一种5-羟基色氨酸分离提取方法与流程

一种5
‑
羟基色氨酸分离提取方法
技术领域
1.本发明涉及氨基酸生产领域，尤其是一种5
‑
羟基色氨酸分离提取方法。


背景技术：

[0002]5‑
羟基色氨酸(5
‑
htp)是动物体内合成血清素与褪黑素的前体，它们对情绪与行为的控制，以及睡眠、痛觉、体温等生理功能具有重要的调节作用，已被成功用于抑郁症、失眠和偏头痛等疾病的治疗。
[0003]
由于5
‑
htp具有很高的药用保健和市场价值，近年来对5
‑
htp的生产研究发展迅速。目前生产5
‑
htp的方法主要有天然产物提取法、化学合成法和微生物发酵法等工艺技术，陈义等(cn111978238a)通过榨油、提取、粗过滤、精过滤、真空浓缩、萃取除杂、固液分离、精制、水洗除溶剂、干燥、粉碎等工序从非洲植物加纳的种子中提取得到5
‑
htp。胡文辉等(cn102351775b)利用l
‑
色氨酸甲酯/乙酯化得到l
‑
色氨酸甲酯/乙酯盐酸盐，在碱性条件下脱盐酸得到l
‑
色氨酸甲酯/乙酯，经乙酰化成n
‑
乙酰
‑
l
‑
色氨酸甲酯/乙酯，在三乙基硅烷
‑
三氟乙酸还原体系下还原吲哚环，在钨酸钠
‑
30％双氧水体系下氧化吲哚环1位氮，最后在酸性条件下，脱乙酰保护基得到5
‑
羟基色氨酸。上述两种方法均存在不可忽视的弊端，提取法产量低、易受季节影响、原料不足、地域限制成为限制大规模生产的主要瓶颈，化学方法合成反应体系较为复杂，步骤繁琐，成本较高，控制困难，因此近年来微生物发酵法引起了业内的高度重视。微生物发酵法虽然成本低，操作简单，但5
‑
htp的分离提取一直是业内的难题，因发酵的不成熟性，5
‑
htp产量较低，常规提取方法提取收率较低，产品损耗严重；菌体分解导致可溶性蛋白增多，进一步提高了分离提取的难度；以色氨酸为首的发酵副产物难以控制，且色氨酸其理化性质与5
‑
htp极其相似，成为了5
‑
htp分离提取中最大的难点。


技术实现要素：

[0004]
本发明所要解决的技术问题在于提供一种5
‑
羟基色氨酸分离提取方法。
[0005]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0006]
一种5
‑
羟基色氨酸分离提取方法，发酵工程菌为大肠杆菌e.coli htp10，提取步骤包括发酵获得发酵液、菌体分离、色素分离、副产物分离、蛋白分离、干燥获得产品。
[0007]
优选的，上述5
‑
羟基色氨酸分离提取方法，具体步骤如下：
[0008]
(1)对大肠杆菌e.coli htp10进行扩大培养，得到含5
‑
htp的发酵液，将发酵液ph调至4.0
‑
4.2，并加热至70℃，随后进行超滤除去菌体及部分大分子蛋白；
[0009]
(2)将超滤后的澄清发酵液通过纳滤膜进行纳滤，除去不可溶性小分子蛋白及残余不可溶性物质；
[0010]
(3)将纳滤后液体浓缩至原体积的35
‑
50％，通过阴离子吸附树脂进行脱色处理；
[0011]
(4)将步骤(3)获得的发酵液使用活性炭再次脱色；
[0012]
(5)将步骤(4)获得的发酵液浓缩至原体积的30
‑
40％，使用阳离子交换树脂进行初步分离纯化，洗脱剂选用低浓度氨水溶液；
[0013]
(6)将步骤(5)获得的清液浓缩至原体积的40
‑
60％进行干燥；
[0014]
(7)将步骤(6)所得固体研磨至细粉状，使用低浓度甲酸复溶，轻微搅拌后迅速过滤获得纯净5
‑
htp；
[0015]
(8)将步骤(7)过滤所得到的固体干燥，即得。
[0016]
优选的，上述5
‑
羟基色氨酸分离提取方法，所述步骤(1)中使用的ph调节试剂选用硫酸，加热方式根据发酵液总量选择微波炉或板式换热器，超滤选用无机陶瓷膜过滤，截留分子量在25000
‑
