一种用于肿瘤治疗的药物的制作方法

1.本发明涉及羊传染性脓疱病毒减毒株的新用途，具体涉及将羊传染性脓疱病毒基因缺失致弱毒株在抗肿瘤中的应用。


背景技术：

2.肿瘤性疾病不仅是人类健康的第二大杀手，而且也位列犬猫等伴侣动物的十大死因之首，无论对人类还是动物的健康，都具有重要的危害。不仅如此，针对肿瘤性疾病的免疫疗法及化学组合疗法治疗给人们的生活增加了沉重的经济负担。目前，针对特异性肿瘤的个性化治疗方案层出不穷。放疗和化疗方案广谱有效，但副作用较大；各种小分子抑制剂疗法具有针对性，但费用高且容易产生耐药性；pd1抗体、pdl1抗体等免疫疗法虽然效果好，但适应人群少；car
‑
t疗法的效果显著，但副作用发生率较高。溶瘤病毒是近年来备受重视的新型抗肿瘤疗法，通过对病毒进行遗传修饰改造，使病毒毒力减弱的同时，可保留对肿瘤细胞的杀伤能力及改变肿瘤免疫微环境的能力。
3.羊传染性脓疱病病毒(orfv)属于痘病毒科、副痘病毒属家族成员。研究发现，orfv具有较强的免疫调节能力，可以减轻肝纤维化损伤和某些病毒的致病力。不仅如此，orfv也被证实能够改变肿瘤免疫微环境，促进细胞因子的分泌、募集nk细胞、树突状细胞和吞噬细胞。同时，研究人员也已经尝试将orfv作为载体传递免疫原性基因、构建重组疫苗。因此，通过构建orfv的基因修饰毒株，优化其免疫调节能力及靶向基因传递能力具有广阔的应用前景。对orfv进行扩增及纯化是后续应用基础研究的重要步骤。目前已经成功在mdbk(牛肾细胞)、oftu细胞(羊胚胎鼻甲细胞)及vero(非洲绿猴肾细胞)中扩增病毒、经超速离心法浓缩病毒液、随后进行蔗糖密度梯度法纯化病毒，最后通过透射电镜进行病毒粒子的鉴定。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种用于肿瘤治疗的药物，包括羊传染性脓疱病毒减毒株。所述羊传染性脓疱病毒减毒株作为免疫刺激或增强剂，刺激机体的先天性免疫应答，刺激机体产生抗肿瘤免疫应答反应。
5.优选的是，通过羊传染性脓疱病毒的毒力基因缺失制备得到所述羊传染性脓疱病毒减毒株(本技术又称orfv毒力基因缺失致弱株)。所述orfv毒力基因缺失致弱株可以作为免疫刺激或增强剂，刺激机体的先天性免疫应答。所述orfv毒力基因缺失致弱株可用于治疗(抑制)肿瘤生长、转移的方面。
6.根据试验结果，orfv毒力基因缺失致弱株经腹腔(i.p.)、尾静脉(i.v.)和肌内注射(i.m.)处理小鼠肿瘤肺转移模型后，可显著减少肺内转移肿瘤灶，同时减轻小鼠的临床症状、降低死亡率。将所述orfv毒力基因缺失致弱株经瘤内(i.t.)、腹腔(i.p.)、尾静脉(i.v.)和肌内(i.m.)处理小鼠皮下肿瘤模型后，可显著减小肿瘤灶的大小。上述结果表明，orfv毒力基因缺失致弱株可能由于诱导机体产生先天性免疫应答，从而起到抗肿瘤作用。基于上述试验结果，发明人提出采用orfv毒力基因缺失致弱株注射的方式治疗肿瘤性疾
病。
7.上述任一项优选的是，在导致orfv毒力缺失的情况下，将orfv基因组两端或中部任何毒力基因进行缺失所获得的毒株。
8.上述任一项优选的是，所述毒力基因包括orfv001
‑
orfv008、orfv020、orfv024、orfv073、orfv112
‑
orfv134中的至少一种。本技术所述毒力基因是指与生成毒力因子相关的基因(出自《微生物学名词》第二版)。
9.上述任一项优选的是，如seq no：20所示的核苷酸序列，包含毒力基因orfv001、orfv005、orfv007、orfv008；如seq no：21所示的核苷酸序列，包含毒力基因orfv112、orfv113、orfv114、orfv115、orfv116、orfv117、orfv118、orfv119、orfv120、orfv121、orfv122、orfv123、orfv124、orfv125、orfv126、orfv127、orfv128、orfv129、orfv130、orfv131、orfv132、orfv134；所述羊传染性脓疱病毒的毒力基因缺失制备的方法包括如下(1)至(7)任一项所述的毒力基因缺失方法：
10.(1)如seq no：20所示的核苷酸序列中，毒力基因orfv n1至orfv n2的核苷酸序列的缺失，包括毒力基因核苷酸序列的缺失和毒力基因之间间隔的核苷酸序列的缺失，其中，n1、n2为毒力基因编号，n1＝001、005、007，n2＝005、007、008，n2>n1；
