使用时抽空阵列的系统和方法与流程

使用时抽空阵列的系统和方法
1.本技术是是中国申请号为201880034455.1(对应于pct国际申请号pct/ us2018/034194)、申请日为2018年5月23日、发明名称为“使用时抽空阵列的系统和方法”的发明专利申请的分案申请。
2.相关申请
3.本专利申请要求2017年5月24日提交的序列号为62/510,682的美国临时专利申请的权益和优先权，其全部内容通过引用的方式并入本文。
技术领域
4.本公开大体上涉及用于在封闭系统中的使用时抽空和填充腔室(例如，反应孔的阵列或试剂泡罩(reagent blister))的装置以及制造和使用该装置的方法。


背景技术：

5.在美国、加拿大和西欧，传染病约占人类死亡率的7％，而在发展中地区，传染病占人类死亡率的40％以上。传染病导致多种临床表现。常见的明显症状是发烧、肺炎、脑膜炎、腹泻和含血腹泻。虽然物理症状提示某些病原体并排除其他病原体作为病因，但仍然存在各种潜在的病因，而且明确的诊断通常需要进行各种化验。诊断病原体的传统微生物技术可能需要花费数天或数周的时间，通常会延迟适当的治疗过程。
6.近年来，聚合酶链反应(pcr)已成为用于快速诊断传染原的一种选择方法。pcr可以是诊断传染病的快速、灵敏且特定的工具。但是，使用pcr 作为主要诊断手段的挑战在于，可能的病原性生物或病毒种类繁多，并且某些病理标本中存在的生物或病毒水平较低。进行大量组的pcr化验通常是不切实际的，每种可能的致病性生物或病毒需要一组pcr化验，其中的大多数预期是阴性的。当病原体核酸浓度低且需要大量样本以收集足够的反应模板(reaction template)时，该问题更加严重。在某些情况下，没有足够的样本来化验所有可能的病原体。一种方案是进行“多重pcr”，其中，在单个反应中同时化验样本中的多个靶标。尽管多重pcr已被证明在某些系统中是有价值的，但在高水平多重反应的稳健性和清晰分析多种产物的难度方面存在缺陷。为了解决这些问题，随后可将化验分为多个次级pcr。将次级反应嵌套在初级产物中提高了稳健性。诸如(biofire diagnostics，llc，盐湖城，犹他州)之类的封闭系统减少了处理，从而降低了污染风险。
7.技术问题
8.多种分析系统和方法结合了多孔阵列作为对众多样本进行分析的手段。通常，这种样本容器中的每个孔都旨在提供独立的分析。因此，孔和其中的分析材料通常设计成保持彼此分开，之间没有任何实质性的串扰。由于这个原因，装填阵列的每个孔带来了挑战，尤其是在封闭系统中。例如，在一些封闭的阵列系统中，可通过延伸到每个孔的单独的流体通道来分别装填孔，以减少孔之间的交叉污染。然而，在不形成气泡的情况下填充这样的通道可能是具有挑战性的，并且孔中气泡的存在可能是有问题的，因为一些孔的样本体积可能减小，并且气泡的存在可能导致检测问题。另外，这样的系统可能是昂贵且制造麻烦的。
此外，使用单独的流体通道可能会在材料中以及因此在分析结果中产生孔之间的变化。
9.在其他系统中，可以同时向全部或部分阵列注入(flood)材料，并且可以使用到每个孔中的限制性开口来减少孔之间的污染。例如，该阵列可以具有密封孔的膜盖，在每个孔上方的膜中设置有穿孔(piercing)。参见例如美国专利号8,895,295，其全部内容通过引用的方式并入本文。可以将流体材料分散在阵列覆盖膜的表面上，使得等分的流体材料通过各自的穿孔进入每个孔中。穿孔可以被配置为限制流体从孔中流出(例如，在没有施加到其上的力的情况下)。
10.在各种系统中，可以使用压差向孔中装填流体。例如，可以使用正压迫使样本通过流体通道、通过穿孔(如果适用的话)并进入孔中。但是，如果系统中的压力累积，则施加正压可能会损坏与阵列相关的结构特征。因此，一些采用正压和分开的流体通道来填充每个孔的现有系统使用排出口或溢流系统(例如，孔外的“流出”通道)，其允许过量填充。但是，此方法需要精确测量被迫进入系统的流体量，并且通常会导致孔间以及样本容器之间的填充变化。另外，排出通道可能会无意中将污染物引入阵列系统，这会损坏装置并产生错误的结果。此外，虽然流体通道中存在的一些空气被进入的流体排出，但是气泡可能会滞留在通道中，这可能会影响样本的分析，并且在涉及热循环的分析方法中可能增强串扰，因为在加热期间气泡膨胀。
11.作为替代，可以使用负压(或真空)将流体材料抽吸到每个孔中。使用单独的流体通道填充每个孔的现有系统可以通过经流体样本抽吸真空来从孔和流体通道中抽出空气。因此，当释放真空时，流体材料通过流体通道被吸入每个孔中。但是，真空度(或压差)被限制于流体样本的分压。例如，在室温(即20
‑
25℃)和1个大气压下，水的分蒸气压约为25
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32毫巴，当抽真空时，水的分蒸气压升高。因此，在水或其他流体存在的情况下，只能从每个孔中去除有限量的空气。
12.在现有的阵列注入系统中，可以在制造时施加真空或抽真空。例如，可以将阵列密封在抽气室中，使得该阵列在真空(或负压)条件下组装。然后在保持制造过程中施加的真空的条件下包装、存储和运输阵列系统。但是，这样的系统需要能够在使用前保持适当真空度的材料和/或包装，这会给产品增加相当大的费用。
13.因此，在本领域中需要用于在封闭系统中对腔室(例如，反应孔的阵列或试剂泡罩)原位抽空和填充的产品、方法和系统，需要配置用于在封闭系统中原位抽空腔室的仪器，需要用于采用原位抽空的反应室的使用方法以及需要用于制造配置用于原位抽空的反应容器的方法。


技术实现要素：

14.技术方案
15.本公开的实施例利用新颖的系统和方法解决了本领域中的前述或其他问题中的一个或多个，该新颖的系统和方法用于尤其是在封闭的环境中对于一种或多种类型的腔室的使用时抽空并且优选地随后填充。例如，一些实施例包括阵列组件，其可以在使用时和/或实时地(即，在执行分析方法的步骤期间)按需被抽空。因此，在优选实施例中，真空仅需要保持几秒钟到几分钟(即足够长的时间来抽真空、重新密封系统、并且优选地打开填充密封件以用液体填充抽空的腔室(例如，孔阵列))。因此，在打开填充密封件时，可以使用接近
完全抽吸的真空将流体抽入阵列组件中。
16.因为在一个说明性示例中，没有通过液体样本抽真空，所以真空不限于液体(例如水)的蒸气压。强真空的负压水平可从阵列组件中完全排出空气，从而使阵列组件中的残留空气最少。说明性地，在释放真空时，强真空还有效地将全部的恒定量的流体吸入每个孔中。由于阵列组件中的空气已被完全抽空，因此与现有系统相比可以减少、可以最小化或优选地消除吸入流体中的气泡。而且，阵列组件可以被配置为(例如，尺寸化和结构化为)使得不需要抽气室来施加真空。替代地，在说明性实施例中，可以使用活塞泵或其他真空装置来向阵列组件中施加更接近真实真空的真空。
17.在一些实施例中，阵列组件可以具有配置成阵列的多个孔、与多个孔和真空端口流体连通的真空通道以及与多个孔和储液器流体连通的阵列填充通道。流体通道和真空通道可以是共同对准的并且可以是共同延伸的，并且在一些实施例中，可以是相同的。可打开的填充密封件可以设置在填充通道中或流体通道中，该流体通道设置在填充通道与储液器之间。在一些实施例中，填充密封件可以是或可以包括可打开的密封件(例如，易碎的密封件或可剥离的密封件)，诸如通过塌陷(collapse)填充通道或流体通道形成的密封件。真空装置可以与真空端口耦接，真空可以施加到阵列组件(即，真空通道、多个孔和填充通道)。
18.优选地，真空密封件可以放置在真空通道上方(例如，在真空端口和多个孔之间)，以保持孔中的真空。优选地可放置在阵列和另一个泡罩(blister) (例如，储液器)之间的可打开的填充密封件可在阵列组件处于真空下时防止储液器抽空。当填充密封件打开时，储液器中的流体可通过流体通道和阵列填充通道被吸入多个孔中。在多个孔中，流体可以与一种或多种试剂混合。
19.在一些实施例中，孔密封件可以形成在多个孔中的至少一些之间。例如，阵列填充通道的各段可以延伸通过阵列中的一行的孔。因此，填充通道段可以与该行中的孔连通，但是不与相邻行或不同行中的孔直接连通。通过形成孔密封，例如在卡层和第二膜层之间的热焊，在该行孔和填充通道段的交叉处，可以将每个孔密封或与所有其他孔隔离。这样，可以最小化或消除阵列的孔之间的串扰。
20.在一些实施例中，还可以在与流体储液器和填充通道流体连通的流体通道中形成可打开的填充密封件。因为阵列组件不需要在真空下(例如在真空室内)组装，所以不需要在真空密封的容器中包装、存储和运输阵列组件。本公开的这一优点可以节省大量的劳力和材料成本，从而使利用阵列组件执行的分析技术对于消费者而言更能负担得起。而且，由于不需要使用坚固的、可真空密封的包装容器，因此本公开的实施例可以具有较小的材料占地面积。
21.在一些实施例中，阵列组件可以包括具有形成在其中的多个孔的卡层、接合到卡层的第一侧的第一膜层和/或接合到卡层的第二侧的第二膜层。第一膜层可以密封多个孔中的每一个的第一端。第二膜层可以至少部分地密封多个孔的第二端。第一膜层和第二膜层可以形成其中设置有卡层的贮袋(pouch)。例如，可以通过在第一膜层和第二膜层之间的黏合剂或热成型而层压卡层。
22.在某些实施例中，卡层、第一膜层和/或第二膜层可以被配置为和/或协作以形成真空通道和/或阵列填充通道。例如，在至少一个实施例中，真空通道和/或填充通道可以形成在卡层中，或者例如可以被压入其表面部分中。在一些实施例中，真空通道和/或填充通
道可以形成在第二膜层或其表面部分中。第二膜层可以接合到第三膜层，使得在第二膜层和第三膜层之间形成真空通道和/或填充通道。第三膜层可以具有多个穿孔。穿孔可以与多个孔、真空通道和/或填充通道对准和/或流体连通。
23.可以通过将第一膜层接合到卡层的第一侧并且将第二膜层接合到卡层的第二侧以形成真空通道和阵列填充通道来制造阵列组件。在一些实施例中，第一膜层和第二膜层可以接合在一起形成卡层贮袋。将膜层接合在一起可以形成样本器皿的流体通道、储液器和/或其他组件。可以可选地为卡层(例如，其中形成有凹入的导管)准备有在多个孔中的试剂，并通过将第一膜层和第二膜层分开而形成的开口而将卡层插入贮袋中。第一膜层和第二膜层可以被接合到卡的相对侧，并且贮袋可以与其中的卡层密封，例如通过热焊接贮袋中的开口。
24.本文描述的是：
25.1.一种阵列组件，包括：
26.第一层和至少第二层；
27.第三层，其中形成有多个孔，该第三层设置在第一层和第二层之间；
28.真空通道，与多个孔和真空端口流体连通；以及
29.阵列填充通道，与多个孔和流体源流体连通。
30.2.根据条款1所述的阵列组件，其中，该第一层和第二层是膜层。
31.3.根据条款1或2所述的阵列组件，其中，该第三层包括卡层，具有形成在其中的多个孔。
32.4.根据条款3所述的阵列组件，其中，该第一层接合到卡层的第一侧并密封多个孔中的每一个的第一端，该第二层接合到卡层的第二侧并密封多个孔中的每一个的第二端。
33.5.根据条款1
‑
4所述的阵列组件，其中，该真空端口包括在第一层或所述第二层中的一个或多个中的开口。
34.6.根据条款3
‑
5所述的阵列组件，还包括在卡层中的凹入导管，其中，真空通道和阵列填充通道中的一个或多个的至少一部分形成在第二膜层与卡层中的凹入导管之间，并且其中，卡层中的凹入导管具有歧管构造，该歧管构造通过至少两条路径将多个孔流体连接到真空端口，并通过至少两条路径将每个孔流体连接到流体源。
35.7.根据条款1
‑
6所述的阵列组件，其中，该真空通道的至少一部分设置在阵列填充通道的至少一部分内和/或与阵列填充通道的至少一部分共同定位。
36.8.根据条款1
‑
7所述的阵列组件，还包括在多个孔和流体源之间的阵列填充通道中可打开的密封件。
37.9.根据条款1
‑
8所述的阵列组件，其中，该多个孔布置成相应的多行，该阵列填充通道包括进入通道，其与流体源和歧管通道组件流体连通，该歧管通道组件包括：
38.多个分支通道，沿相应的多行延伸，该多个分支通道分别与多个孔流体连通；以及
39.第一主通道，沿着多行的第一端延伸，多个分支通道从第一主通道延伸，阵列填充通道与第一主通道连通。
40.10.根据条款1
‑
9所述的阵列组件，其中，歧管通道组件还包括与多个分支通道流体连通的第二主通道，该第二主通道沿多行的第二端延伸，真空端口与第二主通道连通，其中，每个孔通过至少两个不同的路径与真空端口和流体源流体连通。
41.11.根据条款1
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10所述的阵列组件，其中，歧管通道组件还包括分别从多个分支通道中的每一个延伸到多个孔的多个连接通道，多个连接通道分别与多个孔流体连通。
42.12.一种制造阵列组件的方法，所述方法包括：
43.提供具有设置在其中的多个孔的卡层；
44.将卡层设置在第一膜层和至少第二膜层之间；
45.将第一膜层接合至卡层的第一侧；以及
46.将第二膜层接合到卡层的第二侧，
47.其中，卡层和第一膜层或第二膜层中的至少一个形成：
48.(i)在多个孔和真空端口之间延伸和/或与多个孔和真空端口流体连通的真空通道；以及
49.(ii)在多个孔和流体源之间延伸和/或与多个孔和流体源流体连通的阵列填充通道。
50.13.根据条款12所述的方法，其中，卡层中的凹入导管具有歧管构造。
51.14.一种在样本上使用阵列组件的方法，包括
52.(a)提供样本容器，该样本容器包括与阵列组件流体连通的反应区，该阵列组件包括
53.配置成阵列的多个孔，
54.在反应区和阵列之间的进入开口，
55.真空端口，
56.多个通道，使得阵列中的每个孔都流体连接到进入开口和真空端口；
57.(b)在反应区中对样本执行分析方法以产生反应混合物；
58.(c)打开真空端口并随阵列组件抽真空，以使空气从多个孔和多个通道中排出；
59.(d)密封真空端口，使得多个孔保持在真空下，从而形成抽空的阵列；以及
60.(e)打开进入开口，使得反应混合物通过阵列填充通道被吸入多个孔中。
61.15.根据条款14所述的方法，还包括将反应混合物与置于多个孔的每一个中的一种或多种试剂混合以形成第二混合物，并对第二反应混合物执行第二分析方法。
62.16.根据条款14或15所述的方法，其中，第二混合物是pcr混合物。
63.17.根据条款14
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16所述的方法，还包括使第二反应混合物热循环。
