是壳聚糖的修饰所致,m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料的形貌发生了变化,表现出不规则的片状结构,证明本发明实施例1的制备方法使壳聚糖成功修饰在mos2表面。
69.使用ftir扫描对比例1中的mos2、对比例2中的cs、对比例3中的ce6、对比例5制备的m
‑
cs和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料在4000~400cm
‑1波长范围内的红外谱图,如图3所示。由图3可知,对比例5制备的m
‑
cs的光谱图上出现了新峰,2922、1378、1151和1073cm
‑1分别对应于壳聚糖的c
‑
h、c
‑
n、c
‑
o和c
‑
o
‑
c键,1637和1572cm
‑1对应于酰胺i带的c=o伸缩振动和酰胺ii带n
‑
h弯曲振动,表明壳聚糖在mos2表面修饰成功,与mos2表面共轭的巯基乙酸形成了酰胺键;实施例1负载了ce6后,m
‑
cs
‑
ce6出现了ce6的红外特征峰,1709cm
‑1归属于ce6的羧基c=o键,1600、1218、1064cm
‑1处峰分别对应于ce6吡咯环的n
‑
h和c
‑
n键,该结果说明ce6成功负载在m
‑
cs上,m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料制备成功。
70.使用xrd扫描对比例1中的mos2、对比例2中的cs、对比例5制备的m
‑
cs及实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料在5
°
≤2θ≤80
°
范围内的衍射谱图,如图4所示,mos2的谱图中出现的衍射峰14.7
°
,33.0
°
,39.8
°
和58.4
°
分别对应于(002)、(100)、(103)和(110)晶面(jcpds 65
‑
1951);壳聚糖在9.7
°
和18.9
°
处的衍射峰对应于其非晶体结构;m
‑
cs谱图中出现了mos2的特征峰14.9
°
,33.0
°
,40
°
和58.9
°
,并且在9.7
°
和18.9
°
出现了小峰,归属于壳聚糖的衍射峰,说明壳聚糖成功修饰在mos2上;实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料的谱图没有明显的峰值变化,与对比例1制备的m
‑
cs结果一致,说明负载了ce6后对复合材料的晶型没有影响。
71.使用tga测试对比例1中的mos2、对比例2中的cs、对比例3中的ce6、对比例5制备的m
‑
cs复合材料和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料的质量在50~700℃温度内的谱图。由图5可以看出,材料的质量随温度逐渐变化,mos2在50~700℃质量损失约20%,这是由于化学剥离过程中残留的有机物热分解导致;壳聚糖的质量损失在100℃与250~350℃两个阶段,第一阶段是水蒸发导致,第二阶段主要是因为糖苷键的断裂,聚合物单元解聚;m
‑
cs具有与壳聚糖相似的热分解阶段,在200~350℃下降,说明壳聚糖已修饰在mos2表面;进一步负载了ce6后,随着温度升高m
‑
cs
‑
ce6复合材料的质量百分比逐渐下降,在150~250℃下降速率最快,与ce6的热分解曲线相符合,且质量损失比m
‑
cs多,说明这是负载的ce6热分解导致。
72.使用zeta电位仪和uv
‑
vis分别测试对比例1中的mos2、对比例2中的cs、对比例3中的ce6、对比例5制备的m
‑
cs复合材料和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料对应的水相分散液,分别测定其电位以及紫外吸收光谱图。图6为对比例1的mos2、对比例2的cs、对比例3的ce6、对比例5制备的m
‑
cs复合材料和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料对应的水相分散液的zeta电位图。测试结果表明,mos2与ce6都带有负电荷,壳聚糖带有正电荷,m
‑
cs由负电荷转变为正电荷,归因于化学修饰作用;进一步负载了ce6后,m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料的电位有所降低,其电位改变趋势与ce6的负电荷相符合,因此m
‑
cs凭借静电吸附作用成功负载上ce6分子。图7为对比例1中的mos2、对比例3中的ce6、对比例5制备的m
‑
cs复合材料和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料对应的水相分散液的uv
‑
vis图。从图7可以看出,ce6在406和686nm具有特征吸收峰,mos2在近红外区域有宽吸收,m
‑
cs无明显吸收,负载了ce6后,在408和686nm处出现了ce6的特征峰,说明ce6成功负载在m
‑
cs复合材料上。
73.测试例2
74.m
‑
cs