11.(2)如seq no：20所示的核苷酸序列中，至少任意2个毒力基因的共同缺失，至少任意2个毒力基因的共同缺失可以是毒力基因核苷酸序列的缺失和毒力基因之间间隔的核苷酸序列的缺失，也可以是不包含间隔的核苷酸序列仅仅是毒力基因的缺失；优选的，缺失片段为不完全连续的缺失：缺失片段至少为两段序列，其中既包括含有毒力基因核苷酸序列及毒力基因之间间隔序列的连续片段又包括与其他缺失的毒力基因不连续的毒力基因片段的缺失；优选的缺失片段为完全不连续的缺失：缺失的任意毒力基因之间不连续。
12.(3)如seq no：21所示的核苷酸序列中，毒力基因orfv m1至orfv m2的核苷酸序列的缺失，包括毒力基因核苷酸序列的缺失和毒力基因之间间隔的核苷酸序列的缺失，其中，m1、m2为毒力基因编号，m1＝112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132，m2＝113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、134，m2>m1；进一步的m1、m2优选为：m1＝112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131，m2＝113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、134，m2>m1。
13.(4)如seq no：21所示的核苷酸序列中，至少任意2个毒力基因的共同缺失；至少任意2个毒力基因的共同缺失可以是毒力基因核苷酸序列的缺失和毒力基因之间间隔的核苷酸序列的缺失，也可以是不包含间隔的核苷酸序列仅仅是毒力基因的缺失；优选的，缺失片段为不完全连续的缺失：缺失片段至少为两段序列，其中既包括含有毒力基因核苷酸序列及毒力基因之间间隔序列的连续片段又包括与其他缺失的毒力基因不连续的毒力基因片段的缺失；优选的缺失片段为完全不连续的缺失：缺失的任意毒力基因之间不连续；
14.(5)将seq no：20所示的核苷酸序列中含有至少一个毒力基因的核苷酸序列和seq no：21所示的核苷酸序列中含有至少一个毒力基因的核苷酸序列同时进行缺失突变；
15.(6)将seq no：22、seq no：23、seq no：24所示的毒力基因核苷酸序列中的至少一个，同seq no：20、seq no：21所示的毒力基因核苷酸序列中的至少一个同时进行缺失突变。
16.(7)将seq no：22、seq no：23、seq no：24所示的毒力基因核苷酸序列中的至少两个，同时进行缺失突变。
17.上述任一项优选的是，orfv020的氨基酸序列如seq no：22所示，核苷酸序列如seq no：25所示；orfv024的氨基酸序列如seq no：23所示，核苷酸序列如seq no：26所示；orfv073的氨基酸序列如seq no：24所示，核苷酸序列如seq no：27所示。其突变方法采用本领域常规的技术手段，在此不进行详述。
18.上述任一项优选的是，所述羊传染性脓疱病毒减毒株为毒力基因orfv120缺失的orfv120基因缺失株。
19.上述任一项优选的是，缺失突变不包括orfv132基因的突变。
20.上述任一项优选的是，缺失突变不是orfv132基因单一基因的缺失突变。
21.上述任一项优选的是，所述羊传染性脓疱病毒减毒株为冻干制剂。
22.上述任一项优选的是，包括0
‑
10重量份羊传染性脓疱病毒减毒株冻干毒。
23.上述任一项优选的是，所述药物为混悬液制剂，包括所述羊传染性脓疱病毒减毒株和稳定剂。所述稳定剂包括但不限于下述物质的至少一种：各种糖类，如乳糖、甘油、蔗糖、甘露醇、海藻糖、果糖、半乳糖及葡萄糖等；各种氨基酸；右旋糖酐及聚乙二醇等聚合物。
24.上述任一项优选的是，所述羊传染性脓疱病毒减毒株与所述稳定剂的质量比为1：1—1：100。进一步优选的是，所述羊传染性脓疱病毒减毒株与所述稳定剂的质量比为1：1，1：10，1：20，1：30，1：40，1：50，1：60，1：70，1：80，1：90，1：100。
25.上述任一项优选的是，以orfv毒力基因缺失致弱株为主要成分。进一步的优选为，包括orfv毒力基因缺失致弱株50微克，稳定剂50微克。