64.18.根据条款14
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17所述的方法，还包括检测多个孔的至少一个中的扩增产物。
65.19.根据条款14
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18所述的方法，其中，样本包括微生物，并且一种或多种试剂包括抗生素。
66.20.根据条款19所述的方法，其中，抗生素以第一浓度存在于多个孔中的第一个中，并且以第二浓度存在于多个孔中的第二个中，其中，第二浓度低于第一浓度。
67.21.根据条款14
‑
20所述的方法，其中，步骤(c)在多个孔中提供介于约 2毫巴和约150毫巴之间的真空。
68.22.根据条款14
‑
21所述的方法，其中，步骤(c)和(d)在步骤(b)完成之前执行。
69.23.一种用于在密封的样本容器中进行多步骤生物反应的方法，包括：
70.(a)提供密封的容器，该容器包括第一反应区、第二反应区和第二反应区中的干燥组分，
71.(b)在第一反应区中进行第一反应，以生成反应混合物，
72.(c)在第二反应区中用水合流体水合干燥组分以产生水合组分，其中，步骤(c)在步骤(b)之前或在步骤(b)期间执行，
73.(d)将反应混合物的一部分加入到水合组分，以及
74.(e)在第二反应区中进行第二反应。
75.24.根据条款23所述的方法，其中，第二反应区是孔的阵列，其中，每个孔都设置有干燥组分，并且其中至少多个孔具有与多个孔中的其他孔不同的组分。
76.25.根据条款23或24所述的方法，其中，孔阵列中的每个单独的孔均设置有阻隔层，该阻隔层阻碍水合流体进入孔中。
77.26.根据条款23
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25所述的方法，其中，水合步骤包括用水合流体填充多个孔，随后从孔阵列中除去任何过量的水合流体。
78.27.根据条款23
‑
26所述的方法，其中，添加步骤包括
79.将反应混合物移至阵列，
80.允许反应混合物的一部分越过阻隔层并进入每个孔，以及
81.从阵列中除去任何过量的反应混合物。
82.28.根据条款23
‑
26所述的方法，其中，添加步骤包括
83.将反应混合物移至阵列，以及
84.将反应混合物的一部分密封在阻挡层外部的每个孔附近，以使反应混合物和水合组分经过阻隔层而混合。
85.29.根据条款23
‑
28所述的方法，其中，阻隔层是每个孔具有一个或多个开口的穿孔层，其中，开口的尺寸被设置为使得在没有力的情况下，流体不容易流过开口。
86.30.根据条款23
‑
29所述的方法，其中，第一反应是第一级pcr，第二反应是第二pcr。
87.31.根据条款23
‑
30所述的方法，其中，在步骤(d)之前，第二反应区保持在冷却温度。
88.32.根据条款23
‑
31所述的方法，还包括在步骤(c)之前用局部真空将至少第二反应区抽空。
89.33.一种阵列组件，包括：
90.具有以阵列排列的多个孔的卡；
91.在卡的第一侧的进入开口；
92.通道系统，与进入开口和多个孔流体连通；以及
93.真空端口，与通道系统流体连通。
94.34.根据条款33所述的阵列组件，其中，阵列包括多行，多行中的每行包括一个或多个孔，通道系统包括歧管通道组件，该歧管通道组件包括：
95.多个分支通道，沿多行延伸，该多个分支通道分别与多个孔流体连通；以及
96.第一主通道，与进入开口流体连通，沿着多行的第一端延伸，多个分支通道从第一主通道延伸，
97.第二主通道，与多个分支通道流体连通，该第二主通道沿多行的第二端延伸，真空端口与第二主通道连通，
98.其中，每个孔通过至少两个不同的路径与真空端口和进入开口流体连通。
99.35.根据条款33或条款34中的一项所述的阵列组件，还包括第一膜层和第二膜层，其中，第一膜层和第二膜层形成贮袋，卡层至少部分地密封在贮袋的内部。
100.36.一种反应容器，包括：
101.多个流体连接的反应室，
102.阵列，包括
103.进入开口，与流体连接的反应室中的至少一个流体连通；
104.多个反应孔；
105.真空端口；
106.通道系统，与进入开口，多个孔和真空端口流体连通，通道系统提供路径，使得阵列中的每个反应孔通过至少两个路径流体连接至真空端口，并且每个反应孔还通过至少两条路径连接到流体源。
107.37.根据条款36所述的阵列组件，其中，真空端口可逆地可密封，进入开口可逆地可密封。
108.38.一种阵列组件，包括：
109.多个孔，布置成阵列；
110.真空通道，与多个孔和真空端口流体连通；以及
111.阵列填充通道，与多个孔和流体源流体连通。
112.39.根据条款38所述的阵列组件，还包括
113.卡层，具有形成在其中的多个孔，
114.第一膜层，接合到卡层的第一侧，其中，第一膜层密封多个孔中的每一个的第一端，
115.第二膜层，接合到卡层的第二侧，其中，真空端口包括在第一膜层和第二膜层中的一个或多个中的开口。
116.40.根据条款38或39所述的阵列组件，其中，真空通道和阵列填充通道中的一个或多个的至少一部分形成在(i)卡层中、(ii)第二膜层中、或(iii) 卡层和第二膜层之间。
117.41.根据条款38
‑
40所述的阵列组件，其中，真空通道和阵列填充通道中的一个或多个的至少一部分形成在第一膜层和第二膜层之间。
118.42.根据条款38
‑
41所述的阵列组件，其中，阵列填充通道的一部分形成在第一膜层和第二膜层之间，并且围绕卡层的周边的至少一部分设置。
119.43.根据条款38
‑
42所述的阵列组件，还包括在卡层中的凹入导管，其中，卡层中的凹入导管具有歧管配置，其中，阵列中的每个孔通过至少两条路径流体连接到真空端口，并且每个孔还至少通过两条路径连接到流体源。
120.44.根据条款38
‑
43所述的阵列组件，其中，第二膜层具有形成在其中的凹入导管，还包括设置在第二膜层和卡层之间的第三膜层，其中，第三膜层具有穿过其中延伸的多个穿孔，并且其中，多个穿孔与第二膜层中的凹入导管流体连通。
121.45.根据条款38
‑
44所述的阵列组件，其中，阵列填充通道的至少一部分设置在第二膜层中的凹入导管与接合处之间，该接合处在第二膜层中的凹入导管的两个或更多个部分之间的第三膜层和第二膜层之间。
122.46.根据条款38
‑
45所述的阵列组件，其中，真空通道的至少一部分被设置为阵列填充通道的一部分，并且被配置为将阵列填充通道保持在打开位置。
123.47.根据条款38
‑
46所述的阵列组件，还包括在多个孔和流体源之间的阵列填充通道中的可打开的密封件。
124.48.根据条款38
‑
47所述的阵列组件，还包括设置在多个孔的每一个中的一种或多种试剂。
125.49.根据条款38
‑
48所述的阵列组件，其中，多个孔设置在相应的多个列中，阵列填充通道包括与流体源和歧管通道组件流体连通的进入通道，该歧管通道组件包括：
126.多个分支通道，沿相应的多行延伸，该多个分支通道分别与多个孔流体连通；以及
127.第一主通道，沿着多行的第一端延伸，多个分支通道从第一主通道延伸，阵列填充通道与第一主通道连通。
128.50.根据条款38
‑
49所述的阵列组件，其中，其中，歧管通道组件还包括与多个分支通道流体连通的第二主通道，该第二主通道沿多行的第二端延伸，真空端口与第二主通道连通，其中，每个孔通过至少两个不同的路径与真空端口和流体源流体连通。
129.51.根据条款38
‑
50所述的阵列组件，其中，歧管通道组件还包括分别从多个分支通道中的每一个延伸到多个孔的多个连接通道，多个连接通道分别与多个孔流体连通。
130.52.一种在执行分析方法的同时对反应容器原位抽真空的方法，该方法包括：
131.提供反应容器，该反应容器包括样本引入区、与样本引入区流体连通的至少一个第一反应区和与第一反应区流体连通的第二反应区，其中，第二反应区包括多个孔、与多个孔和真空端口流体连通的真空通道、在多个孔和第一反应区之间延伸和/或与多个孔和第一反应区流体连通的阵列填充通道、以及设置在第一反应区和第二反应区之间的可打开的密封件；
132.利用反应容器执行分析方法的至少一个步骤；
133.对多个孔抽局部真空，以使多个孔、真空通道和阵列填充通道的至少一部分处于相对于大气压的减小的压力下；
134.密封真空通道的一部分，使得多个孔和阵列填充通道的至少一部分保持在真空下，从而形成抽空的阵列；以及
135.通过打开设置在第一反应区和第二反应区之间的可打开的密封件将流体施加到抽空的阵列，使得流体经由阵列填充通道被吸入多个孔中。
136.53.根据条款52所述的方法，其中，分析方法的至少一个步骤包括：从环境压力包装中取出反应容器；将样本引入样本引入区中；将反应容器插入配置为用于执行分析方法并配置为抽局部真空以形成抽空的阵列的仪器中，在第一反应区中进行一个或多个反应，或准备将流体施加到抽空的阵列。
137.54.根据条款52或53所述的方法，其中，在第一反应区中进行一个或多个反应包括以下中的一个或多个：进行样本裂解以产生裂解物，从裂解物中分离裂解颗粒，将二氧化硅磁珠与裂解物混合，将在利用二氧化硅磁珠的核酸捕获后的残留裂解物移至废物腔，进行至少一次磁珠清洗，并将清洗液移至废物腔，从二氧化硅磁珠上洗脱核酸，进行第一单重或多重pcr反应，或稀释第一pcr反应的产物以准备在第二反应区的多个孔中进行第二pcr反应。
138.55.根据条款52
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54所述的方法，其中，反应容器还包括流体连接到样本引入区、第一反应区或第二反应区中的一个或多个的一个或多个试剂泡罩。
139.56.根据条款52
‑
55所述的方法，其中，一个或多个试剂泡罩中的至少一个包括干燥的试剂，并且该方法还包括对包括干燥的试剂的一个或多个试剂泡罩抽局部真空。
140.57.根据条款52
‑
56的方法，还包括将流体与干燥的试剂混合以形成第一混合物。
141.58.根据条款52
‑
57所述的方法，其中，一个或多个试剂泡罩包含用于样本制备、核酸回收、第一级pcr和第二级pcr的试剂。
142.59.一种系统，包括：
143.反应容器，包括样本引入区、与样本引入区流体连通的至少一个第一反应区和与第一反应区流体连通的第二反应区，其中，第二反应区包括多个孔、在多个孔和真空端口之间延伸和/或与多个孔和真空端口流体连通的真空通道、在多个孔和第一反应区之间延伸和/或与多个孔和第一反应区流体连通的阵列填充通道、以及设置在第一反应区和第二反应区之间的可打开的密封件；
144.被配置为使用反应容器执行分析方法的仪器，其中，该仪器包括真空系统，用于在执行分析方法的一个或多个步骤的同时在反应容器的一个或多个部分中抽局部真空。
145.60.根据条款59所述的系统，其中，被配置为具有对其抽吸的局部真空的反应容器的一个或多个部分基本上是干燥的，使得不针对水的局部压力而抽吸局部真空。
146.61.根据条款59或60所述的系统，其中，被配置为具有对其抽吸的局部真空的反应容器的一个或多个部分中的局部真空在大约2毫巴和大约150毫巴之间的范围内。
147.62.根据条款59
‑
61所述的系统，其中，被配置为具有对其抽吸的局部真空的反应容器的一个或多个部分包括多个孔、真空通道、和阵列填充通道的至少一部分。
148.63.根据条款59
‑
62所述的系统，其中，该仪器包括密封装置，该密封装置施加密封以保持对反应容器的一个或多个部分抽吸的局部真空。
149.64.根据条款59
‑
63所述的系统，其中，反应容器还包括流体连接到样本引入区、第一反应区或第二反应区中的一个或多个的一个或多个试剂泡罩。
150.65.根据条款59
‑
64所述的系统，其中，一个或多个试剂泡罩中的至少一个包括干燥的试剂，并且其中，被配置为具有对其抽吸的局部真空的反应容器的一个或多个部分包括包含该干燥的试剂的该一个或多个试剂泡罩。
151.66.根据条款59
‑
65所述的系统，其中，该仪器是pcr仪器，包括至少一个加热器，该加热器被定位和布置成用于热循环反应容器的至少一部分。
152.67.根据条款59
‑
66所述的系统，其中，该仪器包括至少一个加热器，该加热器被定位和布置为控制反应容器的至少一部分中的温度以进行等温反应。
153.68.根据条款59
‑
67所述的系统，其中，该仪器包括：至少一个加热器，被定位和布置成用于控制反应容器的至少一部分中的温度；一个或多个致动器，用于在反应容器中移动流体；以及一个或多个密封件，用于控制流体在反应容器的一个或多个部分中的移动。
154.提供本发明内容是为了以简化的形式介绍一些概念的选择，这些概念将在下面的具体实施方式中进一步描述。本发明内容不旨在识别所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于帮助确定所要求保护的主题的范围。
155.附加的特征和优点将在随后的描述中阐述，并且部分地将从描述中明显，或者可
以通过本文的教导的实施来获知。借助于所附权利要求中特别指出的仪器和组合，可以实现并获得发明的特征和优点。从以下描述和所附权利要求，本发明的这些和其他特征将变得更充分明显，或者可以通过如下所述的发明的实施来获知。
附图说明
156.图1示出了对于自包含pcr有用的柔性贮袋。
157.图2是与图1的贮袋一起使用的、包括图1的贮袋的仪器的分解透视图。
158.图3示出了以图1的贮袋对图2的仪器、包括图2的气囊组件的局部剖视图。
159.图4示出了在图2的仪器的一个说明性实施例中使用的马达。
160.图5a示出了柔性贮袋的另一实施例。
161.图5b示出了沿线bb的图5a的贮袋的一部分的截面图。
162.图5c示出了沿线cc的图5a的贮袋的一部分的截面图。
163.图6a示出了说明性的第二级阵列。
164.图6b是沿图6a的线bb示出的剖视图，示出了孔填充系统的一个实施例。
165.图6c是示出孔填充系统的不同实施例的替代实施例。
166.图7a示出了第二级阵列，其示出了使用时阵列抽空系统的一个实施例。
167.图7b是沿线bb的图7a的一部分的剖视图。
168.图8a是包括卡的阵列组件的一个说明性实施例的透视图。
169.图8b是图8a的阵列组件的一部分的详细视图。
170.图8c是在贮袋中包括卡层的阵列组件的另一个说明性实施例的俯视图。
171.图8d是贮袋的俯视图。
172.图9a是具有真空通道的第二级高密度阵列的实施例的分解透视图。
