一种含瑞德西韦的眼用温敏原位凝胶制剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于温敏原位凝胶技术领域，具体涉及一种含瑞德西韦的眼用温敏原位凝胶制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.mers等冠状病毒可以通过接触病人的血液或体液，经过破损的皮肤或眼、鼻、口腔黏膜产生个体间传播，其中，病毒经眼粘膜传播是一种较难以预防的病毒传播途径。
3.瑞德西韦在多种人体细胞中可以代谢为活性核苷三磷酸，并与三磷酸腺苷形成联合竞争，通过抑制依赖rna的rna合成酶(rdrp)阻断病毒核酸合成，并导致病毒rna产量下降，具有广谱抗病毒作用。由于瑞德西韦为脂溶性分子，且分子量大，因此当应用于眼用制剂时难以制备为澄清的水溶性滴眼液，也难以被普通材料如环糊精等包载或制备为脂质体等形式；高温下具有不稳定性，也不能通过加热来提高溶解度。
4.传统眼科制剂(如眼药水和眼膏)存在停留时间短等问题，而原位凝胶药物递送系统是以溶液状态给药后，立即在用药部位发生相转变，形成非化学交联的半固体制剂，可以长时间与作用部位发生紧密接触，提高药物利用率。现有瑞德西韦制剂存在眼部滞留时间短等问题，研发一种含瑞德西韦的原位凝胶制剂用于眼部抗病毒具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种含瑞德西韦的眼用温敏原位凝胶制剂及其制备方法。
6.本发明的另一目的在于提供上述含瑞德西韦的眼用温敏原位凝胶制剂的应用。
7.本发明的技术方案如下：
8.一种含瑞德西韦的眼用温敏原位凝胶制剂，包括0.01
‑
5％的瑞德西韦，0.1
‑
1％的温敏凝胶基质，溶剂为去离子水；其中，温敏凝胶基质为聚乙二醇
‑
聚丙二醇嵌段共聚物或其衍生物，该聚乙二醇
‑
聚丙二醇嵌段共聚物或其衍生物为peg
‑
ppg
‑
peg嵌段共聚物、dhse
‑
peg
‑
ppg嵌段共聚物、peg
‑
ppg
‑
18/18聚二甲基硅氧烷、peg
‑
ppg
‑
25/30嵌段共聚物和peg
‑
ppg
‑
17/4二甲基醚中的至少一种。
9.在本发明的一个优选实施方案中，所述温敏凝胶基质为dhse
‑
peg
‑
ppg嵌段共聚物或peg
‑
ppg
‑
peg嵌段共聚物。
10.在本发明的一个优选实施方案中，所述瑞德西韦浓度为0.1
‑
0.5wt％。
11.在本发明的一个优选实施方案中，还包括人工泪液成分。
12.进一步优选的，所述人工泪液成分为氨基乙基磺酸、硫酸软骨素钠、l
‑
天冬氨酸钾、l
‑
天冬氨酸镁、玻璃酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氯化钾、氯化钙、氯化钠、磷酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、葡萄糖、聚丙烯酸凝胶、几丁糖、壳聚糖、维生素a、海藻
糖、全反式维甲酸中的至少一种。
13.在本发明的一个优选实施方案中，还包含ph缓冲剂、等渗剂、防腐剂、助溶剂、ph调节剂、增稠剂等。
14.进一步优选的，所述ph缓冲剂包括磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、氨基酸及小肽中的至少一种；
15.所述等渗剂包括山梨糖醇、葡萄糖、甘露糖醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇和氯化钠中的至少一种；
16.所述防腐剂包括山梨酸、苯扎氯铵、苯扎溴铵、对羟基苯甲酸乙酯、苯甲醇和苯乙醇中的至少一种；
17.所述助溶剂包括环糊精类或其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、peg400和吐温80中的至少一种；
18.所述增稠剂包括羟乙基纤维素及其盐、羟丙基纤维素及其盐、甲基纤维素及其盐、羟丙基甲基纤维素及其盐、羧甲基纤维素及其盐中的至少一种。