26.上述任一项优选的是，所述药物与注射用载体混合制成注射用制剂。所述注射用载体优选为生理盐水。使用时，向所述药物中添加生理盐水制成注射用制剂。
27.上述任一项优选的是，所述药物的给药方式为瘤内注射、肌内注射、腹腔注射或静脉注射的至少一种。
28.上述任一项优选的是，所述药物抑制肿瘤的原位生长和/或抑制肿瘤的转移。
29.上述任一项优选的是，所述药物使用剂量为使用每个个体每次103‑
109tcid
50
，进一步优选为103‑
107tcid
50
，优选为103、104、105、106、107、108、109tcid
50
。
30.上述任一项优选的是，所述药物与抗肿瘤放疗、抗肿瘤化疗、抗肿瘤靶向药物、抗肿瘤激素疗法及抗肿瘤免疫疗法中的至少一种联合使用。
31.上述任一项优选的是，本发明所述药物具有以下抗肿瘤活性：
32.(1)体外试验中阻止肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞死亡；
33.(2)阻止原位肿瘤生长；
34.(3)阻止肿瘤转移；
35.(4)增加肿瘤内的免疫细胞比例，在本发明的一项优选实施例中证明，可以显著增加肿瘤内t淋巴细胞的比例；
36.(5)可以与化疗药物联合使用；
37.(6)可以与放射性疗法联合使用；
38.(7)可以与pd
‑
1抗体、pdl
‑
1抗体等抗肿瘤免疫药物联合使用，优选的联合使用方式包括，将pd
‑
1抗体、pdl
‑
1抗体通过腹腔注射进行给药，依据不同的肿瘤优选的剂量为
2.5
‑
10mg/kg；缺失毒在其中的作用是募集免疫细胞。
39.上述任一项优选的是，所述orfv为orfv
‑
sy17株、orfv
‑
na17株、orfv
‑
jilin株。
40.本发明优选的病毒野毒株orfv
‑
sy17、orfv
‑
na17及orfv
‑
jilin株为现有技术中已公开的毒株，公众可通过与作者共享的方式获得。(1.zhong j#,guan j#,zhou y,cui s,wang z,zhou s,xu m,wei x,gao y,zhai s,song d,he w,gao f,zhao k*.genomic characterization of two orf virus isolates from jilin province in china.virus genes,2019,55:490
–
501.2.zhao k,song d,he w,lu h,zhang b,li c,chen k,gao f.identification and phylogenetic analysis of an orf virus isolated from an outbreak in sheep in the jilin province of china.vet microbiol.2010may19；142(3
‑
4):408
‑
15.)
41.上述任一项优选的是，orfv毒力基因缺失致弱株与传统肿瘤治疗药物联合使用，用于提高机体的免疫力，使得治疗后获得更好的预后。
42.本发明通过所述药物，具有显著的治疗肿瘤的效果：(1)通过瘤内注射及肌肉注射的方式抑制肿瘤的原位生长；(2)通过腹腔注射及肌肉注射的方式抑制肿瘤的转移。
附图说明
43.图1为本发明实施例1中orfv120基因缺失株透射电镜检测图。
44.图2为本发明实施例1中orfv120基因缺失株肌肉注射小鼠前后的体重变化情况。
45.图3为本发明实施例1中orfv120基因缺失株瘤内注射小鼠前后免疫细胞变化情况。
46.图4为本发明实施例1中orfv120基因缺失株瘤内注射形式处理荷瘤小鼠后肿瘤重量、体积变化情况。
47.图5为本发明实施例1中orfv120基因缺失株静脉注射的形式处理肺脏转移荷瘤小鼠后肺脏内转移瘤数量变化情况。
具体实施方式
48.本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。
49.实施例1
50.orfv120基因缺失株制备：
51.本发明所述orfv120基因缺失株按照如下方式制备：
52.(1)准备亲本毒株：所述亲本毒株为羊传染性脓疱病毒orfv
‑
sy17株，所述羊传染性脓疱病毒orfv
‑
sy17株的全长基因序列如genbank：mg712417.1所示；