173.图9b是图9a的第二级高密度阵列的底视图，在第二级高密度阵列的构造期间示出。
174.图9c是沿cc线的图9a的一部分的剖视图。
175.图10a
‑
图10e示出了在第二级阵列的示例性孔中使内容物再水合并引发反应的方法。
176.图10f示出了在图10a
‑
图10e所示的方法中引发反应的替代方法。
177.图11a示意性地示出了一种仪器，该仪器被配置为在执行分析方法的一个或多个步骤期间或之后，对反应容器的一部分抽真空。
178.图11b示出了真空系统和被配置用于原位抽真空的图11a的反应容器的阵列的一部分。
179.图11c示出了真空系统和被配置用于原位抽真空图11a的反应容器的试剂泡罩。
180.图12a
‑
图12d示出了各种阵列孔和通道配置。
具体实施方式
181.下面参考附图描述示例实施例。在不背离本公开的精神和教导的情况下，许多不同的形式和实施例都是可能的，因此本公开不应被解释为限于本文阐述的示例实施例。相反，提供这些示例实施例以使得本公开将是透彻和完整的，并将本公开的范围传达给本领
域技术人员。在附图中，为了清楚起见，可能夸大了层和区域的尺寸和相对尺寸。在整个说明书中，相同的附图标记指代相同的元件。
182.除非另有定义，否则本文中使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。还将理解的是，诸如在常用字典中定义的那些术语应被解释为具有与其在本技术和相关技术的上下文中的含义一致的含义，并且除非本文明确定义，否则不应以理想化或过于正式的意义来解释它。本文在本发明的描述中使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在限制本发明。虽然可以在本公开的实践中使用与本文描述的那些类似或等同的许多方法和材料，但是本文仅描述了某些示例性的材料和方法。
183.本文提及的所有出版物、专利申请、专利或其他参考文献，其全部内容通过引用并入本文。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。
184.可以参考一个或多个示例性实施方式示出包括装置、系统、方法等的本公开的各个方面。如本文中所使用的，术语“示例性”和“说明性”是指“用作示例、实例或说明”，并且不必一定被解释为比本文公开的其他实施方式优选或有利。另外，对本公开或发明的“实施方式”或“实施方式”的引用包括对其一个或多个实施例的具体引用，反之亦然，并且旨在提供说明性示例而不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求而不是由以下描述指示。
185.将注意，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数对象，除非内容中另有明确规定。因此，例如，对“瓦片(tile)”的引用包括一个、两个或更多瓦片。类似地，除非内容和/或上下文另外明确规定，否则对多个指示物的引用应解释为包括单个指示物和/或多个指示物。因此，提及“瓦片(tiles)”不一定需要多个这样的瓦片。而是，将理解的是，独立于共轭；本文构思了一个或多个瓦片。
186.如在本技术中通篇所使用的，词语“可以”和“可能”以允许的意义(即，意味着有可能)而不是强制性的意义(即，必须)使用。另外，术语“包括”、“具有”、“涉及”、“包含”、“特征在于”以及其变型(例如，“包含”、“具有”、“涉及”、“包含”等)，包括权利要求在内的本文所用的类似术语应为包括性和/或开放式的，应具有与词语“包含”及其变型相同的含义，并且不说明性地排除其他未引用的要素或方法步骤。
187.如本文所使用的，方向性和/或任意术语，例如“顶部”、“底部”、“左”、“右”、“上”、“下”、“上部”、“下部”、“在内”、“在外”、“内侧”、“外面”、“内部”、“外部”、“近侧”、“远端”、“向前”、“相反”等仅用于表示相对方向和/或方位，并且可能不旨在限制本公开的范围，包括说明书、发明和/或权利要求。
188.将理解的是，当一个元件被称为“耦合”、“连接”或“响应”于另一元件或在另一元件“之上”时，其可以直接耦合、连接或响应于该另一元件或在该另一元件之上，或者，也可以存在中间元件。相反，当一个元件被称为“直接耦合”、“直接连接”或“直接响应”于另一元件或直接在该另一元件“之上”时，则不存在中间元件。
189.本文参照截面图描述本发明构思的示例实施例，该截面图是示例实施例的理想化实施例(和中间结构)的示意图。这样，例如由于制造技术和/或容限导致的图示形状的变化是可以预期的。因此，本发明构思的示例实施例不应被解释为限于本文所示的区域的特定形状，而应包括例如由制造引起的形状偏差。因此，图中所示的区域本质上是示意性的，并
且它们的形状并不旨在示出装置的区域的实际形状，也不旨在限制示例实施例的范围。
190.将理解，尽管在本文中可以使用术语“第一”、“第二”等来描述各种元件，但是这些元件不应受到这些术语的限制。这些术语仅用于区分一个元件和另一个元件。因此，在不脱离本实施例的教导的情况下，“第一”元件可以被称为“第二”元件。
191.还应理解，在不脱离本公开的范围的情况下，本文描述的各种实施方式可以与描述或公开的任何其他实施方式接合使用。因此，在不脱离本公开的范围的情况下，根据本公开的某些实施方式的产品、构件、元件、设备、装置、系统、方法、过程、组合物和/或试剂盒(kit)可以包括、并入或以其他方式包括在本文公开的其他实现方式(包括系统，方法，装置等)中描述的特性、特征、组件、构件、元件、步骤等。一些实施例或其方面可以被描述为替代的。然而，将理解，这样的替代方案可能并不总是相互排斥的。因此，术语“替代”、“替代地”等可以被“附加的”、“附加地”等代替。因此，对与一个实现有关的特定特征的引用不应被解释为仅限于该实现内的应用。
192.本文使用的标题仅用于组织目的，并不意味着用于限制说明书或权利要求的范围。为了便于理解，在可能的情况下使用了相同的附图标记来指定附图共有的相同元件。此外，在可能的情况下，在各个附图中使用了相似的元件编号。此外，特定元件的替代配置每个可以包括附加到元件编号的单独字母。
193.本文使用的术语“大约”是指大约、在其范围内、大致上或左右。当术语“大约”与数字范围结合使用时，它通过扩展在上述数值以上和以下的边界来修改该范围。通常，术语“大约”在本文中用于将数值在所述值之上和之下修改5％的变化。当表达这样的范围时，另一实施例包括从一个特定值和/或到另一特定值。类似地，当通过使用先行词“大约”将值表示为近似值时，将理解的是，特定值形成另一实施例。还将理解的是，每个范围的端点与另一个端点有关以及独立于另一个端点都是重要的。
194.如本文所使用的，词语“或”表示特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。
[0195]“样本”是指动物；动物的组织或器官；细胞(在受试者体内，直接取自受试者，或保持在培养物中或从培养的细胞系中取出的细胞)；细胞裂解物(或裂解物片段(lysate fraction))或细胞提取物；包含一个或多个源自细胞、细胞物质或病毒物质的分子(例如多肽或核酸)的溶液；或包含非天然存在的核酸的溶液，如本文所述化验的。样本还可以是任何体液或排泄物 (例如但不限于血液、尿液、粪便、唾液、泪液、胆汁或脑脊髓液)，其可能包含或可能不包含宿主或病原体细胞、细胞组分或核酸。样本还可以包括环境样本，例如但不限于土壤、水(淡水、废水等)、空气监测系统样本(例如，空气过滤介质中捕获的材料)、表面拭子和载体(例如，蚊子、壁虱、跳蚤等)。
[0196]
如本文所用，短语“核酸”是指天然存在的或合成的寡核苷酸或多核苷酸，无论是dna或rna还是dna
‑
rna杂合，单链或双链，有义或反义，能够通过沃森
‑
克里克(watson
‑
crick)碱基配对与互补核酸杂交。本发明的核酸还可以包括核苷酸类似物(例如，brdu)和非磷酸二酯核苷间键(例如，肽核酸(pna)或硫代二酯键)。特别地，核酸可包括但不限于dna、rna、 mrna、rrna、cdna、gdna、ssdna、dsdna或其任何组合。
[0197]“探针”、“引物”或“寡核苷酸”是指具有限定序列的单链核酸分子，其可以与包含互补序列的第二核酸分子(“靶标”)碱基配对。所得杂交体的稳定性取决于长度、gc含量和
发生的碱基配对的程度。碱基配对的程度受诸如探针和靶分子之间的互补程度和杂交条件的严格程度之类的参数影响。杂交严格性程度受诸如温度、盐浓度和诸如甲酰胺之类的有机分子浓度的参数影响，并通过本领域技术人员已知的方法来确定。探针、引物和寡核苷酸可以通过本领域技术人员公知的方法进行放射性、荧光或非放射性地可检测地标记。dsdna接合染料可用于检测dsdna。应当理解，“引物”具体地被配置为通过聚合酶延伸，而“探针”或“寡核苷酸”可以被或可以不被如此配置。
[0198]“dsdna接合染料”是指与单链dna接合时或在溶液中游离时相比，与双链dna接合时不同地发荧光的染料，通常更强地发荧光。虽然参考了 dsdna接合染料，但应理解的是本文可以使用任何合适的染料，在美国专利号7,387,887中描述了一些非限制性的示例性染料，该专利通过引用并入本文。其他信号产生物质可以用于检测核酸扩增和解链，如本领域中已知的示意性的酶、抗体等。
[0199]“特定杂交(specifically hybridizes)”是指探针、引物或寡核苷酸在高严格性条件下识别基本上互补的核酸(例如，样本核酸)并与其发生物理相互作用(即，碱基配对)，并且基本上不与其他核酸碱基配对。
[0200]“高严格性条件”通常是指在大约解链温度(tm)减去5℃(即比探针的tm低5
°
)下发生。在功能上，高严格性条件用于识别具有至少80％序列一致性的核酸序列。
[0201]
尽管pcr是本文示例中使用的扩增方法，但是应理解，使用引物的任何扩增方法都可能是合适的。此类合适的过程包括聚合酶链反应(pcr)；链置换扩增(sda)；基于核酸序列的扩增(nasba)；级联滚环扩增(crca)，环介导的dna等温扩增(lamp)；等温和嵌合引物引发的核酸扩增(ican)；基于靶标的解旋酶依赖性扩增(hda)；转录介导的扩增(tma)等。因此，当使用术语pcr时，应理解为包括其他替代扩增方法。对于没有离散循环的扩增方法，在本文所述的实施例中，在以周期、倍增时间或交叉点(cp)进行测量的情况下，可以使用反应时间，而在添加附加的pcr周期的情况下，可以添加额外的反应时间。可以理解的是，可能需要相应地调整协议。
[0202]
如本文所用，术语“交叉点”(cp)(或可选地，循环阈值(ct)、定量循环(cq)或本领域中使用的同义术语)是指获得高于对于给定的pcr产物(例如，目标或内部标准)的某个阈值的荧光信号所需的pcr的循环的数量，如实验确定的。每个反应升高到阈值以上的循环取决于pcr反应开始时存在的目标(即反应模板)的量。阈值通常可以设置在可以检测到产品的荧光信号高于背景荧光的点；然而，可以采用其他阈值。作为设置略微任意的阈值的替代方法，可以通过计算一阶、二阶或n阶导数具有最大值的反应点来确定cp，从而确定放大曲线的曲率最大的循环。在美国专利号6,303,305 中教导了一种说明性的衍生方法，其全部内容通过引用并入本文。然而，在哪里以及如何设置阈值通常不是很重要，只要对于被比较的所有反应使用相同的阈值即可。如本领域中已知的，也可以使用其他点，并且在本文讨论的任何方法中，任何这样的点可以代替cp、ct或cq。
[0203]
尽管本文的各种实例涉及人类靶标和人类病原体，但是这些实例仅是说明性的。本文所述的方法、试剂盒和装置可以用于检测和测序来自包括人类、兽医学、工业和环境的多种样本的多种核酸序列。
[0204]
本文公开的各种实施例使用自足的(self
‑
contained)核酸分析贮袋来示例性地在单个封闭系统中化验样本中各种生物物质(示例性地为抗原和核酸序列)的存在。这样的
系统，包括贮袋和与贮袋一起使用的仪器，在美国专利号8,394,608和8,895,295和美国专利申请号2014
‑
0283945中更详细地公开，其通过引用并入本文。但是，应理解，此类贮袋仅是示例性的，并且如本领域已知的，本文讨论的核酸制备和扩增反应可以使用多种核酸纯化和扩增系统在本领域已知的各种开放或封闭系统样本器皿中的任何一个中进行，包括96孔板、其他配置的板、阵列、转盘等。
[0205]
在本文使用术语“样本孔”、“扩增孔”、“扩增容器”等时，这些术语意在涵盖如在这些扩增系统中使用的孔、管和各种其他反应容器。在一实施例中，该贮袋用于化验多种病原体。示意性地，在封闭系统中，该贮袋可以包括一个或多个用作样本孔的泡罩。示意性地，可以在可选的一次性贮袋中执行各种步骤，包括核酸制备、初级大体积多重pcr、稀释初级扩增产物和二级pcr，最后进行可选的实时检测或扩增后分析，例如溶解
‑
曲线分析。此外，应当理解，尽管可以在本发明的贮袋中执行各种步骤，但是对于某些用途，可以省略一个或多个步骤，并且可以相应地改变贮袋的构造。
[0206]
如本文中所使用的，术语“使用时(point
‑
of
‑
use)”指的是就在系统使用之前或在系统使用的同时由系统在装置上或在方法中执行的步骤。例如，在“使用时”对化验装置的一个或多个腔室抽真空意味着在使用化验装置进行化验之前很短的时间内(例如，在一小时或更短时间内)抽真空或在使用化验装置进行化验的一个或多个步骤期间或之后原位进行抽真空。这与执行诸如在制造化验装置时抽吸适当的真空然后在适当的真空下储存该装置直到使用之前很短的时间的步骤相反。
[0207]
图1示出了可以在各种实施例中使用或可以针对各种实施例重新配置的说明性贮袋510。贮袋510类似于美国专利号8,895,295的图15，相同的组件编号相同。配件590设置有进入通道515a至515l，其也用作试剂贮存器或废物贮存器。说明性地，试剂可在配件590中冷冻干燥并在使用前再水合。具有各自通道514、538、543、552、553、562和565的泡罩522、544、546、 548、564和566与美国专利号8,895,295的图15的相同编号的泡罩相似。图 1的第二级反应区580与美国专利申请号8,895,295的第二级反应区相似，但是高密度阵列581的第二级孔582以稍微不同的图案布置。图1的高密度阵列581的更圆的图案消除了角落中的孔，并且可以导致第二级孔582的填充更均匀。如图所示，高密度阵列581设置有102个第二级孔582。贮袋510 适于在仪器(biofire diagnostics，llc，盐湖城，犹他州)中使用。然而，应当理解，贮袋实施例仅是示例性的。