30000，循环过滤除去菌体及大分子蛋白以及其他发酵液中不可溶性物质。
[0017]
优选的，上述5
‑
羟基色氨酸分离提取方法，所述步骤(2)中的纳滤膜截留分子量在300
‑
400，可除去分子量大于400的绝大部分物质。
[0018]
优选的，上述5
‑
羟基色氨酸分离提取方法，所述步骤(3)中浓缩方式采用反渗透浓缩或采用蒸发浓缩，阴离子吸附树脂采用弱碱型阴离子吸附树脂，型号为sqd301
‑
fd，初步脱色以及除去小分子可溶性蛋白。
[0019]
优选的，上述5
‑
羟基色氨酸分离提取方法，所述步骤(4)中的的活性炭用量为质量体积比0.2
‑
0.3％，即每升发酵液使用2
‑
3g活性炭，优选的为3g/l，进一步脱色。
[0020]
优选的，上述5
‑
羟基色氨酸分离提取方法，所述步骤(5)中的阳离子交换树脂采用强酸型阳离子交换树脂，型号为sd001
×
7h，洗脱剂采用0.3mol/l的氨水，该步骤用于分离发酵液中其他氨基酸副产物，如谷氨酸，以及初步分离色氨酸与5
‑
htp，但由于两者洗脱时间相近，因此并不能很好地分离色氨酸与5
‑
htp。
[0021]
优选的，上述5
‑
羟基色氨酸分离提取方法，所述步骤(6)中的干燥方法为喷雾干燥、蒸发干燥、冷冻干燥或闪蒸干燥。
[0022]
优选的，上述5
‑
羟基色氨酸分离提取方法，所述步骤(7)中的低浓度甲酸为8
‑
10％的甲酸溶液，色氨酸极易溶解于甲酸溶液，而5
‑
htp在甲酸中较稳定，利用此特性可进一步分离色氨酸与5
‑
htp，其中甲酸浓度过低会使得5
‑
htp溶解，色氨酸的溶解度也会随之下降，降低了收率与纯度，过高成本过高，造成浪费；将步骤(6)中所得固体研磨成蓬松的粉末状，加入甲酸溶液后轻微搅拌后迅速过滤，根据溶液体积选用抽滤、板框式过滤或旋转真空过滤的方式。
[0023]
优选的，上述5
‑
羟基色氨酸分离提取方法，所述步骤(8)的干燥为65
‑
85℃烘箱干燥、盘架式干燥或气流干燥的方式。
[0024]
有益效果：
[0025]
上述5
‑
羟基色氨酸分离提取方法，解决了微生物发酵生产5
‑
htp提取困难的问题，提取过程操作简单，步骤少，提高了提取收率；提取设备要求低，降低了提取成本，提高了提取效率；产品提取纯度高，提取收率可观，提高了产品竞争力与生产利润；提取过程清洁环保，具有环境友好性，降低了后续废气废液处理成本，进一步提高了经济效益。
具体实施方式
[0026]
实施例1
[0027]
以大肠杆菌e.coli htp10(由e.coli w3110(atcc 27325)经人工改造获得，购自天津科技大学)为生产菌，在斜面培养基上活化两代，斜面培养基：蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母粉5g/l，nacl 2.5g/l，琼脂粉25g/l，ph＝6.8～7.0；将二代活化后的菌种全部
接种至种子种子罐，进行种子罐培养，其中种子培养基为：葡萄糖20g/l，mgso
4 0.5g/l，kh2po
4 1.2g/l，(nh4)2so
4 5g/l，feso4.7h2o 10mg/l，mnso4.h2o 5mg/l，酵母浸粉10g/l，v
b1 0.3mg/l，v
h 0.2mg/l，消泡剂1g/l，并用氨水将培养基调节并维持ph到6.7～7.0，当种子罐od
600
≥25时接发酵罐；接种15％的种子液到发酵罐，连续培养，2h流加100ml复合辅料，每升发酵液中流加复合辅料成分为2g色氨酸、4g谷氨酰胺和2gα
‑
酮戊二酸，发酵32h得到发酵液。采用的发酵培养基为：葡萄糖20g/l，酵母粉4g/l，mgso
4 1.2g/l，kh2po
4 2g/l，(nh4)2so