53.(2)筛选表达盒的构建：将适用于羊传染性脓疱病毒的特异性启动子和第一标记基因插入载体骨架中，获得筛选表达盒；
54.(3)穿梭质粒的构建：扩增orfv
‑
sy17株的orfv120基因缺失序列两侧的序列作为重组同源臂，克隆入步骤(2)构建的筛选表达盒上，获得标记后的重组穿梭质粒；
55.(4)利用步骤(3)制备的穿梭质粒转染已感染orfv
‑
sy17野毒株的宿主细胞获得表
no：4所示)，pcr扩增条件为98℃30s，55℃15s，72℃5s，34个循环；其次，以pegfp
‑
n1载体为模板扩增egfp序列片段。设计针对egfp的特异性扩增引物(上游引物egfp fw的核苷酸序列如seq no：5所示；下游引物egfp rv的核苷酸序列如seq no：6所示)，pcr扩增条件为98℃30s，55℃15s，72℃8s，34个循环。将经pcr扩增获得的vv p7.5启动子序列片段和egfp序列扩增片段通过融合pcr方法进行连接，上游引物为vv p7.5 fw的核苷酸序列如seq no：3所示，下游引物为egfp rv的核苷酸序列如seq no：6所示，pcr融合扩增条件为98℃30s，55℃15s，72℃60s，34个循环；将回收纯化的vv p7.5
‑
egfp融合基因片段插入puc57骨架质粒中，测序验证重组载体序列的正确性，获得puc57
‑
egfp筛选表达盒。
64.1.2构建用于orfv120基因缺失的重组穿梭质粒
65.根据orfv120基因上下游序列信息，确定其左右同源臂序列，并根据同源臂序列设计引物。分别扩增左同源臂(lf；819bp)(引物序列：orfv120
‑
lf
‑
fw的核苷酸序列如seq no：7所示；orfv120
‑
lf
‑
rv的核苷酸序列如seq no：8所示)和右同源臂(rf；852bp)(引物序列：orfv120
‑
rf
‑
fw的核苷酸序列如seq no：9所示；orfv120
‑
rf
‑
rv的核苷酸序列如seq no：10所示)。pcr扩增条件为98℃30s，55℃15s，72℃10s，34个循环。分别将左、右同源臂的pcr扩增产物克隆入puc57
‑
egfp筛选表达盒中，并通过测序验证重组穿梭质粒，获得puc57
‑
lfδ120
‑
egfp
‑
rfδ120重组转移质粒。缺失的orfv120基因是羊传染性脓疱病毒全基因位于120779至121169的核苷酸序列，该dna序列的核苷酸序列如seq id no：2所示。
66.1.3筛选、纯化orfv120基因缺失病毒
67.oftu细胞(细胞数约为2
×
105个)铺于6孔板中，待细胞长势良好时(约70
‑
80％汇合度)，无血清接种orfv
‑
sy17原始毒株(moi＝1
‑
5)，37℃孵育1h后，加入含2
‑
5％胎牛血清的dmem完全培养液，进一步培养2
‑
3h。随后将上述1
‑
2μg纯化的puc57
‑
lfδ120
‑
egfp
‑
rfδ120质粒与3
‑
5μl的lipofectamine
tm 3000试剂混合后转染oftu细胞48h，待细胞出现绿色荧光。绿色荧光信号的出现及持续、稳定扩增表明成功获得重组病毒。挑取携带重组病毒的细胞(携带绿色荧光)反复冻融3次，释放重组病毒，再将其接种至铺有oftu细胞的96孔板中进行进一步筛选。对出现绿色荧光的细胞孔在进行稀释筛选4
‑
6轮，获得纯化的重组病毒，命名为orfv/δ120/egfp 。相对于羊传染性脓疱病毒orfv
‑
sy17毒株全长序列，缺失了第120779至121169位核苷酸。
68.1.4pcr法鉴定orfv/δ120/egfp 重组病毒
69.分别利用病毒基因组提取试剂盒提取野生orfv和orfv/δ120/egfp 病毒的基因组dna，同时使用针对病毒orfv120基因的特异性引物(orfv120
‑
fw的核苷酸序列如seq no：11所示；orfv orfv120
‑
rv的核苷酸序列如seq no：12所示)和egfp的特异性引物(egfp
‑
fw的核苷酸序列如seq no：13所示；egfp
‑
rv的核苷酸序列如seq no：14所示)鉴定其纯度，此法用以验证是否成功缺失病毒orfv120基因以及是否有野生型毒株的污染。鉴定结果表明，上述重组病毒的orfv120基因的扩增结果为阴性，而egfp基因的扩增结果为阳性，表明已经获得缺失orfv120基因重的组病毒，并且将其纯化。