[0208]
尽管可以使用其他容器，但是说明性地，贮袋510可以由两层柔性塑料膜或其他柔性材料形成，这些材料诸如是聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯 (pet)、聚碳酸酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、混合物、组合和可以通过本领域已知的诸如挤压、等离子体沉积和层压等任何方法制造的层。例如，每一层可以由层压在一起的单一类型或一种以上类型的一层或多层材料组成。也可以使用金属箔或具有铝层压的塑料。其他阻挡材料在本领域中是已知的，其可以密封在一起以形成泡罩和通道。如果使用塑料膜，则可以例如通过热密封将各层接合在一起。说明性地，该材料具有低核酸接合能力。
[0209]
对于采用荧光监测的实施例，在工作波长下在吸光度和自发荧光方面足够低的塑料膜是优选的。可以通过测试不同的塑料、不同的增塑剂和复合比例以及膜的不同厚度来识别这种材料。对于具有铝或其他箔层压的塑料，可以使要由荧光检测装置读取的贮袋的部分没有箔。例如，如果在贮袋510 的第二级反应区580的第二级孔582中监测荧光，则将使
在孔582处的一层或两层没有箔。在pcr的示例中，由厚度约为0.0048英寸(0.1219毫米) 的聚酯(mylar、dupont、wilmington de)和厚度为0.001
‑
0.003英寸(0.025
‑ꢀ
0.076毫米)的聚丙烯膜组成的膜层压板性能良好。说明性地，贮袋510可以由能够透射大约80％
‑
90％的入射光的透明(clear)材料制成。
[0210]
在说明性实施例中，通过在泡罩和通道上施加压力(例如气压)来使材料在泡罩之间移动。因此，在采用压力的实施例中，贮袋材料示例性地具有足够的柔性以允许压力具有期望的效果。术语“柔性”在本文中用于描述贮袋的材料的物理特性。术语“柔性”在本文中定义为通过本文所使用的压力水平可容易变形而不会破裂、破碎、开裂等。例如，薄的塑料片(例如saran tm
包装纸和袋)以及薄的金属箔(例如铝箔)是柔性的。然而，即使在采用气压的实施例中，仅泡罩和通道的某些区域需要是柔性的。此外，只要泡罩和通道易于变形，则仅泡罩和通道的一侧需要是柔性的。贮袋510的其他区域可以由刚性材料制成或可以用刚性材料增强。因此，应理解，当使用术语“柔性贮袋”或“柔性样本容器”等时，仅贮袋或样本容器的一部分需要是柔性的。
[0211]
示意性地，塑料膜可以用于贮袋510。可以研磨或以其他方式切割金属片，示意性地为铝或其他合适的材料，以形成具有凸起表面图案的模具(die)。当安装到气动压力机(例如，a
‑
5302
‑
pds，janesville tool inc.，milton wi) 中时，说明性地将该气动压力机调节为在195℃的工作温度处，该气动压力机就像印刷机一样工作，仅在模具接触膜的位置熔化塑料膜的密封表面。同样，可使用激光切割和焊接装置将用于贮袋510的塑料膜切割并焊接在一起。当形成贮袋510时，可以将诸如pcr引物(示例性地点(spot)到膜上并干燥)、抗原接合基质、磁珠和硅酸锆珠之类的各种组分密封在各种泡罩内。可以在密封之前将用于样本处理的试剂集中或分别点在膜上。在一个实施例中，将核苷酸三磷酸酯(ntp)与聚合酶和引物分开点到膜上，基本上消除了聚合酶的活性，直到反应可以被含水样本水合。如果含水样本在水合之前已被加热，这将创建对于真正的热启动pcr的条件，并减少或消除对昂贵的化学热启动组分的需求。在另一个实施例中，可以以粉末或片剂形式提供组分，并在最终密封之前将其放入泡罩中。
[0212]
贮袋510可以以类似于美国专利号8,895,295中描述的方式使用。在一个说明性实施例中，可以将包含待测样本(100μl)和裂解缓冲液(200μl) 的300μl混合物注入到进入通道515a附近的配件590中的注入口(未示出) 中，并且该样本混合物可以被吸入进入通道515a中。也可以将水注入到与进入通道515l相邻的配件590的第二注入口(未显示)中，并通过配件590中设置的通道(未显示)进行分配，从而将多达十一种不同的试剂水合，这十一种不同的试剂的每个先前以干的形式在入口通道515b至515l处提供。在美国专利申请号2014
‑
0283945中公开了用于注入样本和水合流体(例如，水或缓冲液)的说明性方法和装置，其全部内容通过引用的方式并入本文尽管应当理解，这些方法和装置仅是说明性的，其他将样本和水合流体引入贮袋 510的方法在本公开的范围内。这些试剂示例性地可以包括冻干pcr试剂、 dna提取试剂、洗涤溶液、免疫测定试剂或其他化学实体。说明性地，该试剂用于核酸提取、第一级多重pcr、稀释多重反应、以及第二级pcr试剂的制备以及对照反应。在图1所示的实施例中，所有需要注入的是在一个注入口中的样本溶液和在另一个注入口中的水。注入后，两个注入口可以密封。有关贮袋510和配件590的各种构造的更多信息，请参见已经通过引用并入的美国专利号8,895,295。
[0213]
注入之后，样本可以从注射通道515a经由通道514移动到裂解泡罩 522。裂解泡罩522设置有珠或颗粒534，例如，陶瓷珠或其他磨料，并且被配置为用于使用仪器内设置的旋转刀片或搅棒(paddle)通过冲击进行涡旋。通过在存在诸如硅酸锆(zs)珠534的裂解颗粒的情况下对样本进行摇动、涡旋、超声处理和类似处理来进行珠磨，是形成裂解物的有效方法。应当理解，如本文所用，诸如“裂解”和“裂解物”的术语不限于使细胞破裂，而是这些术语包括非细胞颗粒诸如病毒的破坏。
[0214]
图4示出了珠磨马达(bead beating motor)819，其包括可安装在图2 所示仪器800的支撑构件802的第一侧811上的刀片821。刀片可以延伸穿过槽(slot)804以接触贮袋510。然而，应理解，马达819可以安装在仪器800的其他结构上。在一个说明性实施例中，马达819是mabuchi rc
‑
280sa
‑ꢀ
2865dc马达(日本千叶)，安装在支撑构件802上。在一个示例性实施例中，马达以5,000至25,000rpm，更示例性地为10,000至20,000rpm，还更示例性地为约15,000至18,000rpm旋转。对于mabuchi马达，已发现7.2v 提供足够的rpm用于裂解。然而，应当理解，当刀片821撞击贮袋510时，实际速度可能会稍慢。可以使用其他电压和速度用于裂解，取决于所使用的马达和桨片。可选地，可将受控的少量空气提供到与裂解泡罩522相邻的气囊822中。在一些实施例中，已经发现，用一个或多个小体积的空气部分地填充相邻的气囊有助于在裂解过程期间定位和支撑裂解泡罩。替代地，可以使用其他结构，例如在裂解泡罩522周围的刚性或柔性垫圈或其他保持结构，来在裂解期间约束贮袋510。还应理解，马达819仅是示例性的，并且其他装置可以用于研磨、摇动或涡旋样本。在一些实施例中，除了机械裂解之外或代替机械裂解，可以使用化学物质或热量。
[0215]
一旦样本材料已被充分裂解，就将样本移至核酸提取区，例如通过通道 538、泡罩544和通道543，移至泡罩546，在此处样本与诸如涂有二氧化硅的磁珠533的核酸接合物质混合。可替代地，磁珠533可以被再水合，例如使用从进入通道515c
‑
515e之一提供的流体，然后通过通道543移至泡罩544，然后通过通道538到达泡罩522。允许将混合物培养(incubate)适当长的时间，例如约10秒至10分钟。位于仪器内靠近泡罩546的可伸缩磁体从溶液中捕获磁珠533，从而在泡罩546的内表面上形成团粒(pellet)。如果培养发生在泡罩522内，则溶液的多个部分可能需要移动到泡罩546进行捕获。然后将液体从泡罩546中移出，并通过泡罩544返回并进入泡罩522，该泡罩522现在用作废物容器。来自注入通道515c至515e中的一个或多个的一个或多个清洗缓冲液通过泡罩544和通道543提供给泡罩546。可选地，通过将磁珠从泡罩544和546经由通道543来回移动，使磁铁缩回并清洗磁珠 533。一旦清洗了磁珠533，通过激活磁体将磁珠533重新捕获在泡罩546中，然后将清洗溶液移至泡罩522。可以根据需要重复该过程，以从核酸接合磁珠533清洗裂解缓冲液和样本碎片。
[0216]
在清洗之后，存储在注入通道515f中的洗脱缓冲液被移动至泡罩548，并且磁体被缩回。溶液经由通道552在泡罩546和548之间循环，打碎泡罩546中的磁珠533的团粒，并使捕获的核酸从珠上解离并进入溶液。磁体再次被激活，捕获泡罩546中的磁珠533，洗脱的核酸溶液被移到泡罩548中。
[0217]
来自注入通道515g的第一级pcr预混液与泡罩548中的核酸样本混合。可选地，通过迫使混合物经由通道553在548和564之间，将混合物混合。在混合的几个循环后，溶液包含在泡罩564中，在其中提供第一级pcr 引物的团粒，每个靶标至少一组引物，并进行第一级多重pcr。如果存在rna 靶标，则可以在第一级多重pcr之前或同时执行rt步骤。在
仪器中的第一级多重pcr温度循环示例性地进行了15
‑
20个循环，尽管依据具体应用的要求可能需要其他水平的扩增。如本领域中已知的，第一级pcr预混液可以是各种预混液中的任何一种。在一个说明性示例中，第一级pcr预混液可以是通过引用并入本文的美国专利号9,932,634中公开的任何化学物质，以与pcr方案(protocol)一起使用，每个周期花费20秒或更短时间。
[0218]
在第一级pcr已经进行了所需的循环数量之后，可以稀释样本，例如，通过迫使大部分样本返回到泡罩548中，仅在泡罩564中保留少量，并从注入通道515i添加第二级pcr预混液。或者，稀释缓冲液可以从515i移至泡罩566，然后通过在泡罩564和566之间来回移动液体，与泡罩564中的扩增的样本混合。在需要时，可以使用来自注入通道515j和515k的稀释缓冲液重复几次稀释，或者可以保留注入通道515k，说明性地，用于测序或其他 pcr后分析，然后将来自注入通道515h的第二级pcr预混液添加到一些或全部的稀释的扩增样本。应当理解，可以通过以下调整稀释的水平：通过改变稀释步骤的数量或通过改变与稀释缓冲液或第二级pcr预混液混合之前丢弃的样本的百分比，该第二级pcr预混液包括用于扩增的组分，例如聚合酶、dntp和合适的缓冲液，尽管其他组分也可能是适合的，尤其是对于非 pcr扩增方法。如果需要的话，可以将样本和第二级pcr预混液的该混合物在泡罩564中预热，然后移至第二级孔582以进行第二级扩增。这样的预热可以消除第二级pcr混合物中对热启动组分(抗体、化学试剂或其他)的需要。
[0219]
说明性的第二级pcr预混液是不完整的，缺少引物对，并且102个第二级孔582中的每一个均预装有特定的pcr引物对。如果需要的话，第二级 pcr预混液可以缺少其他反应组分，并且这些组分也可以预装在第二级孔582中。每个引物对可以与第一级pcr引物对相似或相同，或者可以嵌套在第一级引物对内。样本从泡罩564到第二级孔582的移动完成了pcr反应混合物。一旦高密度阵列581被填充，各个第二级反应通过如本领域中已知的任何数量的手段被密封在其各自的第二级泡罩中。在没有交叉污染的情况下填充和密封高密度阵列581的说明性方法在美国专利号8,895,295中进行了讨论，该专利已通过引用并入本文。说明性地，高密度阵列581的孔582中的各种反应同时或单独地热循环，说明性地使用一个或多个珀耳帖(peltier) 装置，尽管本领域中已知其他用于热循环的方式。
[0220]
在某些实施例中，第二级pcr预混液包含dsdna接合染料 plus(biofire diagnostics，llc)以产生指示扩增的信号。然而，应理解，该染料仅是说明性的，并且可以使用其他信号，包括如本领域已知的其他dsdna接合染料和荧光、放射性、化学发光、酶促等方式标记的探针。可替代地，可以提供阵列581的孔582而没有信号，结果通过随后的处理来报告。
[0221]
当使用气压来移动贮袋510内的材料时，在一个实施例中，可以使用“气囊”。气囊组件810，其一部分在图2至图3中所示，包括容纳多个可膨胀囊822、844、846、848、864和866的囊板824，每个可膨胀囊示例性地可通过压缩气体源被单独充气。因为气囊组件810可以经受压缩气体并且被多次使用，所以气囊组件810可以由比贮袋更硬或更厚的材料制成。替代地，气囊822、844、846、848、864和866可以由与垫圈、密封件、阀和活塞紧固在一起的一系列板形成。其他布置也在本发明的范围内。可替代地，可以使用阵列或机械致动器和密封件来密封通道并引导液体在泡罩之间的移动。在wo 2018/022971中详细描述了可适配用于本文所述的仪器的机械密封件和致动器的系统，其全部内容通过引用并入本文。
[0222]
次级pcr反应的成功取决于多重第一级反应产生的模板。通常，pcr 使用高纯度的dna进行。诸如苯酚提取或商业dna提取试剂盒之类的方法提供高纯度的dna。通过贮袋510处理的样本可能需要进行调节以补偿纯度较低的制备。pcr可能被生物样本的组分所抑制，这是一个潜在的障碍。说明性地，可以使用可选的热启动pcr、较高浓度的taq聚合酶、mgcl2浓度的调整、引物浓度的调整以及佐剂(例如dmso、tmso或甘油)的添加以补偿较低的核酸纯度。尽管纯度问题可能与第一级扩增更相关，但可以理解的是，在第二级扩增中也可以提供类似的调节。
[0223]
当将贮袋510放置在仪器800内时，将气囊组件810向贮袋510的一个面按压，使得如果特定的气囊被充气，则压力将迫使液体从贮袋中的相应泡罩中流出。除了对应于贮袋510的许多泡罩的囊之外，气囊组件810还可以具有对应于贮袋510的各种通道的附加的气动致动器，例如囊或气动活塞。图2
‑