19.上述含瑞德西韦的眼用温敏原位凝胶制剂的制备方法，包括如下步骤：
20.(1)将所述瑞德西韦与部分所述温敏凝胶基质溶解于有机溶剂中，超声混匀，然后将其缓慢滴加到去离子水中，混合均匀，获得混合液；
21.(2)将上述混合液中的有机溶剂挥发除去，补充去离子水得到纳米乳、微乳或胶束；
22.(3)另取剩余的所述温敏凝胶基质直接溶解于去离子水得到凝胶；
23.(4)将步骤(2)所得的物料与步骤(3)所得的凝胶低温搅拌混合均匀，获得所述含瑞德西韦的眼用温敏原位凝胶制剂。
24.在本发明的一个优选实施方案中，有机溶剂为四氢呋喃、乙醇和甲醇中的至少一种，超声时间为10
‑
60min；所述步骤(4)中，所述步骤(2)所得的物料与步骤(3)所得的凝胶的混合比例为1∶1
‑
1∶10。
25.本发明另一技术方案如下：
26.上述含瑞德西韦的眼用温敏原位凝胶制剂在制备用于预防和治疗冠状病毒造成的眼部感染的药物中的应用。
27.在本发明的一个优选实施方案中，所述冠状病毒包括博拉病毒、nipah病毒、中东呼吸综合征冠状病毒(mers)及基于上述病毒变异的融合。
28.本发明有益效果在于：
29.1.本发明具有较好的生物黏附性，可以长时间与作用部位发生紧密接触，增强药物在接触部位的吸收，提高药物生物利用度。由于泪液不断的冲洗，眼表对滴眼液的利用率小于5％，多数药物均被泪液带走，而原位凝胶在眼表发生相转化后成膜，可以形成缓释载体，极大地提高药物利用率。
30.2.瑞德西韦为脂溶性药物，难以直接制备为水溶性的滴眼液，本发明所用温敏凝胶基质有利于脂溶性药物包裹及缓释，可以较好地装载药物，达到制备眼用制剂的目的。
31.3.本发明具有良好眼表耐受性和组织相容性，使用方便，易于被患者接受。
32.4.本发明对于预防和治疗埃博拉病毒、nipah病毒、中东呼吸综合征冠状病毒(mers)及基于上述病毒变异融合衍生而成的相关病毒经由眼部感染有效。
附图说明
33.图1为本发明实施例3制备的dhse
‑
peg
‑
ppg嵌段共聚物的1h nmr谱图。
34.图2为本发明实施例4中的温敏原位凝胶制剂的胶凝温度测定图，其中，a是倒置小瓶法测定图，b是搅拌子法测定图。
35.图3为本发明实施例4中的宏观拍照法透光性比较图。
36.图4为本发明实施例4中的透光率比较结果图。
37.图5为本发明实施例4中的半透膜溶出法体外释药测定结果图。
38.图6为本发明实施例4中的光学相干断层扫描图。
39.图7为本发明实施例4中的温敏原位凝胶对家兔眼表的刺激情况图。
40.图8为本发明实施例6中的含瑞德西韦眼用制剂对病毒的抑制作用图。
具体实施方式
41.以下通过具体实施方式并结合附图对本发明的技术方案行进行进一步的说明和描述。
42.在本发明中，如无特殊说明，则所有操作均在室温、常压、避强光条件下实施。
43.实施例1
44.将10.0g peg、ppg混合物(投料比2∶1)于烧瓶中混合，放置在40℃真空下干燥过夜。然后加入200ml无水甲苯共沸蒸馏去除水分。将反应物放在氩气下于75℃油浴加热，加热过程中将0.913g亚己基二异氰酸酯(hmdi)和两滴二苯并噻吩(dbt)加入反应体系。混合物继续反应48h后收集产物，将产物放在乙醚中沉淀并冻干，最终得到peg
‑
ppg
‑
peg嵌段共聚物。
45.实施例2
46.称取50mg实施例1制得的peg
‑
ppg
‑
peg嵌段共聚物用1ml甲醇溶解，另外称取100mg瑞德西韦溶于1ml乙醇中，再将两溶液混合，超声50min混合均匀得到溶液一。在超声状态下将溶液一缓慢滴加到8ml去离子水中，混合均匀，放置于通风橱过夜，挥发有机溶剂，补充去离子水至10ml，制备成瑞德西韦胶束(溶液二)。另外称取300mg peg
‑
ppg
‑
peg嵌段共聚物直接溶于5ml生理盐水中，制备为水凝胶材料(溶液三)。量取5ml溶液二与5ml溶液三，低温搅拌混合，涡旋、超声使其混合均匀，再依次加入少量山梨酸、海藻糖，获得含有0.25％瑞德西韦的眼用温敏原位凝胶。
47.实施例3