70.1.5筛选、纯化筛选标记基因egfp去除的缺失毒株
71.构建只包含orfv120基因重组同源臂的重组质粒，并将其转染至感染orfv
‑
sy17δ120缺失毒株的oftu细胞，利用上述方法挑选、纯化单个不带荧光克隆，之后利用上述有限稀释法进行多轮筛选，获得不含第一标记基因的缺失orfv120毒株。
72.说明：实施例1引用的2020115283418专利申请中，构建orfv120基因缺失株的方法为本实验室的在先研究，相关专利申请正在专利审查过程中，其所述的构建orfv120基因缺失株的方法本身并不是本发明的发明点。本专利的是在先专利申请的进一步研究，本发明的保护的重点是orfv120基因缺失株以及其他羊传染性脓疱病毒减毒株作为抗肿瘤的应用。
73.实施例1得到的orfv120基因缺失株可单独作为抗肿瘤药物使用。
74.实施例2orfv120基因缺失株抗肿瘤作用检测
75.实施例2中，对实施例1得到的orfv120基因缺失株的抗肿瘤作用进行检测。
76.1、orfv120基因缺失株的透射电镜观察鉴定
77.将orfv120基因缺失株置于透射电镜下观察、鉴定。结果如图1显示。
78.2、orfv120基因缺失株的毒力安全性评价
79.本发明实施过程中，将orfv120基因缺失株肌肉注射至小鼠，注射剂量为2
×
106tcid
50
，记录注射0
‑
15天小鼠的体重变化。结果如图2显示，上述病毒并未显著改变小鼠的体重。
80.3、orfv120基因缺失株治疗性注射对b16肿瘤内免疫细胞募集的影响
81.本发明利用orfv120基因缺失株瘤内注射小鼠荷瘤模型，瘤内注射3次后进行观察，每次注射剂量为1
×
106tcid
50
。结果如图3所示，均可以显著增加肿瘤内t淋巴细胞的比例。图3中显示了cd3

t淋巴细胞的增加和cd8

t淋巴细胞增加。
82.4、orfv120基因缺失株治疗性注射对b16肿瘤生长的影响
83.本发明利用orfv120基因缺失株瘤内注射小鼠荷瘤模型，注射剂量为1
×
106tcid
50
，结果如图4所示。均可以显著降低肿瘤的重量和体积。
84.5、orfv120基因缺失株治疗性注射对b16肿瘤转移的影响
85.本发明利用orfv120基因缺失株静脉注射小鼠肺脏荷瘤模型，注射剂量为1
×
106tcid
50
，肿瘤的肺脏转移结果如图5所示。缺失毒可以显著降低肺脏转移肿瘤的大小和数目。
86.利用orfv120基因缺失株腹腔注射小鼠肺脏荷瘤模型，结果表明以腹腔注射的形式处理肺脏转移荷瘤小鼠后肺脏内转移瘤数量变化情况的效果与图5一致。
87.实施例2中orfv120基因缺失株的优选用量还可以为103、104、105、107tcid
50
，均可以增加cd3

t淋巴细胞和cd8

t淋巴细胞，显著降低肿瘤的重量和体积，显著降低肺脏转移肿瘤的大小和数目，并具有生物安全性。
88.实施例3
89.实施例3将实施例1获得的抗肿瘤药物与抗肿瘤放疗、抗肿瘤化疗、抗肿瘤免疫、抗肿瘤靶向、抗肿瘤激素药物中的至少一种联合使用。联合使用的化学、抗体药物、靶向抑制剂及激素药物采用腹腔注射或口服的给药方式，与本发明包括羊传染性脓疱病毒减毒株的抗肿瘤药物错开时间间隔给药。
90.与抗肿瘤化疗的联合使用：腹腔注射etoposide(依托泊苷为细胞周期特异性抗肿瘤药物，分子式为c
29
h
32
o
13
)10
‑
50mg/kg，每两天一次；所述包括羊传染性脓疱病毒减毒株用于肿瘤治疗的药物采取瘤内注射的方式，与抗肿瘤化疗药物错开间隔给药，剂量为106tcid
50
。
91.与抗肿瘤免疫疗法的联合使用：pd
‑
1、pdl
‑
1抗体通过腹腔注射的方式给药，依据不同的肿瘤2.5
‑
10mg/kg，每2天一次；所述包括羊传染性脓疱病毒减毒株的用于肿瘤治疗的药物采取瘤内注射的方式，与抗肿瘤免疫疗法药物错开间隔给药，剂量为106tcid
50
。
92.与抗肿瘤靶向药物的联合使用：抗肿瘤靶向药物腹腔注射方式给药，pi3kα抑制剂byl719，5
‑
20mg/kg，每两天一次；所述包括羊传染性脓疱病毒减毒株的用于肿瘤治疗的药物采取瘤内注射的方式，与抗肿瘤免疫疗法药物错开间隔给药，剂量为106tcid
50
。
93.抗肿瘤激素疗法的联合使用：抗肿瘤激素疗法药物皮下注射方式给药，他莫昔芬，10
‑