图3示出了对应于贮袋510的通道538、543、553和565的说明性的多个活塞或硬密封件838、843、852、853和865，以及最小化流入配件590的回流的密封件871、872、873和874。当激活时，硬密封件838、843、852、 853和865形成夹紧阀，以夹紧和关闭相应的通道。为了将液体限制在贮袋 510的特定泡罩中，在通向泡罩和从泡罩引出的通道上激活硬密封件，使得致动器用作夹紧阀以夹紧关闭的通道。说明性地，为了在不同的泡罩中混合两种体积的液体，密封连接通道的夹管阀致动器被激活，并且泡罩上的气动气囊被交替地加压，迫使液体来回通过连接泡罩的通道以混合其中的液体。夹管阀致动器可以具有各种形状和尺寸，并且可以被配置为一次夹紧一个以上的通道。尽管本文讨论了气动致动器，但应理解，构思了向贮袋提供压力的其他方式，包括各种机电致动器，例如线性步进马达、马达驱动的凸轮、由气动、液压或电磁力驱动的刚性桨叶、滚轮、摇臂，在某些情况下还包括翘起的弹簧。另外，除了施加垂直于通道轴线的压力之外，还有多种方法可逆地或不可逆地关闭通道。这些方法包括使贮袋在通道上扭结、热封、滚动致动器以及密封在通道中的各种物理阀，例如蝶阀和球阀。另外，可以在通道附近放置小型珀尔帖(peltier)装置或其他温度调节器，并将其设置在足以冻结流体的温度，从而有效地形成密封。而且，虽然图1的设计适用于具有定位在每个泡罩和通道上方的致动器元件的自动化仪器，但是还可以想到，致动器可以保持静止，并且贮袋510可以被转换，使得少量的致动器可以用于几个处理站点，包括样本破坏、核酸捕获、第一级pcr和第二级pcr以及用于贮袋510的其他应用的处理站点，例如免疫测定和免疫pcr。在贮袋 510在站点之间平移的构造中，作用在通道和泡罩上的滚轴可以被证明是特别有用的。因此，尽管在当前公开的实施例中使用气动致动器，但是当在本文中使用术语“气动致动器”时，应理解，取决于贮袋和仪器的构造，可以使用其他致动器和其他提供压力的方式。
[0224]
返回到图2，每个气动致动器通过阀899连接到压缩空气源895。虽然在图2中仅示出了几个软管878，但是应当理解，每个气动配件都通过软管 878连接到压缩气体源895。压缩气体源895可以是压缩机，或者可替代地，压缩气体源895可以是压缩气瓶，例如二氧化碳气瓶。如果需要便携性，则压缩气瓶特别有用。其他压缩气体源也在本发明的范围内。在通过引用并入本文的wo 2017/147085的图12
‑
图16的实施例中可以提供类似的气动控制，用于控制贮袋1400中的流体，或者可以设置其他致动器、伺服器等。
[0225]
仪器810的其他几个组件也连接到压缩气体源895。使用来自压缩气体源895经由软管878的气体来示例性地部署和收回安装在支撑组件802的第二侧814上的磁体850，尽管
移动磁体850的其他方法在本领域中是已知的。磁体850位于支撑构件802中的凹部851中。可以理解的是，凹部851可以是穿过支撑构件802的通路，使得磁体850可以接触贮袋510的泡罩546。然而，取决于支撑构件802的材料，应当理解的是，凹部851不必一直延伸穿过支撑构件802，只要在部署磁体850时，磁体850足够靠近以在泡罩546 处提供足够的磁场，并且当磁体850完全缩回时，磁体850不会明显影响泡罩546中存在的任何磁珠533即可。虽然参考了缩回磁体850，但是应当理解，可以使用电磁体，并且可以通过控制流过电磁体的电流来激活和停用电磁体。因此，尽管本说明书讨论了撤回或缩回磁体，但是应当理解，这些术语足够宽泛以并入其他撤回磁场的方式。应当理解，气动连接可以是气动软管或气动空气歧管，因此减少了所需的软管或阀的数量。应当理解，在通过引用并入本文的wo 2017/147085的图12
‑
图16的实施例中可以使用类似的磁体和用于激活磁体的方法。
[0226]
气动活塞阵列869的各个气动活塞868也通过软管878连接到压缩气体源895。虽然仅示出了两个软管878将气动活塞868连接到压缩气体源895，但是应该理解，每个气动活塞868均连接到压缩气体源895。示出了十二个气动活塞868。
[0227]
一对温度控制元件安装在支撑件802的第二侧814上。如本文所用，术语“温度控制元件”是指向样本添加热量或从样本去除热量的装置。温度控制元件的说明性示例包括但不限于加热器、冷却器、珀耳帖装置、电阻加热器、感应加热器、电磁加热器、薄膜加热器、印刷元件加热器、正温度系数加热器及其组合。温度控制元件可包括多个加热器、冷却器、珀耳帖等。在一方面，给定的温度控制元件可包括多于一种类型的加热器或冷却器。例如，温度控制元件的说明性示例可以包括珀尔帖装置，其中单独的电阻加热器施加到该珀尔帖装置的顶面和/或底面。尽管在整个说明书中使用了术语“加热器”，但是应当理解，可以使用其他温度控制元件来调节样本的温度。
[0228]
如上所述，第一级加热器886可以定位成加热和冷却用于第一级pcr 的泡罩564的内容物。如图2所示，第二级加热器888可以定位成加热和冷却贮袋510的阵列581的第二级泡罩582的内容物，用于第二级pcr。然而，应当理解，这些加热器也可以用于其他加热目的，并且可以包括其他加热器，以适合特定的应用。
[0229]
如上所述，虽然在两个或多个温度之间热循环的珀耳帖装置对于pcr 是有效的，但在一些实施例中可能需要将加热器保持在恒定温度。说明性地，这可以通过消除超过转变样本温度所需的时间的转变加热器温度所需的时间来减少运行时间。而且，这种布置可以提高系统的电效率，因为仅需要热循环较小的样本和样本器皿，而不需要热循环大得多(更多热质量)的珀耳帖装置。例如，仪器可包括多个加热器(即两个或更多个)，其处于被设置在例如用于相对于贮袋定位以实现热循环的退火、伸长、变性的温度下。对于许多应用，两个加热器可以足够。在各个实施例中，相对于加热器，加热器可以被移动，贮袋可以被移动，或者流体可以被移动，以完成热循环。说明性地，加热器可以线性地放置，以圆形布置等。上面已经参照第一级pcr讨论了合适的加热器的类型。
[0230]
当需要荧光检测时，可以设置光学阵列890。如图2所示，光学阵列 890包括光源898和摄像头896，该光源898示例性为过滤的led光源、过滤的白光或激光照射。摄像头896示例性地具有多个光电探测器，每个光电探测器对应于贮袋510中的第二级孔582。可替代地，摄像头896可以拍摄包含所有第二级孔582的图像，并且该图像可以被划分为与每个第二级孔582 相对应的单独的场。取决于配置，光学阵列890可以是固定的，或者光学阵列890
可以放置在附接到一个或多个马达的移动器(mover)上，并且被移动以获得来自每个单独的第二级孔582的信号。可以理解，其他布置也是可能的。通过引用并入本文的wo 2017/147085的图18所示的第二级加热器的实施例在与图2所示的相比，在贮袋510的相对侧上提供加热器。这种取向仅是说明性的，并且可以由仪器内的空间约束来确定。假设第二级反应区580 由光学透明材料提供，则光电探测器和加热器可以位于阵列581的任一侧。
[0231]
如图所示，计算机894控制压缩空气源895的阀899，因此控制仪器 800的所有气动。此外，在其他实施例中，仪器中的许多气动系统可以用机械致动器、压力施加装置等代替。计算机894还控制加热器886和888以及光学阵列890。这些组件中的每一个电连接，例如经由电缆891电连接，尽管其他物理或无线连接也在本发明的范围内。应当理解，计算机894可以被容纳在仪器800内或者可以在仪器800的外部。此外，计算机894可以包括控制一些或全部组件的内置电路板，并且还可以包括诸如台式机或笔记本pc 之类的外部计算机，以接收和显示来自光学阵列的数据。可以提供接口，说明性地为键盘接口，其包括用于输入信息和诸如温度、循环时间等变量的键。说明性地，还提供了显示器892。显示器892可以是例如led、lcd或其他这样的显示器。
[0232]
其他现有技术的仪器教导了在密封的柔性容器内的pcr。参见例如美国专利号6,645,758、6,780,617和9,586,208，其通过引用并入本文。但是，将细胞裂解物包括在密封的pcr器皿中可以改善易使用性和安全性，特别是如果要测试的样本可能含有生物危害时。在本文所示的实施例中，来自细胞裂解的废物以及来自所有其他步骤的废物保留在密封贮袋中。另外，应当理解，贮袋中的内容物可以被移除以进行进一步测试。
[0233]
图2示出了可以与贮袋510一起使用的说明性仪器800。仪器800包括支撑构件802，该支撑构件可以形成壳体的壁或安装在壳体内。仪器800还可以包括第二支撑构件(未示出)，该第二支撑构件可选地相对于支撑构件 802可移动，以允许贮袋510的插入和抽出。说明性地，一旦贮袋510已经被插入到仪器800中，盖子就可以覆盖贮袋510。在另一个实施例中，两个支撑构件可以被固定，而贮袋510通过其他机械手段或通过气压保持在适当位置。
[0234]
在说明性示例中，加热器886和888安装在支撑构件802上。然而，应理解，该布置仅是说明性的，并且其他布置也是可能的。说明性的加热器包括本领域已知的珀耳帖(peltier)和其他块加热器(block heater)、电阻加热器、电磁加热器和薄膜加热器，以使泡罩864和第二级反应区580的内容物热循环。带有囊体822、844、846、848、864、866的气囊板810、硬密封件838、843、852、853和密封件871、872、873、874形成了气囊组件808，其可以示例性地安装在可移动的支撑结构上，该结构可朝贮袋移动510，使得气动致动器被放置成与贮袋510接触。当将贮袋510插入仪器800中并且可移动支撑组件朝着支撑组件802移动时，贮袋510的各个泡罩处于与气囊组件810的各个气囊和组件808的各个密封件相邻的位置，使得气动致动器的激活可迫使液体从贮袋510的一个或多个泡罩中流出，或者可与贮袋510 的一个或多个通道形成夹管阀。在图3中更详细地示出了贮袋510的泡罩和通道与组件808的气囊和密封件之间的关系。
[0235]
图5a示出了贮袋5000(在本文中也称为“科学卡”)的另一个说明性实施例，该贮袋5000可用于各种实施例中，或者可以被重新配置用于本文所述的各种实施例，以进行pcr、微生物检测或其他各种检测。贮袋5000可以被配置用于在wo 2017/147085中描述的仪器中或者在各种其他仪器中使用，该专利申请以引用方式并入本文。图5a的说明性贮袋5000包
括多个区域或泡罩，其中可以进行样本制备、核酸扩增和检测。说明性贮袋5000可以包括可将包含待扩增和分析的核酸的样本引入贮袋5000的样本制备泡罩 5005、第一级pcr泡罩5010、用于在第二级pcr之前测量来自第一级pcr 的一部分产物的测体积稀释孔5015、以及包括多个单独的反应孔5082的第二级pcr阵列5081。测体积孔5015也可以与泡罩5020和5025流体耦合，其中，可以引入用于第二级pcr的试剂并将其与稀释孔5015的内容物混合。在一个示例中，可以通过在泡罩5020和5025之间重复地将测体积孔5015的内容物与用于第二级pcr的试剂混合来制备用于第二级pcr的样本。第二级阵列5081也可以流体连通到废物容器5035。或者，泡罩5010可用于样本制备和第一级pcr，而泡罩5005可以用作废物容器，以用于例如样本制备废物。
[0236]
泡罩5005、5010、5020和5025、稀释孔5015和第二级阵列5081可以通过通道5050a
‑
5050e流体连通。样本和试剂可通过进入通道5040a
‑
5040f和进入端口5045a
‑
5045f进入贮袋5000。可选地，贮袋5000可以装配有形式类似于图1的配件590的装置，用于将样本和试剂引入到贮袋5000中。此外，贮袋5000可以包括在配件或类似的结构中的脱水(例如，冷冻干燥)的试剂，其可以在使用贮袋之前用合适的水合缓冲剂进行水合。在又一个实施例中，可以在贮袋5000中提供液体试剂。
[0237]
在一个实施例中，贮袋5000可以由密封在一起以形成贮袋5000的多个材料层(相同材料的层或不同类型的材料的层)制成。在图5b和图5c中，沿线bb和cc示出剖视图，其示出了可用于制造贮袋5000的不同部分的材料层。在图5b所示的贮袋5000的一个区域中，说明性贮袋5000可以由接合到第二层膜5098的第一层膜5090制成。层5090和5098可以通过本领域已知的任何常规方式接合在一起，例如但不限于加热和加压、声波焊接或激光焊接。图5b还示出可通过在膜层5090和5098之间留出开放区域并利用沿该开放的密封边距来限定该开放区域的边界，在贮袋5000中形成泡罩或通道(例如，通道5040c)，在图5a和5b中以5084示出了示例性焊缝。图 5c示出了贮袋5000的另一区域，其包括可用于形成第二级阵列5081的孔的厚卡材料。说明性贮袋5000的该区域可以由第一膜层5090、压敏黏合剂层 5092、卡层5094、第二压敏黏合剂层5096和第二膜层5098制成。在一个说明性示例中，第二级阵列5081的孔5082可以形成在卡层5094中。在对于如图5b所示的通过在膜层(例如，膜层5090和5098)之间留出开放空间来形成通道(例如，通道5040c)和泡罩(例如，泡罩5005)的替代方案中，卡层5094可以延伸，并且可以通过在卡层5094中形成适当的切口来形成泡罩和/或通道。同样地，通道5050a
‑
5050e和进入通道5040a
‑
5040f可以通过在第一压敏黏合剂层5092或第二压敏黏合剂层5096任一个中形成适当切口来形成。将意识到其他配置也是可能的。应当理解，虽然说明性的泡罩区域是柔性的，但是卡层5094可选地可以是较不柔性的并且可以是刚性的，并且仍然是柔性样本容器的一部分。因此，应当理解，“柔性贮袋”仅需要在某些区域中是柔性的。替代地或另外，可以通过在膜层5090之上或在膜层5098 之下添加另一膜层、管材或刚性层并且将各层焊接在一起而在各层之间留下开放的泡罩区域和通道来形成在泡罩区域之间的流动通道。
[0238]
虽然可以使用其他材料，但是说明性地，贮袋5000的膜层可以由类似于图1中描述的贮袋510的柔性塑料膜或其他柔性材料形成。例如，贮袋 5000可以由诸如但不限于诸如聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚碳酸酯、聚丙烯(pp)、聚甲基丙烯酸甲酯、其组合、混合物及其层压层的材料制成，这些材料可以通过本领域已知的任何方法制备，包括挤压
(extrusion)、等离子沉积和层压。相似的材料(例如，聚碳酸酯)可以用于卡层5094。也可以使用其他材料，包括金属箔或具有铝层压的塑料。可以密封在一起以形成泡罩和通道的其他阻隔材料在本领域中是已知的。如果使用塑料膜，则可以通过例如热封或激光焊接将各层接合在一起。说明性地，该材料具有低核酸接合能力。如果使用荧光检测，则可以在贮袋的适当区域中(例如，在第二级阵列附近)使用光学透明的材料。
[0239]
