基于MRM的植物组蛋白变体H3.3的定量检测方法与流程

基于mrm的植物组蛋白变体h3.3的定量检测方法
技术领域
1.本发明涉及化学检测领域，特别是涉及一种基于mrm的植物组蛋白变体h3.3的定量检测方法。


背景技术：

2.组蛋白作为染色质的组成部分，其翻译后修饰对染色质的结构和功能起到重要的调控作用。通常认为真核生物染色质的基本单元是核小体，核小体由含147个碱基对的dna缠绕组蛋白八聚体(由四种组蛋白h2a、h2b、h3和h4组装而成)构成，核小体之间通过组蛋白h1连接逐步形成其高级结构。除了常规的四种组蛋白外，还包括许多组蛋白的变体，组蛋白不同变体可能携带完全不同的生物学信息，例如组蛋白h3.3主要与转录激活相关。组蛋白变体和其修饰也共同参与染色质的表观遗传。现有报道发现h3氨基尾端(1
‑
40aa)几乎所有的赖氨酸和精氨酸上均可发生翻译后修饰，特别是甲基化和乙酰化修饰。关于组蛋白h3.3的功能以及对植物生长发育的影响研究越来越受到重视。h3.3在愈伤组织形成过程中涉及到细胞命运的转变以及表观遗传重编程。h3.3甲基化修饰对愈伤组织形成，进而对植物的生长发育具有重要调控功能。可见，精准、高效的定量组蛋白变体h3.3上的翻译后修饰对理解组蛋白变体信号在植物愈伤组织形成的机制和植物育种中具有重要的意义。
3.质谱已经成为一项关键的组蛋白分析技术，然而组蛋白变体h3.3上翻译后修饰的分析难点在于组蛋白翻译后修饰状态多样化，各个不同变体间存在相互干扰，同时组蛋白上修饰状态和修饰位点的精准定位需要高质量的串级谱图信息。例如仅h3上k27
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r40这一肽段上存在两个重要的修饰位点k27和k36，对应20种不同组合形式的修饰(k27上有5种，k36上有4种)，在常规数据依赖的质谱采集模式下，许多低丰度修饰肽段因为离子强度不够而被过滤掉，其次，不同变体，不同修饰的肽段常常出现共流出以及混合谱的问题，导致修饰的定位和定量准确度大大降低。目前还没有一种能够针对植物组蛋白变体的翻译后修饰进行准确的定量检测方法，基于现有技术手段的现状，本技术的发明人拟提供一种高通量，高灵敏度，以及高可信度的组蛋白变体h3.3的mrm定量方法，本方法能解决植物组蛋白变体h3.3上翻译后修饰的精准定量问题，并可应用于植物学、表观遗传学等领域。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种基于mrm的植物组蛋白变体h3.3的定量检测方法，以解决上述现有技术存在的问题，基于mrm可以对植物体内的组蛋白h3.3及其修饰肽段快速、准确和高通量的进行定量检测。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种基于mrm的植物组蛋白变体h3.3的定量检测方法，鉴定组蛋白变体h3.3 k27
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r40不同形式修饰的肽段，并合成组蛋白变体h3.3 k27
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r40不同形式修饰的标准肽段，利用质谱多反应监测技术对所述标准肽段进行质谱定量条件优化，以实现对组蛋白变体h3.3 k27
‑
r40不同形式修饰的肽段的定量检测。
7.优选的是，具体包括以下步骤：
8.步骤1：提取植物体内组蛋白，通过组蛋白胶内衍生化反应及酶解，获取组蛋白h3的不同变体；
9.步骤2：利用hplc/ms/ms鉴定组蛋白h3变体h3.3 k27
‑
r40不同形式修饰的肽段，并挑选出可用于质谱多反应监测分析用的肽段样品；
10.步骤3：合成组蛋白变体h3.3 k27
‑
r40不同形式修饰的标准肽段，筛选特异的母子离子对；
11.步骤4：利用质谱多反应监测技术对所述标准肽段进行质谱优化，然后利用优化条件定量检测植物样本中组蛋白变体h3.3 k27
‑
r40不同形式修饰的肽段含量。
12.优选的是，步骤3中，母离子选择的是：响应度好且带3