‑
ce6复合纳米材料的光动力性能测定:
75.采用1,3
‑
二苯基异苯并呋喃(dpbf)单线态氧探针测定光动力效应下单线态氧的产生情况,该探针能与单线态氧反应导致dpbf在410nm处的吸收下降。将m
‑
cs
‑
ce6复合材料(20μg/ml,1ml)与dpbf(10μg/ml,1ml)混合,采用功率密度为100mw/cm2的660nm激光照射0~40min,测定dpbf在410nm处的吸收峰,以游离dpbf的溶液作为阴性对照。图8为m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料在660nm光照下不同照射时间的单线态氧测定图。由图8可知,单线态氧探针dpbf在410nm处有特征吸收峰,当有单线态氧产生时,它能与单线态氧发生不可逆的反应导致其降解,dpbf吸光度的下降速率与单线态氧的产生成正比。与对照组dpbf相比,m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料的吸光度随着照射时间的推移逐渐降低,说明通过吸附方式负
载的ce6能够持续释放,在光照下持续产生单线氧,加剧对致病菌的氧化损伤。
76.测试例3
77.mic测试:
78.使用对比例1的mos2、对比例2的cs、对比例3的ce6,对比例4制备的cs
‑
ce6、对比例5制备的m
‑
cs和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料对目标菌株的mic测定。
79.采用二倍梯度稀释法探究上述实施例和对比例各个材料的mic,其中材料的浓度范围设为128~1μg/ml,目标菌液od
600nm
=0.1,将96孔板分别进行无光照以及660nm激光照射5min(100mw/cm2),以不含任何材料的菌悬液作为对照,然后培养20h后测试各个孔的吸光度,通过吸光度计算材料的抑菌率,计算公式如下式(1)所示:
[0080][0081]
通过抑菌率即可得到mic,mic即抗菌效率能达到99%以上的复合材料的最小浓度。表1为对比例1的mos2、对比例2的cs、对比例3的ce6,对比例4制备的cs
‑
ce6、对比例5制备的m
‑
cs和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料对目标菌株的mic。
[0082]
表1
[0083][0084]
由表1可知,在光动力作用下对比例4制备的cs
‑
ce6对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的mic分别为32μg/ml、8μg/ml,发现cs
‑
ce6对大肠杆菌的抗菌性能较弱,而当有mos2复合时,即实施例1制备的三元复合纳米材料m
‑
cs
‑
ce6对两种菌的mic分别降低了16倍和2倍,即,其对革兰氏阴性菌大肠杆菌的抗菌活性提高。对比例5制备的m
‑
cs对目标菌株的mic分别为4μg/ml、32μg/ml,对金黄色葡萄球菌的抗菌性能较弱,当负载ce6后m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料对两种菌的mic分别为降低2倍和8倍,显著增强m
‑
cs对革兰氏阳性菌的抗菌性能。实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均表现出优异的抗菌效果,mic分别为2μg/ml、4μg/ml,证明m
‑
cs
‑
ce6三元光动力纳米抗菌材料实现其协同作用以及优异的抑菌效果。
[0085]
测试例4
[0086]
m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料的抗菌性能测定:
[0087]
以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为目标菌株,首先将菌株接种在luria
‑
bertani(lb)培养基中复苏,在37℃下过夜振荡培养,然后取20μl培养好的菌液于液体lb中继续传
代培养,直至达到对数生长期,od
600nm
=0.4(菌体浓度108cfu/ml)。经8000rpm,4℃离心、分离沉淀物,将沉淀用无菌生理盐水(0.85%nacl)洗涤3次,随后将沉淀重悬于生理盐水中得到菌悬液。取对比例1的mos2加入生理盐水分别配制成5、10、20μg/ml的分散液;同理用生理盐水将对比例2的cs、对比例3的ce6、对比例5制备的m
‑
cs和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料分别配制成5、10、20μg/ml的分散液。取100μl菌悬液加入900μl不同浓度的实施例1与对比例1
‑
3和对比例5制备的分散液,混合均匀后置于660nm激光下照射5min(100mw/cm2),再在37℃下振荡培养5h。最后分别取100μl的振荡培养后的混合液于lb固体琼脂平板上涂布,于37℃恒温培养箱中培养16h,不含任何材料的细菌菌悬液作为阳性对照。图9为对比例1的mos2、对比例2的cs、对比例3的ce6、对比例5制备的m