100微摩尔/kg/天，治疗er阳性乳腺癌时使用；所述包括羊传染性脓疱病毒减毒株的用于肿瘤治疗的药物采取瘤内注射的方式，与抗肿瘤免疫疗法药物错开间隔给药，剂量为106tcid
50
。
94.结果表明，所述包括羊传染性脓疱病毒减毒株的用于肿瘤治疗的药物与抗肿瘤放疗、抗肿瘤化疗、抗肿瘤免疫、抗肿瘤激素或抗肿瘤靶向药物的联合使用能够有效的抑制肿瘤的生长或转移。
95.实施例4
96.实施例1制备得到的包含羊传染性脓疱病毒减毒株的行肿瘤药物通过瘤内注射的方式抑制肿瘤的原位生长；抑制肿瘤的转移。
97.优选的，瘤内注射剂量为1
×
106tcid
50
，隔天注射一次，注射3次。原位生长的肿瘤受到抑制，体现在肿瘤体积和重量上的减轻。
98.优选的，静脉注射剂量为1
×
106tcid
50
，隔天注射一次，注射3次。肿瘤的肺脏转移受到抑制，体现在转移瘤的体积减小，肺内转移瘤定植数量减少。
99.实施例5
100.实施例1制备得到的orfv120基因缺失株50μg与50μg稳定剂混合，制备得到抗肿瘤药物。所述稳定剂为乳糖、甘油、蔗糖、甘露醇、海藻糖、果糖、半乳糖及葡萄糖、氨基酸、右旋糖酐、聚乙二醇等。
101.实施例6
102.实施例6与实施例1至5相似，不同的是，实施例6提供了一种不同的毒力基因缺失方式制备羊传染性脓疱病毒减毒株。
103.如seq no：20所示的核苷酸序列，经预测包括4个毒力基因，分别为毒力基因orfv001、orfv005、orfv007、orfv008。制备羊传染性脓疱病毒减毒株的方式包括将seq no：20所示的核苷酸序列中orfv001、orfv005、orfv007、orfv008至少一个毒力基因的核苷酸序列敲除，也包括覆盖一个或几个毒力基因的长片段敲除，所述长片段是指包括毒力基因和毒力基因间的间隔基因的seq no：20上的连续核苷酸序列。
104.敲除方式采用现有技术中基因敲除的常规方法，如在敲除基因的起始和终止位点设计同源臂，通过同源重组的方式敲除或替换为其他核苷酸序列。
105.seq no：20所示的核苷酸序列中，包含的毒力基因区的4个基因分布为：orfv001(seq no：20所示的核苷酸序列中第3722位至4171位核苷酸)、orfv005(seq no：20所示的核苷酸序列中第5201至5428位核苷酸)、orfv007(seq no：20所示的核苷酸序列中第5511至5990位核苷酸)、orfv008(seq no：20所示的核苷酸序列中第6053至7603位核苷酸)。
106.其中，一种优选方案是，所述长片段毒力基因包含seq no：20所示的全部核苷酸序
列，也就是说敲除seq no：20所示的全部核苷酸序列使四个毒力基因全部缺失。
107.另一种优选方案是，完全不连续和/或不完全连续基因的共同删除。将orfv001、orfv005、orfv007、orfv008中的至少任意两个基因删除。
108.再一种优选方案是，连续基因片段的删除：seq no：20所示的orfv001～orfv005，orfv001～orfv007，orfv001～orfv008；orfv005～orfv007，orfv005～orfv008；orfv007～orfv008。即将seq no：20所示的序列中的第n1位基因至第n2位基因间的序列敲除，其中n1介于orfv001和orfv007之间，n2介于orfv005和orfv008之间。
109.另一优选方案是，将seq no：20所示的序列中的第n1位基因至第n2位基因间的序列替换为其他核苷酸序列片段，如将缺失片段替换为标记基因的核苷酸序列(如egfp等基因)。进一步优选的是，进一步将标记基因替换为其他外源功能性基因，用以增强免疫刺激能力。
110.本实施例最终选定基因删除的构建方式，即确定的敲除序列(即缺失序列)的起始位点位于seq no：20所示的片段(共4个基因片段，每个基因片段起止核苷酸位点如上所述)的orfv001至orfv007基因，终止位点位于orfv005至orfv008基因，其中最为优选的敲除序列为seq no：20所示的核苷酸序列的orfv005～orfv008基因，即敲除序列的起始基因为orfv005基因，终止基因为orfv008基因。进一步的优选方案是，将seq no：20所示的核苷酸序列敲除后，插入标记基因的核苷酸序列。最终的优选方案是，进一步将插入标记基因的核苷酸序列通过重组的方式去除。