除了或代替膜材料的前述示例，可以在用于形成贮袋5000或本文描述的任何其他贮袋的一个或多个层中使用阻隔膜。例如，对于某些应用而言，阻隔膜可能是期望的，因为它们具有可以低于常规的塑料膜的低的水蒸气和 /或氧气透过率。例如，典型的阻隔膜的水蒸气透过率(wvtr)在约0.01 g/m2/24hrs至约3g/m2/24hrs的范围内，优选地在约0.05g/m2/24hrs至约2 g/m2/24hrs的范围内(例如，不大于约1g/m2/24hrs)，并且氧气透过速率在约0.01cc/m2/24hrs至约2cc/m2/24hrs的范围内，优选地在约0.05cc/m2/24 hrs至2cc/m2/24hrs的范围内例如，不大于约1cc/m2/24hrs)。阻隔膜的示例包括但不限于可以通过金属(例如，铝或另一种金属)的气相沉积来金属化或可以溅射涂覆有氧化物(例如，al2o3或sio
x
)或另一种化学组分的膜。金属化膜的常见示例是镀铝的聚酯膜，其是金属涂覆的双轴取向pet (bopet)。在一些应用中，可以将涂覆的阻隔膜与聚乙烯、pp或类似的热塑性塑料的层层压在一起，这提供密封性并提高抗穿透性。与常规的塑料膜一样，用于制造贮袋的阻隔膜层可以接合在一起，例如通过热密封。说明性地，该材料具有低核酸接合和低蛋白质接合能力。可以密封在一起以形成泡罩和通道的其他阻隔材料在本领域中是已知的。
[0240]
贮袋5000可以以类似于上述贮袋510的方式和/或以类似于美国专利号8,895,295中描述的方式来使用。再次参考图5a，描述了用于填充贮袋、制备样本、执行第一级pcr和执行第二级pcr的两个替代序列。在第一种示例方法中，样本制备和第一级pcr可在单独的泡罩中进行。在本文中，这被称为“三区方法”，三个区是样本制备、第一级pcr和第二级pcr。在描述“三区方法”和“两区方法”的以下示例中，将认识到，贮袋5000是贮袋的一个实施例，并且其他贮袋构造可以适用于三区和/或二区方法。
[0241]
在第一步骤中，样本通过填充通道5040a注入泡罩5005中。在一实施例中，可使用本文其他地方详细描述的擦拭系统(wiping system)在泡罩5005 中裂解细胞、病毒等。可选地，可以使用替代的裂解装置例如但不限于超声处理装置或珠磨器(bead beater)或通过化学裂解来完成细胞裂解。可选地，可通过用本文中其他地方详细描述的加热器组件的一个或多个加热器元件加热样本(例如，加热至约70
‑
90℃)来辅助裂解。裂解后，可以用热电冷却器元件(即peltier元件)将样本冷却至约0℃至约20℃的范围内的温度(例如，约10
‑
15℃)以通过例如二氧化硅涂层的磁珠帮助核酸回收。其他冷却器元件包括但不限于流体或气体热交换元件、风扇冷却的散热器、热管、冷凝单元等。
[0242]
磁珠可经由填充通道5040a或5040b注入泡罩5005中，用于在从裂解物中回收核酸时使用。或者，可以在裂解之前将要裂解的细胞、裂解珠、磁珠、裂解缓冲液等一起或顺序注入泡罩5005中。说明性地，可以将磁珠和裂解物冷混合(例如，在约0
‑
10℃的范围内，说明性地，通过调节加热器之一的温度)。一旦磁珠和裂解物已经充分混合足够的时间，就可以用说明性地在仪器中提供的磁体将磁珠收集在泡罩5005中，并且可以将用过的裂解物通过通道5040b传送到废液中。然后可以通过填充通道5040a注入清洗缓冲液。清洗缓冲液和磁珠可以冷混合(例如，在约0
‑
10℃的范围内)。可以再次收集磁珠，并且可以通过通道5040b将
用过的清洗缓冲液冲到废液。清洗循环可以至少再重复一次。清洗洗后，可以通过填充通道5040a将洗脱缓冲液(可选地包括第一级pcr引物)注入泡罩5005中。说明性地，在一个或多个加热器的控制下，可选地可以将洗脱缓冲液(加上第一级pcr引物)和磁珠热混合(例如，在约70
‑
90℃下)。
[0243]
对于第一级pcr，可以经由填充通道5040c将pcr预混液(例如，聚合酶、dntp和本领域已知的其他扩增组分)注入泡罩5010中。在从磁珠引入洗脱液之前，可以将pcr预混液加热(例如，加热至约57℃)。在泡罩 5005中，可以再次聚集磁珠，并且洗脱液可以经由通道5050a被传送到泡罩 5010。
[0244]
在一个实施例中，说明性地，在两个加热器的温度控制下，第一级pcr 可以在泡罩5010中通过wo 2017/147085中示出的擦拭器系统(wiper system) 的旋转移动来进行，该专利申请已经通过引用并入本文。可替换地，可以通过平移加热器组件或贮袋5000来执行第一级pcr热循环，以使泡罩5010可以在一个加热器的控制下，然后在包括处于两个不同温度(例如，在退火温度和在变性温度)的两个不同加热器的加热器组件的另一个加热器的控制下。在第一级pcr期间，可以封闭进入泡罩5010和离开泡罩5010的通道，例如，利用类似于参照图2和图3描述的那些的密封件。在一些实施例中，可以通过采用体积减小方案来加速贮袋中的第一级pcr。例如，体积减小方案可以包括在泡罩5010中以初始体积(例如，～100μl)执行几个(例如1
‑
10 个)pcr循环，净化泡罩5010的大约一半的体积，再执行几个(例如5
‑
10 个)pcr循环，并再次净化泡罩5010的大约一半的体积。体积减小可以减少pcr反应的循环时间，因为较小体积的液体具有较小的热质量，并且与较大体积的液体相比，热循环可以更快。
[0245]
在足够数量的第一级pcr循环(例如20
‑
30个循环)之后，可以通过通道5050b将少量的第一级pcr样本(例如～1
‑
5μl)传送到稀释孔5015；通道5050c
‑
5050e可以关闭。可以通过将第二级pcr预混液经由通道5040e 注入到泡罩5025中来制备用于第二级pcr的样本。可以关闭密封通道5050b 和5050e，可以打开密封件5050c和5050d，并且可以通过在泡罩5025和5020 与孔5015之间混合来将孔5015中的样本与预混液混合以稀释第一级pcr产物用于第二级pcr。可以在混合之前或混合期间加热泡罩5020和5025以及孔5015，以用于物理“热启动”。然后打开通道5050e，并可以关闭密封件 5050c和5050d，以便可以将第二级pcr混合物转移到第二级pcr阵列5081 中。在另一个实施例中，贮袋5000可以包括一个或多个附加的稀释孔，以及在孔5015和泡罩5025和5020的下游和阵列5081上游的成组的混合泡罩。例如，在一些具有浓缩的第一级pcr引物或具有高度浓缩的产物的实施例中，可能希望将第一级的引物和产物稀释至比用一个稀释孔所能达到的程度更大的程度。阵列5081中用于第二级pcr的热循环可以说明性地通过来回平移加热器组件来实现，如本文其他地方所详细描述的。
[0246]
在第二示例性方法中，样本制备和第一级pcr可以在同一泡罩中进行。在本文中，这被称为“两区方法”，其中，样本制备和第一级pcr在一个区域中进行，第二级pcr在第二区域中进行。在第一步骤中，可以经由填充通道5040c将样本注入到泡罩5010中。在一个实施例中，使用本文中其他地方详细描述的擦拭系统在泡罩5010中裂解细胞、病毒等。可选地，可以使用替代的裂解装置例如但不限于超声处理装置或珠磨器或通过化学裂解来完成细胞裂解。可通过利用本文中其他地方详细描述的加热器组件的一个或多个加热器元件加热
样本至升高的温度(例如，加热至约70
‑
90℃)来辅助裂解。裂解后，可选地，可以用热电冷却器元件(即peltier元件)将样本冷却至降低的温度(例如，低于环境温度的温度，例如但不限于～0
‑
10℃)。
[0247]
磁珠可以经由填充通道5040c注入泡罩5010中，以便从裂解物中恢复核酸。在一个实施例中，可在裂解后将磁珠和裂解物冷混合(例如，在约0
‑ꢀ
10℃范围内的温度下)。在另一个实施例中，可以将待裂解的细胞、裂解缓冲液、磁珠和可选的裂解珠的组合一起注入到泡罩5010中，使得裂解和核酸捕获可以基本上同时发生。一旦磁珠和裂解物已经充分混合足够的时间，就可以用磁体将磁珠收集在泡罩5010中，并且用过的裂解物可以通过通道 5050a传送到泡罩5005(即，在此示例中为废液泡罩)中。然后可以将清洗缓冲液通过填充通道5040c注入泡罩5010中。可选地，清洗缓冲液和磁珠可以冷混合(例如，在约0
‑
10℃范围内的温度下)。再次收集磁珠，并且用过的清洗缓冲液可以冲至泡罩5005。如果需要，可以将清洗循环重复一次或多次。清洗后，可通过将洗脱缓冲液(加上第一级pcr引物)注入泡罩5010 中，从微珠上洗脱核酸(可选地，在例如大约70
‑
90℃的升高的温度下)。可以将磁珠和任何剩余的裂解珠(如果存在的话)收集到泡罩5010的上游半部分中，并通过通道5050a传送至废泡罩5005。
[0248]
对于第一级pcr，如果可能需要真正的热启动，则可以设置擦拭器系统，并且可以将第一级pcr预混液注入通道5040d中并可选地保持在升高的温度(例如约57℃)下。第一级pcr预混液可以与泡罩5010中的引物和模板混合，并且第一级pcr可以如上所述进行。
[0249]
在第一级pcr之后，方案可进行至第二级pcr，如上文针对“三区方法”所述。
[0250]
当需要荧光检测时，可以设置光学阵列。光学阵列可以包括光源和摄像头，该光源示例性为过滤的led光源，过滤的白光或照明。摄像头示例性地具有多个光电探测器，每个光电探测器对应于贮袋5000的阵列5081中的第二级孔。可替代地，摄像头可以拍摄包含所有第二级孔的图像，并且该图像可以被划分为与每个第二级孔相对应的单独的场。取决于配置，光学阵列可以是固定的，或者光学阵列可以放置在附接到一个或多个马达的移动器上，并移动以获得来自每个单独的第二级孔的信号。应该理解，其他布置也是可能的。
[0251]
现在参考图6a，更详细地示出了可用于第二级pcr的孔的阵列6000。阵列6000可以是独立的阵列，也可以作为较大阵列中的一组孔包括在其中，例如阵列5081的一部分。阵列6000包括单独的孔6002、6004、6006、6008 和6010。孔6002、6004、6006、6008和6010中的每一个可以用于第二级 pcr反应。在所示的实施例中，孔6002、6004、6006、6008和6010流体地连通至填充通道6012；在填充通道6012中形成孔6014、6016、6018、6020 和6022，用于填充每个孔。在一个实施例中，第二级阵列的孔(例如，孔6002、 6004、6006、6008和6010)可以处于局部真空下，以便于将流体从填充通道 6012抽入孔中。在一个实施例中，孔6002、6004、6006、6008和6010可以与填充通道6012以及与彼此分开地密封，并且通过在6024所示的区域内或周围施加密封(例如，热密封)或压力，可以最小化或防止孔之间的流体泄漏或混合，这可以称为“串扰”。因此，可以在6024处所示的区域中施加单个密封以将孔6002、6004、6006、6008和6010从填充通道6012以及在彼此间关闭，以防止孔与孔串扰。阵列6000的横截面结构和用于填充孔的流动路径在下面的图6b和图6c中示出。尽管阵列6000被示出为具有与填充通道 6012相关联的五个孔6002、6004、6006、6008和6010，但将认识到，更多或更少的反应孔可以与填充通道相关联，并且多个填充通道可以流体连通到多组的孔。可以组合
使用多个阵列6000以创建更大的阵列。
[0252]
现在参照图6b和6c，图6b是沿图6a的线b—b示出的截面图，图 6c是示出了孔填充系统的不同实施例的替代实施例。在图6b和图6c的横截面中示出的阵列6000的一部分由类似于图5c所示的层制成；应当注意，阵列6000可以作为图5a中所示的贮袋5000的一部分而不是阵列5081被包括。图6b中所示的孔6006b可以由第一膜层6030b、第二膜层6032b、黏合剂层6034b、可在其中限定孔6006b的卡层6036b、第二黏合剂层6038b和第三(外部)膜层6040b限定。图6c所示的孔6006c非常相似，并且可以由第一膜层6030c、第二膜层6032c、黏合剂层6034c、可以在其中形成孔6006c 的卡层6036c、第二黏合剂层6038c和第三(外部)膜层6040c限定。6b和 6c之间的关键区别在于孔6006b和6006c如何在周围层中形成以及如何填充孔。
[0253]
在图6b中，可以通过在第一膜层6030b和第二膜层6032b之间留有液体可以流动的间隙来形成填充通道6012b。图6c示出了通过在第一膜层 6030c与第二膜层6032c之间留有间隙而形成的类似的填充通道6012c。填充通道可以由焊接线6026b或6026c限定，该焊接线6026b或6026c将第一膜层和第二膜层围绕阵列密封在一起。在图6a中的焊接区域6026处示出了可以如何应用这些焊接的示例，该焊接区域6026包括限定填充通道6012和孔周围的空间的外部焊接6026a和内部焊接6026b。在图6b中，可以通过在第二膜层6032b和第一黏合剂层6034b中形成选择性的切口来形成填充孔 6018b。在图6c中，可以通过在第二膜层6032c中形成与第一黏合剂层6034c 中的对应切口相邻的选择性切口来形成填充孔6018c。
[0254]
在图6b中，可以通过在卡层6036b中形成切口6042b和在第二黏合剂层6038b中形成切口6044b来形成在孔6006b周围和上方流动以填充孔的孔填充通道，尽管其他形成这些通道的方法是可能的。例如，图6b的孔填充通道的设计可以帮助抑制孔之间的串扰，因为流动路径是回旋的。同样，因为填充通道6012b和填充孔6018b形成在两个膜层6030b和6032b之间，所以可以通过以下方式来密封填充孔6018b和通向孔6006b的入径(access)：说明性地利用热密封装置或通过压力，说明性地通过气囊，其在与图6a的 6024相邻的区域中或向着阵列6000的全部或部分而膨胀。在图6c中，孔填充通道6018c直接流入孔6006c，并且可以通过在第一黏合剂层6034c中形成切口6046c来形成，该切口6046c将注入孔6018c流体连通到孔6006c。可以预期，图6c的填充设计通常也会抑制孔之间的串扰。然而，图6c的设计可以示例性地利用热密封装置密封，这可以提供比单独的压力更好的密封。
[0255]