‑
cs和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料,在无光照以及660nm光照下对大肠杆菌的抗菌效果对比图。由图9可知,与对照组相比,mos2在修饰了壳聚糖后抗菌性能明显提高,表现出壳聚糖特有的抗菌优势,无光照时,20μg/ml的m
‑
cs抑制率达到65.2%;m
‑
cs进一步负载了ce6后,抗菌性能得到提高,10μg/ml的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料能够抑制72.6%的大肠杆菌生长,20μg/ml时能够抑制82.5%,引入光照后,5μg/ml的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料抑制率能达到99%,10μg/ml与20μg/ml时抑制率达到100%,抗菌性能最佳,充分发挥了三元复合材料的协同抗菌效应。壳聚糖携带的表面正电荷能够改变大肠杆菌的外壁渗透性,壳聚糖能作为一种螯合剂,通过螯合微生物生长所必须的金属离子,使细胞壁的透性变差。因此小分子的光敏剂和单线态氧能够渗透进入,加剧对细菌胞内组分的氧化,提高对大肠杆菌的抑制率。
[0088]
图10为对比例1的mos2、对比例2的cs、对比例3的ce6、对比例5制备的m
‑
cs和实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料,在无光照以及660nm光照下对金黄色葡萄球菌的抗菌效果对比图。由图10可知,ce6对金黄色葡萄球菌表现出抗菌优势,经660nm激光照射后,菌落总数大量减少,20μg/ml的ce6能够抑制80.11%的金黄色葡萄球菌,m
‑
cs负载ce6后,体现出光动力效应对金黄色葡萄球菌的优势,无光照的条件下5μg/ml的m
‑
cs
‑
ce6抑制率能达到99%,浓度加大后,10μg/ml的复合材料抑制率达到100%,平板上没有菌落生长,加上660nm激光照射后,5μg/ml的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料能够抑制全部金黄色葡萄球菌。因此本发明实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料在5μg/ml即能完全抑制大肠杆菌与金黄色葡萄球菌,对目标菌株展现出三元复合材料的协同抗菌活性。
[0089]
测试例5
[0090]
m
‑
cs
‑
ce6复合纳米材料的广谱抗菌性能测定:
[0091]
除目标菌株大肠杆菌和金黄色葡萄球菌外,本发明还选取了5种菌株,包括蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌o157:h7、鼠伤寒沙门氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌,采用测试例4所述的抗菌性能测试方法以验证m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料的广谱抗菌能力。
[0092]
将以上5种菌株接种在lb培养基中,37℃下培养至od
600nm
=0.4(108cfu/ml),8000rpm,4℃离心1min后弃掉上清,沉淀用无菌生理盐水洗涤3次,重悬于生理盐水中。取100μl以上菌悬液加入900μl含不同浓度的实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料加生理盐水配制的分散液中(2、5、10、20μg/ml)。混合均匀后置于660nm激光下照射5min(100mw/cm2),于37℃下振荡培养5h,取100μl混合液于lb固体琼脂平板上涂布,37℃恒温培
养16h,不含任何材料的菌悬液作为阳性对照。图11为660nm光照下实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料对这5种致病菌的抗菌效果平板图。从图11中可以看出,实施例1制备的m
‑
cs
‑
ce6复合材料的抗菌性能呈现出浓度依赖性,即使在2μg/ml的较低浓度下,平板上生长的菌落数较少,如单增李斯特氏菌,几乎没有菌落生长;随着m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料的浓度增加,5μg/ml时平板上菌落数递减;10μg/ml时,平板图可以直观地观察到5种致病菌被完全抑制,没有菌落生长,说明m
‑
cs
‑
ce6光动力纳米抗菌材料对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出非常优异的抗菌能力。基于以上结果,证明本发明制备的m
‑
cs
‑
ce6三元光动力纳米抗菌材料具有广谱、高效、协同的光动力抗菌效果。
[0093]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询,结果仅供参考。