或4

电荷；子离子选择的是：1)响应度好；2)子离子包含修饰位点(k27和k36)；3)变体之间的子离子无干扰。
13.优选的是，步骤4中，质谱优化包括：特异性母子离子对的筛选以及去簇电压、碰撞能量的优化。
14.优选的是，组蛋白h3.3 k27
‑
r40不同形式的修饰包括：组蛋白h3.3中第27位赖氨酸和第36位赖氨酸以不含修饰、一甲基化、二甲基化、三甲基化任意两种形式组合而成。
15.优选的是，还包括线性范围、重复性、定量检测限的优化。
16.进一步地，在定量方法的开发过程中，由于组蛋白h3上的不同修饰的含量变化很大，差异可达三个数量级，因此对定量方法的线性范围和检测灵敏度有很高的要求。
17.本发明还提供一种所述的方法在定量检测植物体内组蛋白h3.3 k27
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r40不同修饰肽段含量中的应用。
18.本发明公开了以下技术效果：
19.(1)目前缺乏特异性识别植物h3.3和h3.1上翻译后修饰的商业化抗体，基于组蛋白变体序列中的第31位氨基酸差异，多反应监测质谱法可实现特异的检测和定量。
20.(2)本发明基于三重四级杆质谱仪进行多反应监测(mrm)，通过特异性母子离子对的筛选，避免了同分异构体肽段共流出产生的混合谱图，增加了组蛋白变体修饰肽段定量的准确性和可靠性。
21.(3)组蛋白翻译后修饰肽的丰度低，在数据依赖型的采集方式下往往失去二级离子扫描机会，丢失鉴定结果。mrm技术通过母子离子对的双重选择，降低质谱检测的化学背景，显著提高目标检测物的信噪比，增加了低丰度修饰肽段的检测灵敏度。
22.(4)本发明公开的定量检测方法可适用于不同的植物样本及类型，应用范围广。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为本发明的技术流程图，其中包括：mrm方法建立流程，合成h3.3标准修饰肽段，并进行母子离子对筛选，干扰离子排除，和质谱采集条件的优化，之后将该方法应用到野生型拟南芥中进行组蛋白h3.3及其k27和k36位修饰的定量分析；
25.图2为植物组蛋白h3的两个变体h3.1和h3.3，其一级序列以及其不同修饰肽段分子量差异分析；a显示了拟南芥组蛋白h3变体的一级序列，pi以及gravy(疏水性质参数)；b显示不同组蛋白变体的修饰肽段分子量比对；
26.图3为本方法用于拟南芥中h3.3上k27和k36位点修饰h3.1和h3.3组蛋白含量分析，其中a显示了h3.3上k27位点的五种修饰含量和k36位点上四种修饰的相对含量，b显示了拟南芥中h3.3的百分含量。
具体实施方式
27.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
28.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
29.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
30.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
31.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
32.现以具体实施例进行进一步的说明。
33.发明人基于前期对于组蛋白的研究，发现mrm方法在组蛋白修饰定量上具有特殊的优势，因此，基于mrm方法建立流程，合成h3.3标准修饰肽段，并进行母子离子对筛选，干扰离子排除，和质谱采集条件的优化，之后将该方法应用到野生型拟南芥中进行组蛋白h3.3及其k27和k36位修饰的定量分析，具体流程设计图如图1所示。
34.具体地，通过观察组蛋白变体的一级氨基酸序列，发现在组蛋白的n端1
‑
50个氨基酸中存在两个氨基酸差异，即h3.1的31位是a，h3.3上是t，h3.1的41位是f，h3.3上是y(如图2a所示)。在基于衍生化的组蛋白酶解策略中，酶切位点主要发生在精氨酸后，即包含这两个差异位点的肽段仅有k27
‑
r40这一条，因此可以利用31位氨基酸差异识别h3.1或h3.3。
35.理论上，根据31位置的氨基酸差异，可以用mrm的方法对两种变体分别进行定量研究，氨基酸a和t的差异为30da，即k27
‑
r40之间的肽段分子量差异。但是，由于组蛋白h3 n端会发生多种修饰，常见的一甲基化(14da)，二甲基化(28da)，三甲基化(42da)，乙酰化(42da)，以及化学衍生的丙酰化(56da)，因此来自肽段本身氨基酸差异的30da可能会被这些修饰缩小，例如h3.1上的肽段发生二甲基化修饰，而h3.3上的肽段未发生修饰，那么这两