在一些实施例中，第二级阵列的孔可以处于至少局部真空下，以便于利用第二级pcr的流体填充孔。通常，这意味着从制造时直到使用时打开样本容器周围的包装之前，将贮袋存储在局部真空下。在一个说明性示例中，图7a和7b示出了第二级阵列的实施例，其可以用作真空存储的替代，同时仍然允许第二级阵列中的可靠的孔填充。如将在下面详细讨论的那样，图7a和 7b示意性地示出了包括真空通道的阵列，该真空通道可以示例性地形成在液体填充通道中，该液体填充通道允许在阵列上原位抽局部真空。
[0256]
图7a和图7b示出了第二级阵列11000的另一实施例，其可以被填充而无需具有在局部真空下制造和存储的贮袋。第二级阵列11000类似于图6a 所示的第二级阵列6000。部分地由焊接线11026限定的第二级阵列11000包括第二级孔11002、11004、11006、11008和11010，每个可以配置有独特的第二级引物对，并可以利用用于第二级pcr的组分(例如，来自第一级pcr 的稀释产物、聚合酶、dntp等)来填充，并可以被热循环以用于第二级分析，如
本文其他地方详细描述的。第二级孔可从填充通道11012填充，填充通道 11012与填充孔11014、11016、11028、11020和11022以及流体通孔11052a
‑ꢀ
11052e流体连通，流体通孔11052a
‑
11052e与每个第二级孔相关联。说明性的真空通道11050与每个填充孔、通孔和第二级孔一体形成在填充通道中并且流体连通。真空通道11050又与端口11051流体连通，该端口11051可以放置在远离阵列的贮袋的一部分上。在一个实施例中，端口11051可以包括孔11051a，该孔11051a提供向该真空通道的流体入径。说明性地，孔11051a 可以形成在层11030或层11032中。真空通道11050可以说明性地用于在第二级孔上原位抽局部真空(例如，在贮袋运行期间通过仪器中的真空泵)，从而该贮袋不需要在真空下制造或存储。在一个实施例中，真空通道11050 可以说明性地连接至贮袋上的远程真空枢纽(hub)，该远程真空枢纽可连接至真空源。
[0257]
现在参考图7b，示出了填充通道11012和真空通道11050的横截面。在所示的实施例中，填充通道11012形成为两个膜层11030和11032之间的开放空间，两个膜层11030和11032在11026处在其边缘上接合在一起(例如，激光焊接)。说明性地，真空通道11050可以形成为层11030或11032 之一中的子通道。在所示的实施例中，真空通道11050具有拱形形状，其设计成保持通道11012打开并将填充孔、通孔和第二级孔经由真空通道11050 和端口11051连接至真空源。在没有真空通道11050的情况下，当在通道上抽真空时通道11012可能趋于塌陷或“亲吻式”关闭，并妨碍孔的抽空。在一实施例中，真空通道11050可利用热成形固定装置(例如，适当形状的热“凹陷”线(
‘
debossing’wire))形成为一层中的凹入导管。在其他实施例中，真空通道11050可以通过激光蚀刻、x线摄影(xurography)等形成。如图 7b所示，作为热形成通道的示例的真空通道11050具有拱形形状，该弧形形状支撑塑料并保持通道打开，从而真空可以将空气抽出第二级孔。尽管示出了拱形形状，但是应当理解，本文可以使用具有其他形状的通道，这些通道用于将填充通道保持在打开位置。尽管如此，可以通过例如在真空通道11050 上方、说明性地在端口11051附近并且远离阵列孔施加热密封将层11030和 11032彼此接合来密封真空通道11050。
[0258]
在一个实施例中，可以在第二级阵列(或被配置为使得对其在原位抽真空的另一反应容器的一部分)上原位抽至少1
‑
150毫巴(例如，2
‑
10毫巴，或更优选地2
‑
5毫巴)的真空达10
‑
120秒(例如，在被配置为在反应容器的一个或多个部分上抽真空并在反应容器中进行反应的仪器中，或者就在将反应容器插入仪器中用于运行分析方法之前)。在抽真空之后，真空通道可以被密封(例如，热密封)并且真空可以在端口11051处释放，这使阵列的孔处于局部真空下。对具有与上述真空通道相似的真空通道的原型阵列进行的实验表明，原位抽真空与在真空下制造和储存贮袋一样有效。
[0259]
本公开的一些实施例可以包括阵列组件，该阵列组件包括以阵列布置的多个孔、与多个孔流体连通的整体形成的(例如，模制的)通道系统，以及与通道系统流体连通的整体形成的(例如，模制的)真空端口。通道系统还可具有与真空端口分开的整体形成的流体开口。在一些实施例中，具有可打开的密封件(例如，具有易碎的密封件、可剥离的密封件或本领域中已知的其他密封件)的流体贮存器或源可以定位为与阵列组件相邻。在一些实施例中，可以通过在真空端口处抽真空来将真空施加到阵列组件；在抽空阵列组件时，流体源和阵列组件之间的可打开的密封件通常可以保持关闭。通过打开将流体源与阵列组件分隔开的密封件，流体样本可以被真空抽吸通过通道系统并进入多个孔中。
[0260]
图8a描绘了根据本公开的实施例的说明性阵列组件8000，其可以用作本文讨论的任何贮袋或卡或其他此类实施例中的一部分。如图8a所示，阵列组件8000包括卡或卡层8002，其具有布置在阵列8001中的多个孔8004。如图所示，例如，参照图8c和图8d，可以将卡8002设置在两个或更多个膜层之间的密封的反应容器中。说明性卡8002包括第一(下)表面8016、与第一表面8016相对的第二(上)表面8018以及在其之间延伸的周界边缘 8020。卡8002可以是任何合适的尺寸，包括厚度、长度、宽度等。例如，卡 8002可以具有约0.2
‑
0.3mm的厚度，并且孔的尺寸可以确定为使得卡的厚度和孔的直径产生0.20
‑
0.5μl、说明性地为0.3μl的孔。如图8a所示，说明性卡8002具有矩形形状，具有可选的圆角。然而，在其他实施例中，卡8002 可以具有任何合适的形状。孔8004可以成行设置，如图8a所示，以圆形或六边形布置而设置，如图1和图6a所示，或以其他布置进行设置。应当理解，术语“阵列”包括孔的任何这种布置。
[0261]
孔8004可以包括延伸穿过卡8002(例如，从第一表面8016到第二表面8018)的孔或孔径，或由该孔或孔径形成或限定。在替代实施例中，孔或开口可以仅延伸部分地穿过卡8002。因此，在一些实施例中，孔8004可以包括卡8002或其第二表面8018中的凹部或凹陷，或者由该凹部或凹陷形成或限定。形成孔8004的凹部或凹陷可具有在卡8002(在第一表面8016和第二表面8018之间)的厚度内(或小于该厚度)的任何合适的深度。如图8a 所示，孔8004具有圆形或圆柱形构造。然而，在替代实施例中，孔8004可以具有其他形状或配置，其中一些在图12a
‑
12d中示出。
[0262]
如上所述，阵列8001可以具有任何合适的配置。如在图8a的说明性示例中所描绘的，阵列8001包括布置在多行8022中的多个孔8004。说明性地，孔8004a、8004b和8004c在孔8004的第一行8022a中。孔8004的第二行8022b与孔8004的第一行8022a相邻。孔8004的第三行8022c与第二行 8022b相邻，与第一行8022a相对。孔8004的附加的行8022可以与第一行 8022a、第二行8022b和/或第三行8022c相邻、对准(平行)和/或设置在第一行8022a、第二行8022b和/或第三行8022c之间或与其相对。因此，孔8004 的示例性行8022以网格或网格状配置布置(例如，每行8022的孔8004与另一行8022的孔8004对准或基本对准)。
[0263]
如图8a所示，孔8004的阵列8001包括十行8022的十个孔8004。但是，在替代实施例中，阵列8001可具有任何合适数量的行8022，例如大于 100行、1至100行、2至80行、3至75行、4至60行、5至50行、6至40 行、7至20行、8至12行，或任何合适的行数，或介于两者之间的行数范围。在一些实施例中，阵列8001可具有至少1行、2行、3行、4行、5行、 6行、8行、10行、12行、16行、24行、32行、48行、64行或96行。
[0264]
在一些实施例中，行8022可具有任何合适数量的孔8004，例如，大于 100个孔、1至100个孔、2至80个孔、3至75个孔、4至60个孔、5至50 个孔、6至40个孔、7至20个孔、8至12个孔，或任何合适数量的孔，或介于两者之间的孔数范围。在一些实施例中，行8022可具有至少1个孔、2 个孔、3个孔、4个孔、5个孔、6个孔、8个孔、10个孔、12个孔、16个孔、24个孔、32个孔、48个孔、64个孔或96个孔。在至少一个实施例中，阵列8001可具有至少一行8022的多个孔8004、多行8022的至少一个孔 8004或多行8022的多个孔8004。
[0265]
阵列组件8000还包括与多个孔8002流体连通的通道系统8006，在卡 8002的第一侧8012中具有流体进入开口8010，在卡8002的第二侧8014中具有真空端口8008。因此，如上所述，流体开口8010可以与真空端口8008 分开。在所示的实施例中，真空端口8008设置在
孔8004中与流体开口8010 相对的一侧。然而，应当理解，该取向仅是说明性的，其他配置也是可能的。如图8c
‑
d所示，应当理解的是，阵列组件8000可以被合并到贮袋或科学卡中，其中，流体开口8010与其他反应区流体连通。
[0266]
如图8a所示，真空端口8008包括卡8002中的孔8008a。孔8008a穿过卡8002从第一表面8016延伸到第二表面8018。类似于孔8004，在替代实施例中，孔8008a可以仅部分地延伸穿过卡8002。因此，在一些实施例中，孔8008a可以包括在卡8002或其第二表面8018中的凹部或凹陷，或由该凹部或凹陷形成或限定。形成孔8008a的凹部或凹陷可具有在卡8002(在第一表面8016和第二表面8018之间)的厚度内(或小于该厚度)的任何合适的深度。如图8a所示，孔8008a具有圆形或圆柱形的构造。然而，可替代地，孔8008a可以具有另一种形状或构造。在替代实施例中，真空端口8008可包括通道系统8006的端部或其他部分。
[0267]
如图8a所示，通道系统8006包括与流体进入通道8034流体连通的歧管通道组件8024。歧管通道组件8024包括流体连接至流体进入通道8034的第一主通道8026、流体连接至真空端口8008的第二主通道8028、以及在第一主通道8026和第二主通道8028之间延伸的多个分支通道8030。每个分支通道8030沿着孔8004的一个或多行8022延伸。说明性地，第一分支通道 8030a沿着第一行8022a延伸，第二分支通道8030b沿着第二行8022b延伸，第三分支通道8030c沿着第三行8022c延伸，依此类推。多个连接通道8032 从每个分支通道8030延伸到每一行8022中的相应孔8004。说明性地，每个连接通道8032从特定行8022中的一个孔8004延伸到分支通道8030，该分支通道8030沿着该特定行8022延伸。说明性地，特定行8022中的每个孔 8004与分支通道8030流体连通，该分支通道8030借助于相应的连接通道 8032沿着该特定行8022延伸。
[0268]
图8b是卡8002在孔8004a、连接通道8032和分支通道8030a处的详细视图。如图8b所示，连接通道8032和分支通道8030a(以及实际上通道系统8006的所有)可以包括在卡8002或其第二表面8018中的凹部或凹陷，或者由该凹部或凹陷形成或限定。形成通道系统8006的凹部或凹陷或其一个或多个组件可以具有在卡8002(在第一表面8016和第二表面8018之间) 的厚度内(或小于该厚度)的任何合适的深度。如图8a所示，通道系统8006 具有正方形的配置。然而，在替代实施例中，通道系统8006可以具有其他形状或配置。在一些实施例中，通道系统8006的某些组件的深度可以大于或小于通道系统8006的其他组件的深度。但是，如图8a所示，通道系统8006的所有组件具有相同的深度，并且孔8004具有更大的深度。
[0269]
现在参照图12a
‑
12d，示出了阵列中的孔的各种孔填充路径的示例。图8a
‑
8c示出了“回旋”阵列孔填充路径的一个示例，其包括孔8004、阵列流动通道8030和直的孔填充通道8032作为孔填充路径。图12a至图12d示出了没有孔填充通道8032那么直的孔填充路径的示例。图12a
‑
12d中的每个示例都包括孔1200a
‑
1200d和阵列流动通道1230a
‑
1230d。图12a示出了通向孔1204a的螺旋通道1232a的实施例。图12b示出了通向孔1204b的折返通道1232b。图12c示出了通道1232c，其包括通向孔1204c的螺旋部分 1208c和折返部分1210c。图12d示出了具有通向孔1204d的螺旋形折返部分1208d和平行的折返部分1210d的通道1232d。当放置在贮袋中时，图8a
‑ꢀ
8c和图12a
‑
12d中所示的孔和通道将在顶部和底部上用至少有一层密封。因此，进入孔的唯一流动路径是通过流动通道和孔通道。尽管一些路径比其他路径更“回旋”，但流动通道和孔通道的组合通常将各孔彼此隔离，并在孔被填充时将
各孔之间的混合(即串扰)最小化。前述示例仅是回旋的孔填充路径的说明性示例，并且将意识到可以使用其他孔填充路径。
[0270]
再次参考图8a，说明性通道系统8006还包括从流体开口8010延伸到第一主通道8026的流体进入通道8034。如图8a所示，流体开口8010可以设置在卡8002的周边边缘8020和/或第二上表面8018中。流体进入通道 8034可以被配置为引入流体或允许流体进入通道系统8006或其歧管通道组件8024。例如，如本文进一步所述，可以将卡8002密封在贮袋中或两层膜之间(例如，参见图8c和图8d)。因此，在一些实施例中，进入通道8034 可用于将液体样本从贮袋流体转移到阵列8001或其孔8004中。在一些实施例中，流体进入通道8034可以与流体源流体连通(例如，参见图8c和8d)。在至少一个实施例中，进入通道8034通过膜贮袋中的泡罩(例如，参见图1 的贮袋510的泡罩566)与流体源流体连通。可选的流体通道(例如，参见图1的通道565)可以在进入通道8034和流体源之间延伸。本文还构思了本领域已知的其他合适的流体源。
[0271]