4 5g/l，feso4.7h2o 10mg/l，mnso4.h2o 10mg/l，玉米浆20ml/l，vb mix 2mg/l，用氨水将发酵罐培养调节并维持ph到6.7
‑
7.0之间。
[0028]
上述e.coli htp10由e.coli w3110(atcc 27325)经人工改造获得的具体方法为：由野生型大肠杆菌经下述方法改造得到的：敲除tnaa基因以阻止色氨酸及5
‑
羟基色氨酸的分解代谢；在其基因组的laciz位点上整合了由木糖启动子p
xylf
控制的t7rnap基因，在失活laci蛋白的同时使细胞可以利用木糖诱导产生rna聚合酶t7rnap；用解除反馈抑制的突变体trpe
fbr
基因替换大肠杆菌原有的trpe基因，并用p
trc
启动子引导色氨酸操纵子的表达，以强化分支酸途径；将解除反馈抑制的突变体arog
fbr
基因sera
fbr
基因串联整合至大肠杆菌基因组的yjiv位点，并用p
trc
启动子引导表达，以强化莽草酸途径和丝氨酸合成途径；敲除tyrr基因及trpr基因，以实现负转录调控蛋白tyrr和trpr的缺失；在其基因组mbha位点整合了由t7启动子引导表达的编码人源2型色氨酸羟基化酶短截突变体的tph150基因，以构建胞内色氨酸羟基化途径；将来源于枯草芽孢杆菌的mtra基因和来源于人类的ptps基因、spr基因、pcd基因和dhpr基因，串联整合至大肠杆菌基因组yghx位点处，以引入辅酶四氢蝶呤的合成途径与再生途径，其中mtra基因、ptps基因、spr基因由同一个p
trc
启动子引导表达，pcd基因、dhpr基因由同一个p
trc
启动子引导表达；其中，
[0029]
所述野生型大肠杆菌为e.coli w3110，保藏号atcc 27325；
[0030]
所述木糖启动子p
xylf
具有序列表seq id no.seq id no.1所示核苷酸序列；
[0031]
所述rna聚合酶t7rnap具有序列表seq id no.2所示核苷酸序列；
[0032]
所述trpe
fbr
基因具有序列表seq id no.3所示核苷酸序列；
[0033]
所述p
trc
启动子，具有序列表seq id no.4所示核苷酸序列；
[0034]
所述arog
fbr
基因具有序列表seq id no.5所示核苷酸序列；
[0035]
所述sera
fbr
基因具有序列表seq id no.6所示核苷酸序列；
[0036]
所述强启动子pt7启动子具有序列表seq id no.7所示核苷酸序列；
[0037]
所述编码人源2型色氨酸羟基化酶短截突变体的tph150基因具有序列表seq id no.8所示核苷酸序列；
[0038]
所述mtra基因来源于枯草芽孢杆菌，负责编码gtp环化水解酶ⅰ，具有序列表seq id no.9所示核苷酸序列；
[0039]
所述人源ptps基因，负责编码6
‑
丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶，具有序列表seq id no.10所示核苷酸序列；
[0040]
所述人源spr基因，负责编码鸟蝶呤还原酶，具有序列表seq id no.11所示核苷酸序列；
[0041]
所述人源pcd基因，负责编码蝶呤
‑
4α
‑
甲醇氨脱水酶，具有序列表seq id no.12所示核苷酸序列；
[0042]
所述人源dhpr基因，负责编码双氢蝶呤还原酶，具有序列表seq idno.13所示核苷酸序列。
[0043]
实施例2
[0044]
以实施例1中所述的培养方法，在5l发酵罐中发酵32h得到4l发酵液，其中5
‑
htp产量为2.7g/l，色氨酸产量为1.5g/l，菌体量为66(od
600