111.与实施例1至5相似，实施例6制备得到的毒力基因缺失减毒株作为含有包括羊传染性脓疱病毒减毒株的抗肿瘤药物(给药方式及剂量与实施例1至5相同)，显著增加肿瘤内t淋巴细胞的比例。尤其是cd3

t淋巴细胞的增加和cd8

t淋巴细胞增加。将实施例6所述基因缺失株瘤内注射小鼠荷瘤模型，可以显著降低肿瘤的重量和体积。将实施例6所述基因缺失株瘤静脉注射小鼠肺脏荷瘤模型，显著降低肺脏转移肿瘤的大小和数目。
112.实施例7
113.实施例7与实施例1至5相似，不同的是，实施例7提供了一种不同的毒力基因缺失方式制备羊传染性脓疱病毒减毒株。
114.seq no：21所示的核苷酸序列包含毒力基因区的22个基因：orfv112(seq no：21所示的核苷酸序列第124至987位核苷酸)、orfv113(seq no：21所示的核苷酸序列第1060至1686位核苷酸)、orfv114(seq no：21所示的核苷酸序列第1730至2770位核苷酸)、orfv115(seq no：21所示的核苷酸序列第2887至3318位核苷酸)、orfv116(seq no：21所示的核苷酸序列第3387至4082位核苷酸)、orfv117(seq no：21所示的核苷酸序列第4257至5054位核苷酸)、orfv118(seq no：21所示的核苷酸序列第5308至5616位核苷酸)、orfv119(seq no：21所示的核苷酸序列第6014至6634位核苷酸)、orfv120(seq no：21所示的核苷酸序列第7084至7671位核苷酸)、orfv121(seq no：21所示的核苷酸序列第7787至8689位核苷酸)、orfv122(seq no：21所示的核苷酸序列第8743至9714位核苷酸)、orfv123(seq no：21所示的核苷酸序列第9805至11382位核苷酸)、orfv124(seq no：21所示的核苷酸序列第11417至12979位核苷酸)、orfv125(seq no：21所示的核苷酸序列第13072至13593位核苷酸)、orfv126(seq no：21所示的核苷酸序列第13699至15192位核苷酸)、orfv127(seq no：21所示的核苷酸序列第15271至15828位核苷酸)、orfv128(seq no：21所示的核苷酸序列第
15997至17502位核苷酸)、orfv129(seq no：21所示的核苷酸序列第17563至19125位核苷酸)、orfv130(seq no：21所示的核苷酸序列第19214至20701位核苷酸)、orfv131(seq no：21所示的核苷酸序列第20664至21338位核苷酸)、orfv132(seq no：21所示的核苷酸序列第21392至21793位核苷酸)、orfv134(seq no：21所示的核苷酸序列第22633至23082位核苷酸)。
115.制备羊传染性脓疱病毒减毒株的方式包括将seq no：21所示的核苷酸序列中orfv112、orfv113、orfv114、orfv115、orfv116、orfv117、orfv118、orfv119、orfv120、orfv121、orfv122、orfv123、orfv124、orfv125、orfv126、orfv127、orfv128、orfv129、orfv130、orfv131、orfv134至少一个毒力基因的核苷酸序列敲除，也包括覆盖一个或几个毒力基因的长片段敲除，所述长片段是指包括毒力基因和毒力基因间的间隔基因的seq no：21上的连续核苷酸序列。
116.一个优选的实施方式是，所述长片段毒力基因包含seq no：21所示的全部核苷酸序列，删除seq no：21所示的全部核苷酸序列，即将22个毒力基因敲除。
117.另一个优选的实施方式是，orfv长片段、多基因删除方式包括seq no：21所示的核苷酸序列中orfv112、orfv113、orfv114、orfv115、orfv116、orfv117、orfv118、orfv119、orfv120、orfv121、orfv122、orfv123、orfv124、orfv125、orfv126、orfv127、orfv128、orfv129、orfv130、orfv131、orfv132、orfv134，第orfv112～orfv134间包含任意2个或2个以上基因的删除组合，所述2个或2个以上基因的删除既可以是连续基因也可以是不连续基因的共同删除(包括本发明所述的完全不连续和/或不完全连续)。