条肽段的母离子相差仅为2da(如图2b所示)。组蛋白的肽段含有较多赖氨酸，因此在质谱中通常会带3
‑
4个电荷，导致m/z的差异仅为0.67da左右或者更低，它们的同位素峰在相对低分辨的四极杆中无法区分，因此会产生母离子干扰，影响定量的准确性。因此，如何基于基于mrm方法对质谱条件进行优化，以实现对组蛋白h3.3及其k27和k36位修饰的定量分析是解决问题的关键条件之一。以下将以实施例方式进一步说明本发明的技术方案。
36.实施例1基于mrm的植物组蛋白变体h3.3 k27/k36的定量检测方法建立及优化
37.1.合成植物组蛋白h3.3
38.生物公司合成如下序列：
39.(artkqtarkstggkaprkqlatkaarksapttggvkkphryrpgtvalreirkyqkstellirklpfqrlvreiaqdfktdlrfqshavlalqeaaeaylvglfedtnlcaihakrvtimpkdiqlarrirgera)k27
‑
r40的20条不同修饰组合肽段溶解于ddh2o中，至最终浓度为100μm，即为母(储)液；
40.2.将1μl母液用0.1％甲酸稀释至100nm，进入质谱采集，对每条肽段的碎片离子响应情况进行分析，挑选出3
‑
5个子离子。母离子选择的是响应度好且带3 或4 电荷，子离子选择的是：1)响应度好；2)子离子包含修饰位点(k27和k36)；3)变体之间的子离子无干扰。
41.3.对选好的离子对优化鉴定条件，包括去簇电压(dp)和碰撞能量(ce)确定质谱采集方法(表1)。
42.表1 mrm质谱定量采集参数
43.[0044][0045]
4.考察线性范围，并确定最低检测线(lod)和最低定量检测线(loq)，将20条肽段分别取2μl混合为标准肽段溶液，配成1.5μl的标准肽段储液。每个样品中均加入相同量的组蛋白标准酶解肽段作为背景，用0.1％甲酸稀释至终浓度梯度为0.02，0.1，1，5，50，100，500和1000nm。
[0046]
如表2所示，在本试验中，20条h3.3的肽段的最低定量检测限(loq)可达0.1fmol，信噪比大于10。质谱响应强度和浓度之间的线性相关系数为0.9912
‑
0.9999。所有的样品检测三次，其cv％小于20％。显示出本发明的方法具有高灵敏度、高准确性和高重复性。
[0047]
表2 h3.3修饰肽段线性范围、重复性及检测限
[0048][0049]
实施例2野生型拟南芥中组蛋白变体h3.3 k27/k36的定量检测分析
[0050]
1、收集15天左右的拟南芥幼苗，采用酸提法抽提核心组蛋白；
[0051]
2、将提取的粗组蛋白进行sds
‑
page凝胶电泳，胶内丙酰化衍生化及酶解反应，具体如下：
[0052]
1)将提取的粗组蛋白进行sds
‑
page凝胶电泳(12.5％或15％的胶)，对蛋白进行考马斯亮蓝染色过夜，之后脱色至背景几乎透明无色，条带清晰；
[0053]
2)将15kd的蛋白切下，主要为h3。用塑料撬胶板将胶条切成尽可能小的立方块(1mm3左右)，置于离心管中；
[0054]
3)用500μl左右的ddh2o低速震荡洗涤15分钟，重复两次；
[0055]
4)加入500μl的脱色液(25mm nh4hco3/50％acn)室温低速震荡20分钟；
[0056]
5)重复脱色步骤直至胶粒无色透明，加入acn 300μl进行干胶，轻轻拨动，静置2分钟，弃去acn，视情况重复干胶步骤两次直至胶粒变白变硬；
[0057]
6)衍生化反应：30μl 100/3mm nh4hco3加10μl 400mm nhs
‑
propionate(分子量171.14，溶于acn)，50℃震荡反应30分钟；该体系可视胶粒体积扩大或缩小；
[0058]
7)向胶粒中加入200μl ddh2o洗涤两次后，重复5)中的acn干胶步骤；
[0059]
8)用25mm nh4hco3稀释胰酶至10ng/μl，加至刚好覆盖胶粒，37℃震荡酶切过夜；
[0060]
9)用200μl 5％fa/50％acn提肽，每次震荡15分钟，超声10分钟，重复两次；
[0061]
10)将两次上清合并，冻干；
[0062]
3、从胶粒中提取组蛋白酶解肽段后，进行第二次丙酰化衍生；
[0063]
4、冻干反应后的肽段，利用优化的mrm质谱条件对酶解后的组蛋白肽段进行定量分析，实现拟南芥样品中h3.3的含量以及其上k27和k36位点翻译后修饰的定量。如图3所示，利用k27
‑
r40这一序列可以对组蛋白变体实现相对定量，采用面积加和定量的方法，计算出h3.3在组蛋白h3中的含量约为60％，h3.3上k27和k36位点的修饰比例如图3a。
[0064]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。