48.将10.0g peg、ppg混合物和0.05g dhse于烧瓶中混合，放置在40℃真空下干燥过夜。然后加入200ml无水甲苯共沸蒸馏去除水分。将反应物放在氩气下于75℃油浴加热，加热过程中将0.913g hmdi和两滴dbt加入反应体系。混合物继续反应48h后收集产物，将产物放在乙醚中沉淀并冻干，最终得到dhse
‑
peg
‑
ppg嵌段共聚物。
49.使用美国jeol 500mhz nmr测定dhse
‑
peg
‑
ppg嵌段共聚物的1h nmr谱。凝胶渗透色谱实验(gpc)使用两个串联的phenogel
tm
色谱柱(103和300
×
7.80mm)在vistekgpcmax模块(malvern panalytical，malvern，u.k.)下进行。gpc的洗脱液为四氢呋喃，流速1.0ml/min。
50.本实施例制得的dhse
‑
peg
‑
ppg嵌段共聚物的1h nmr结果如图1所示，以cdcl3作为
参考峰(7.26ppm)，peg的质子峰为3.64ppm，ppg3.56
‑
3.39ppm，而1.14
‑
1.22ppm的重叠峰属于dhse的中
‑
ch2。
51.实施例4
52.称取100mg实施例3制得的dhse
‑
ppg
‑
peg共聚物用2.5ml四氢呋喃溶解，另外称取100mg瑞德西韦溶于2.5ml乙醇中，再将两溶液混合，超声5min混合均匀得到溶液一。在超声状态下将溶液一缓慢滴加到15ml人工泪液中，混合均匀，挥发有机溶剂，补充去离子水至20ml，制备成瑞德西韦胶束(溶液二)。另外称取10g dhse
‑
ppg
‑
peg共聚物直接溶于20ml人工泪液中，超声5min混合均匀，4℃放置过夜，涡旋后制备为水凝胶材料(溶液三)。量取2ml溶液二与8ml溶液三低温搅拌混合，涡旋、超声混合均匀，再依次加入0.1％的苯扎溴铵、甘露醇，获得含有0.1％瑞德西韦的眼用温敏原位凝胶。
53.实施例5制备的温敏原位凝胶样品相关性质的测定：
54.一、胶凝温度的测定：
55.(1)使用倒置小瓶法测定温敏原位凝胶样品的胶凝温度：
56.取200μl本实施例制得的眼用温敏原位凝胶放置于2ml小瓶中，将装有凝胶的小瓶首先放在4℃中以保持液体状态，然后将小瓶放置在不同温度的水浴中加热5min后，将小瓶取出并倒置，如果形成的凝胶可以稳定保持1min，那么此时的温度即为胶凝温度。
57.(2)使用搅拌子法测定温敏原位凝胶样品的胶凝温度：
58.取5ml的本实施例制得的眼用温敏原位凝胶放置于一个25ml的烧杯中，将装有凝胶的烧杯放置于磁力搅拌器上加热搅拌，加热速率为每分钟1℃，搅拌速度为100r/min。在烧杯中垂直插入一根水银温度计记录温度，烧杯中搅拌子停止转动的温度即为胶凝温度。
59.倒置小瓶法和搅拌子法的测定结果如图2所示。经倒置小瓶法(如图2a)测定，凝胶样品在4℃保持液体状态，在33℃时形成较为稳定的凝胶；经搅拌子法(如图2b)测定，磁力搅拌子在33℃时由于凝胶形成而停止转动；因此，本实施例制得的眼用温敏原位凝胶样品的胶凝温度为33℃。
60.二、透光性能的比较：
61.(1)宏观拍照法比较本实施例制得的眼用温敏原位凝胶和市售泊洛沙姆水凝胶包载瑞德西韦后的透光性：
62.取一洁净“a”字卡，滴加20μl去离子水作为空白对照。取本实施例制得的眼用温敏原位凝胶和相同浓度瑞德西韦泊洛沙姆水凝胶各20μl滴加于“a”字卡上，比较两者在透光性能上的差异。
63.宏观拍照的结果如图3所示。在4℃下，与去离子水相比，包载瑞德西韦的泊洛沙姆凝胶的透明度显著降低，而包载瑞德西韦的本实施例制得的眼用温敏原位凝胶的透明度未出现明显降低。此外，当本实施例制得的眼用温敏原位凝胶在33℃发生胶凝后，其透光性能也未出现明显变化。
64.(2)透光率法比较本实施例制得的眼用温敏原位凝胶和市售泊洛沙姆水凝胶包载瑞德西韦后的透光性：
65.使用uv
‑
2600220v ch紫外
‑
可见分光光度计对包载瑞德西韦的泊洛沙姆凝胶和本实施例制得的眼用温敏原位凝胶进行透光率的测定。通过分光光度计扫描两种凝胶在整个可见光谱范围(380
‑
780nm)的吸光度a。以去离子水做空白对照，由吸光度a＝1g(1/t)分别