118.另一个优选的实施方式是，如下连续基因片段删除：seq no：21所示的orfv112～orfv113，orfv112～orfv114，orfv112～orfv115，orfv112～orfv116，orfv112～orfv117，orfv112～orfv118，orfv112～orfv119，orfv112～orfv120，
……
，orfv112～orfv132，orfv112～orfv134；orfv113～orfv114，orfv113～orfv115，
……
，orfv113～orfv134；orfv114～orfv115，orfv114～orfv116，
……
，orfv114～orfv134；orfv115～orfv116，orfv115～orfv117，
……
，orfv115～orfv134；orfv116～orfv117，orfv116～orfv118，
……
，orfv116～orfv134；orfv117～orfv118，orfv117～orfv119，
……
，orfv117～orfv134；orfv118～orfv119，orfv118～orfv120，
……
，orfv118～orfv134；orfv119～orfv120，orfv119～orfv121，
……
，orfv119～orfv134；orfv120～orfv121，orfv120～orfv122，
……
，orfv120～orfv134；以此类推直至orfv132～orfv134。即将seq no：21所示的序列中的第m1位基因至第m2位基因间的序列敲除，其中m1介于orfv112和orfv132之间，m2介于orfv113和orfv134之间。
119.另一优选方案是将seq no：21所示的序列中的第m1位基因至第m2位基因间的序列替换为其他核苷酸序列片段，在本发明的优选实施例中，将缺失片段替换为标记基因的核苷酸序列。进一步优选的是，进一步将标记基因替换为其他外源功能性基因，用以增强免疫刺激能力。
120.本实施例最终选定基因删除的构建方式，即确定的敲除序列(即缺失序列)的起始位点位于seq no：21所示的片段(共22个基因片段，每个基因片段起止核苷酸位点如上所述)的orfv112至orfv132基因，终止位点位于orfv113至orfv134基因，其中最为优选的敲除序列为seq no：21所示的核苷酸序列的orfv119～orfv125基因，即敲除序列的起始基因为
orfv119基因，终止基因为orfv125基因。进一步的优选方案是，将seq no：21所示的核苷酸序列敲除后，插入标记基因的核苷酸序列。最终的优选方案是，进一步将插入标记基因的核苷酸序列通过重组的方式去除。
121.与实施例1至5相似，实施例7制备得到的毒力基因缺失减毒株作为含有包括羊传染性脓疱病毒减毒株的抗肿瘤药物(给药方式及剂量与实施例1至5相同)，显著增加肿瘤内t淋巴细胞的比例，尤其是cd3

t淋巴细胞的增加和cd8

t淋巴细胞增加。将实施例7所述基因缺失株瘤内注射小鼠荷瘤模型，可以显著降低肿瘤的重量和体积。将实施例7所述基因缺失株瘤静脉注射小鼠肺脏荷瘤模型，显著降低肺脏转移肿瘤的大小和数目。
122.实施例8
123.实施例8与实施例1至5相似，不同的是，实施例8提供了一种不同的毒力基因缺失方式制备羊传染性脓疱病毒减毒株。将seq no：20所示的核苷酸序列中含有至少一个毒力基因的核苷酸序列(orfv001、orfv005、orfv007、orfv008中的至少一个)和seq no：21所示的核苷酸序列中含有至少一个毒力基因的核苷酸序列(orfv112、orfv113、orfv114、orfv115、orfv116、orfv117、orfv118、orfv119、orfv120、orfv121、orfv122、orfv123、orfv124、orfv125、orfv126、orfv127、orfv128、orfv129、orfv130、orfv131、orfv134中的至少一个)同时进行缺失突变，制备含有羊传染性脓疱病毒减毒株的抗肿瘤药物。结果表明，实施例8提供的抗肿瘤药物能够增加肿瘤内t淋巴细胞的比例，抑制肿瘤增长。
124.实施例9
125.实施例9与实施例1至8相似，不同的是缺失序列不包括orfv132基因的核苷酸序列。