)，可溶性蛋白3.7g/l，将发酵液分成4份，每份1l，进行活性炭用量的研究。脱色时间均为30min，脱色温度50℃，并设置超声装置辅助脱色。活性炭用量分为0.15％、0.2％、0.3％、0.4％，对应设为a、b、c、d组，以未脱色前的吸光度为a0，脱色后的吸光度为a，则脱色率以脱色率、提取收率、产品纯度为指标，结果如表1所示：
[0045]
表1活性炭用量对脱色率的影响
[0046][0047]
如表1所示可看出，0.3％的添加量已达到最佳脱色效果，高于0.3％的添加量只会增大成本，并无法起到更好的脱色效果。
[0048]
实施例3
[0049]
以实施例1中的培养方法，在30l发酵罐中发酵32h得到16l发酵液，其中5
‑
htp产量为2.6g/l，色氨酸产量为1.4g/l，菌体量为68(od
600
)，可溶性蛋白3.7g/l，将发酵液分成4份，每份4l，进行甲酸浓度的实验。浓度梯度设为5％、8％、10％、20％、40％，对应称为a、b、c、d、e组，每组甲酸使用量均为1：60(质量体积比，即1g干粉使用60ml甲酸溶液)，以提取收率、产品纯度为指标，结果如表2所示：
[0050]
表2复溶甲酸浓度对提取的影响
[0051][0052]
如表2所示，当甲酸浓度过低时，色氨酸与5
‑
htp均能较好的溶解，因此提取收率与产品纯度均较低，当浓度提升到8％时，5
‑
htp溶解度下降，而色氨酸溶解度上升，因此当轻微搅拌后，色氨酸几乎全部溶解，迅速过滤后5
‑
htp纯度较好，值得注意的是，搅拌过程一定要轻微，当搅拌幅度过大时，5
‑
htp也会出现一定程度的溶解，因此轻微搅拌，迅速过滤是这一步的重点。
[0053]
实施例4
[0054]
以实施例1中的培养方法，综合实施例2、3中的最适条件，在100l发酵罐中发酵32h得到60l发酵液，其中5
‑
htp产量为2.7g/l，色氨酸产量为1.4g/l，菌体量为67(od
600
)，可溶
性蛋白3.2g/l。本部分实施例提取过程为：用硫酸将发酵液ph调至4.0并加热至75℃，使用陶瓷膜过滤器循环过滤得到发酵清液，将得到的清液使用纳滤膜再次过滤，除去小分子蛋白与部分色素，随后使用蒸发浓缩的方法将发酵液浓缩至原体积的40％，将得到的浓缩清液使用弱碱性阴离子吸附树脂再次脱色，并除去可溶性蛋白，将脱色后的清液使用0.3％活性炭再次脱色，随后浓缩至原体积的30％，通过强酸型阳离子交换树脂吸附分离除色氨酸以外的其他副产物，再次蒸发浓缩，使用气流式干燥，将干燥后的固体充分打碎成蓬松的粉末状，使用终浓度为8％的甲酸(体积/体积)复溶，过滤后使用气流式干燥器干燥，最终提取收率为56％，产品纯度为98％。
[0055]
实施例5
[0056]
以实施例1中的培养方法，综合实施例2、3中的最适条件，在500l发酵罐中发酵32h得到300l发酵液，其中5
‑
htp产量为2.6g/l，色氨酸产量为1.2g/l，菌体量为69(od
600
)，可溶性蛋白3.7g/l。本部分实施例提取过程为：用硫酸将发酵液ph调至4.0，使用板式换热器加热至75℃，使用陶瓷膜过滤器循环过滤得到发酵清液，将得到的清液使用纳滤膜再次过滤，除去小分子蛋白与部分色素，随后使用蒸发浓缩的方法将发酵液浓缩至原体积的40％，将得到的浓缩清液使用弱碱性阴离子吸附树脂再次脱色，并除去可溶性蛋白，将脱色后的清液使用0.3％的活性炭再次脱色，随后浓缩至原体积的30％，通过强酸型阳离子交换树脂吸附分离除色氨酸以外的其他副产物，再次蒸发浓缩，使用喷雾干燥器，将干燥后的固体充分打碎成蓬松的粉末状，使用8％的甲酸(体积/体积)复溶，过滤后使用85℃烘箱挥发干燥，最终提取收率为55％，产品纯度为99％。
[0057]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。