计算凝胶在该单色光下的透光率t并作可见光范围内透光率曲线，并对整个可见光谱范围内两种凝胶的透光率进行比较。
66.透光率比较的结果如图4所示，相比于对照组，本实施例制得的眼用温敏原位凝胶的透光率有一定降低，但差异性检验结果显示p＝0.0537＞0.05，两组透光率无显著性差异。而泊洛沙姆凝胶载药后透光率明显降低。与市售泊洛沙姆凝胶基质相比，dhse
‑
ppg
‑
peg嵌段共聚物包载瑞德西韦后在透光度方面具有显著优势。
67.三、体外释药行为的比较：
68.采用半透膜溶出法模拟体外药物释放：
69.将1ml本实施例制得的眼用温敏原位凝胶和相同体积的市售瑞德西韦
‑
环糊精包合物(美国吉利德科学)放入md25
‑
3.5半透膜袋中，再将其放入10ml人工泪液(美仑生物)中模拟释放。在经过0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h后，分别取1ml的释放基质，使用高效液相法测定其中瑞德西韦的含量，并补充同样体积的人工泪液。
70.测定结果如图5所示。环糊精包合物中的瑞德西韦在1h内基本释放完毕，而本实施例制得的眼用温敏原位凝胶可以维持约4h的瑞德西韦持续释放。
71.四、眼表滞留行为的比较：
72.采用光学相干断层扫描(oct)法观察凝胶的眼表滞留：
73.将c57bl/6小鼠(雄，6
‑
8周)麻醉后固定于观察台上，将20μl市售瑞德西韦
‑
环糊精包合物和相同体积本实施例制得的眼用温敏原位凝胶滴加到小鼠眼表，使用optoprobe isoct进行扫描并采集图像。
74.光学相干断层扫描图像如图6所示。瑞德西韦
‑
环糊精包合物点眼后在眼表形成一层不均匀的水化层，且只能在眼表停留1min。而本实施例制得的眼用温敏原位凝胶在眼表形成一层分布均匀的凝胶，在滴眼50min后仍可以观察到，滞留时间更长。
75.使用sl9900裂隙灯观察本实施例制得的眼用温敏原位凝胶对家兔眼表的刺激情况。如图7所示，与空白组(去离子水)相比，本实施例制得的眼用温敏原位凝胶及其温敏凝胶基质都未表现出对角膜和结膜的刺激性。取角膜组织，石蜡包埋切片，苏木素
‑
伊红染色后发现角膜边界清晰，细胞分层明显，未发现炎性细胞浸润。上述结果说明选用的温敏凝胶基质及药物均具有良好的生物相容性，是一种理想的医用生物材料。
76.实施例5
77.称取100mg实施例2制得的dhse
‑
ppg
‑
peg共聚物用2.5ml四氢呋喃溶解，另外称取500mg瑞德西韦溶于2.5ml乙醇中，再将两溶液混合，超声5min混合均匀得到溶液一。在超声状态下将溶液一缓慢滴加到15ml人工泪液中，混合均匀，挥发有机溶剂，补充去离子水至20ml，制备成瑞德西韦胶束(溶液二)。另外称取10g dhse
‑
ppg
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peg共聚物直接溶于20ml人工泪液中，超声5min混合均匀，4℃放置过夜，涡旋后制备为水凝胶材料(溶液三)。量取2ml溶液二与8ml溶液三低温搅拌混合，涡旋、超声混合均匀，再依次加入0.1％的苯扎溴铵、甘露醇，获得含有0.5％瑞德西韦的眼用温敏原位凝胶。
78.实施例6
79.如图8所示，将质量浓度为0.1％和0.2％的瑞德西韦温敏原位凝胶(分别对应0.1％凝胶组和0.2％凝胶组，制备方法参考实施例3和5)和两组对应的温敏凝胶基质(分别对应0.1％载体组和0.2％载体组，制备方法参考实施例3，区别在于不加瑞德西韦，并分别
对应不同瑞德西韦含量的温敏原位凝胶)用相同量的人工泪液稀释后测试抗病毒活性。将vero 76细胞与sars
‑
cov
‑
2病毒共培养，选取45％乙醇作为阳性对照组(对应乙醇组)，使用人工泪液作为阴性对照组(对应对照组)。结果显示，0.1％和0.2％的瑞德西韦温敏原位凝胶均表现出对病毒的抑制作用。随着药物浓度的增加、与病毒接触时间的延长，本发明眼用温敏原位凝胶制剂的抗病毒作用也相应增强。
80.以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。