通道系统8006还包括从真空端口8008延伸到第二主通道8028的真空端口通道8036。因此，每个孔8004与连接通道8032流体连通，该连接通道 8032与分支通道8030流体连通，该分支通道8030与第一主通道8026和第二主通道8028流体连通。第一主通道8026与流体进入通道8034流体连通，该流体进入通道8034与流体开口8010流体连通。因此，每个孔8004与流体开口8010(借助于通道系统8006)从至少两个方向((i)直接通过第一主通道8026、其自身的分支通道8030和其自身的连接通道8032，或者(ii) 间接地通过第一主通道8026、来自不同行的连接通道8032、第二主通道8028、其自身的分支通道8030和其自身的连接通道8032)流体连通。具有在两个或更多个主通道之间延伸的多个连接通道的这种平行布置允许在所有孔上抽真空并填充所有孔，即使其中一个通道被阻塞。第二主通道8028与端口通道 8036流体连通，端口通道8036与真空端口8008流体连通。因此，每个孔 8004与真空端口8008流体连通(借助于通道系统8006)。应当理解，这种布置是说明性的，并且许多替代布置是可能的。
[0272]
卡8002还可以具有一个或多个可选的对准指示器8038。如图8a所示，可选的对准指示器8038包括延伸到卡层8002中或穿过卡层8002的一个或多个表面的开口或孔。其他可选的对准指示器8038包括设置在卡层8002的一个或多个表面上的凹部(或凹陷)或标记(例如，印刷图案或图像)。
[0273]
在一些实施例中，卡8002的一个或多个特征或组件(例如，孔8004、通道系统8006的部件、端口孔8008a、对准指示器8038等)可以在卡8002 的制造期间形成，说明性地在卡8002的注模过程中形成。可选地，可以通过去除卡8002的材料来形成卡8002的一个或多个特征或组件。
[0274]
图8c描绘了阵列组件8000a的说明性实施例。阵列组件8000a包括布置在贮袋8040中的卡(或卡层)8002。贮袋8040可以包括第一层和第二层或由第一层和第二层形成。说明性的卡层8002设置(例如，夹在)在第一膜层8042和第二膜层8044之间。在一些实施例中，膜层8042和8044可以接合到卡层8002的顶表面8016和底表面8018。膜层8042和8044也可以选择性地彼此接合，以在膜层之间形成例如流体通道和泡罩。因此，本公开的一些实施例涉及一种阵列组件8000a，其包括具有形成于其中的多个孔8004的卡层8002、接合至卡层8002的第一侧或表面8016的第一膜层8042、和/或接合到卡层8002的第二侧面或表面8018的第二
膜层8044。尽管在该实施例和其他实施例中使用了膜层，但是应当理解，可以使用与阵列组件8000a的应用相一致的其他材料。
[0275]
如图8d所示，贮袋8040可以预先形成(例如，在一些实施例中，在其中放置卡8002之前)。说明性地，第一膜层8042和第二膜层8044(的一部分)可以诸如通过热成型(例如，激光焊接或热焊接)、通过热轧(例如，通过在制造期间通过在热辊之间滚动各层来将第一膜层8042和第二膜层 8044部分地接合在一起)、或通过黏合剂(例如，温敏黏合剂、压敏黏合剂等)接合在一起。例如，贮袋8040包括第一接合部分8056a、第二接合部分 8056b、第三接合部分8056c。接合部分8056a、8056b和8056c可以至少部分地限制或形成流体贮存器(或泡罩)8046、与泡罩8046流体连通的流体通道 8048、以及与流体通道8048流体连通的口袋8050。在一些实施例中，虽然贮袋8040的接合部分8056a、8056b和8056c或其第一膜层8042和第二膜层 8044可以(永久地)接合在一起(例如，通过热焊接或压敏黏合剂)，泡罩 8046、流体通道8048和口袋8050可以不接合，或者可打开地(即，可逆地) 接合在一起。在一些实施例中，未接合部分可以由一个或多个接合线或焊接线8052限定。
[0276]
示意性地，第二膜层8044可以被放置在第一膜层8042的顶部上以形成堆叠或叠层。然后可以例如通过热成型(例如，热焊接)或通过黏合剂(例如，温敏黏合剂、压敏黏合剂)将覆盖膜层或堆叠的一个或多个部分在接合部分8056a、8056b和8056c处接合在一起。例如，带有接合部分8056a、 8056b和8056c的图案的一个或多个加热的压力板或其他选择性接合构件可用于通过向叠层的一侧或多侧施加热量和力(例如压力)，从叠层膜层8042 和8044形成贮袋8040。
[0277]
示意性地，如以上参考贮袋510所讨论的，膜层8042和8044可以由塑料或可以被软化和/或(部分地)熔化的其他材料形成，，使得其层或表面被接合(例如，热成型或热焊接)在一起。例如，第一膜层8042和第二膜层 8044可以包括具有相似的熔化温度(tm)、玻璃化转变温度(tg)等的一种或多种材料或由该一种或多种材料形成。说明性地，第一膜层8042和第二膜层8044可以包括一种或多种聚合物(例如，塑料)或其他材料，包括其组合或共混物，或由该一种或多种聚合物或其他材料形成。因此，第一膜层8042 和第二膜层8044的堆叠或叠层可以被加热到一种或多种材料(例如，具有最高tm或tg的材料)的至少tm或tg，使得其层或表面变得接合(例如，热焊接)在一起(例如，通过对加热或熔化的叠层施加力(例如，压力))。
[0278]
在一个或多个替代实施例中，可以将带有接合部分8056a、8056b和 8056c的图案的黏合剂层设置在堆叠或叠层中的膜层8042和8044之间。说明性地，黏合剂层可以是或包括压敏黏合剂(psa)。带有接合部分8056a、 8056b和8056c的图案的一个或多个压力板或其他选择性接合构件可用于通过向叠层的一侧或多侧施加力(例如，压力)从堆叠膜层8042和8044形成贮袋8040。或者，温敏黏合剂或本领域已知的其他黏合剂可以用于形成贮袋 8040。
[0279]
如图8d进一步描绘的，口袋8050可以具有未接合的开口端或开口 8054(例如，分别在接合部分8056b和8056c的接合线8052之间)和一个或多个可选的对准指示器8038a。可选的对准指示器8038a可包括穿过膜层8042 和8044中的一个或多个的开口或孔。可选地，可选的对准指示器8038a可以包括设置在一个或多个膜层8042和8044上的标记(例如印刷图案或图像)。在一些实施例中，贮袋8040或其膜层8042和8044中的一个或多个可包括穿孔
8008b。
[0280]
现在回到图8c，并继续参考图8d，可以将卡层8002通过开口8054插入贮袋8050中。卡层8002的可选对准指示器8038可以与第一膜层8042和 /或第二膜层8044的可选对准指示器8038a对准，从而指示口袋8050内的卡层8002的正确对准和/或位置。
[0281]
膜层8042和8044可以例如通过热成型或热焊接接合到插入的卡层 8002。说明性地，一个或多个加热的压力板或其他接合构件可用于将膜层 8042和8044接合到卡层8002。在一些实施例中，加热的压力板可具有基本平坦和/或均匀的接合表面。或者，加热的压力板可具有承载卡层8002或其组件的图案的接合表面。
[0282]
还将意识到，可以(还或可替代地)将带有卡层8002或其组件(参见图8a)的图案的一个或多个黏合剂层设置在表面8016和8018中的一个或多个上，或者膜层8042和8044的相应表面上。例如，如图5c所示，可以通过第一黏合剂层(5096)将卡层(5094)接合到下膜层(5098)上，通过第二黏合剂层(5092)将其接合到上膜层(5090)。类似地，返回图8c，可以借助于第一黏合剂层(未示出)将卡层8002的第一(下)表面8016接合到第一膜层8042。同样地，可以借助于第二黏合剂层(未示出)将卡层8002 的第二(上)表面8018接合到第二膜层8044。第一黏合剂层和/或第二黏合剂层可以是或包括一种或多种压敏黏合剂、温敏黏合剂或如本领域已知和/或本文所述的其他黏合剂。
[0283]
然后，可以以类似于上述方式的方式形成第四接合部分8056d，从而以封闭结构密封开口8054，在闭合端8054a处指示。因此，卡层8002可被(或变得)接合到贮袋8040或其膜层8042和8044，并且被密封在口袋8050内。在一些实施例中，可以在密封贮袋8040内的卡层8002的一侧或多侧设置未接合的口袋部分8050a。如图8c所示，例如，未接合的口袋部分8050a围绕密封贮袋8040内部的卡层8002。未接合的口袋部分8050a可以由接合部分 8056a、8056b、8056c和8056d的接合线(例如，焊接线)8052来限定。类似地，流体通道8048和贮存器(或泡罩)8046可以由接合部分8056a的接合线8052限定。
[0284]
在替代实施例中，可以形成阵列组件8000a，其中，卡层8002设置在未接合片8042和8044之间。说明性地，设置在第一膜层8042和第二膜层 8044之间的卡层8002的叠层或堆叠可以如上所述接合和/或与贮袋8040的图案或其接合线8052接合。例如，第一膜层8042和第二膜层8044以及卡层8002可以包括具有相似的熔化温度(tm)、玻璃化转变温度(tg)等的一种或多种(相应的)材料，或由该一种或多种(相应的)材料形成。说明性地，第一膜层8042和第二膜层8044以及卡层8002可以包括一种或多种聚合物(例如，塑料)或其他材料，包括其组合或共混物，或由该一种或多种聚合物或其他材料形成。在优选的实施例中，第一膜层8042和第二膜层 8044以及卡层8002可以包括聚丙烯或其混合物，或由聚丙烯或其混合物形成。然而，将认识到，这些层也可以由本领域已知的其他材料形成。
[0285]
设置在第一膜层8042和第二膜层8044之间的卡层8002的叠层或堆叠可以被加热到一种或多种材料(例如，具有最高tm或tg的材料)的至少 tm或tg。力(例如，压力)也可以施加到叠层，使得其层或表面变得接合 (例如，热焊接)在一起。替代地，如前所述，一个或多个黏合剂层(例如，带有卡层8002的图案和/或贮袋8040的接合线8052)可以设置在卡层8002 与第一膜层8042和第二膜层8044中的一个或多个之间，使得卡层8002借助于黏合剂层变为接合到第一膜层8042和/或第二膜层8044。
[0286]
如图8c中进一步示出的，可以将流体或液体(样本)8062设置在流体贮存器(或泡
罩)8046中。在所示的实施例中，在将卡层8002插入到口袋 8050中之前，流体8062可以被设置(例如，注入)到泡罩8046中。在其他实施例中，例如在相应附图中所描绘的那些(例如，参见图1和图3)，一个或多个附加流体通道可以连接至流体贮存器(或泡罩)和/或与该流体贮存器(或泡罩)流体连通。因此，应当理解，一个或多个附加的流体通道8048 可以从泡罩8046延伸，使得流体8062可以在形成贮袋8040之后被引入泡罩8046中。
[0287]
可打开的密封件也可以形成在贮袋8040中，例如在流体通道8048的区域8060中。如前所述，可打开的密封件可以是或包括易碎的或可打开的密封件(例如，可剥离的密封件)，该易碎的或可打开的密封件是通过膜层8042 和8044之间的静电、触觉或其他吸引力形成的，而不是通过热成型或黏合剂接合而形成的。可打开的密封件可以被配置为将流体8062保持在泡罩8046 内(例如，使得流体8062不会无意和/或过早地置于口袋8050中)。
[0288]
阵列组件8000a或其贮袋8040可包括至少一个开口或穿孔8008b。说明性地，可在贮袋8040或其膜层8042和8044的制造期间在膜层8042和 8044中的一个或多个中形成穿孔8008b。可替换地，可以在说明性分析方法期间(在阵列组件8000a中)形成穿孔8008b。例如，在真空端口8008处施加真空之前，可通过分析装置(未示出)的穿孔元件形成穿孔8008b。说明性地，穿孔8008b可与卡层8002的孔8008a基本对准。在一些实施例中，穿孔 8008b和孔8008a可形成真空端口8008。换句话说，在一些实施例中，真空端口8008可包括穿孔8008b和孔8008a。
[0289]
参考图8a和图8b，通过(可打开地)密封通道系统8006(例如，在流体开口8010处或其附近，例如在相邻流体通道8048中的区域8060处，说明性地利用在形成流体通道8048的膜层8042和8044之间压力密封件或可打开的密封件(例如，易碎的密封件或可剥离的密封件))，可以通过借助于真空装置例如活塞泵(未显示)在真空端口8008处施加真空来抽空阵列组件8000、8000a。区域8060处的密封件允许施加的真空抽空端口通道8036、第二主通道8028、每个分支通道8030、第一主通道8026、流体进入通道8034、每个连接通道8032和阵列8001的每个孔8004。在此上下文中，通道系统 8006包括或构成真空通道。说明性地，由于在(例如，用流体样本8062)填充阵列组件8000、8000a之前对通道系统施加真空，所以流体样本(或两步 pcr系统中的第一级扩增)未被引入真空装置中，从而最小化或防止污染与真空装置的连通。
[0290]
在抽空阵列组件8000并且维持施加的真空的情况下(例如，例如通过密封端口通道8036的区域8064处的真空端口8008，说明性地，通过压力和 /或热密封)，可以打开区域8060处的密封，将流体吸入阵列组件8000中 (即，通过流体开口8010、通过第一主通道8026、通过分支通道8030、通过连接通道8032、并进入阵列8001及其孔8004中)。通过在区域8064处密封端口通道8036，流体也被吸入第二主通道8028和端口通道8036的一部分(直到密封件)。在这种情况下，通道系统8006包括或构成阵列填充通道。因此，通道系统8006包括或构成阵列填充通道(或通道组件)以及真空通道 (或通道组件)。
[0291]
在所示的实施例中，可以通过密封连接通道8032之间的分支通道8030 将每个孔8004与所有其他孔8004隔离。在至少一个实施例中，多个密封件可以在一个或多个(例如，所有)连接通道8032之间跨过一个或多个(例如，所有)分支通道8030延伸。由于特定行8022中的每个孔8004通过特定的连接通道8032与相邻的分支通道8030连通，所以跨过连接通道8032之间的分支通道8030(例如，垂直于分支通道8030的长度和孔8004的行8022) 的密封
基本上减少或消除了孔8004之间的串扰。
[0292]
通过使用(歧管型)通道系统8006作为真空通道和阵列填充通道两者，卡8002可以保持相对较小。然而，将理解的是，在一些实施例中，阵列组件 8000可以包括真空通道和单独的阵列填充通道。例如，在替代实施例中，阵列组件8000可以包括双歧管构造，其中分支通道8030不与第一主通道8026 和第二主通道8028两者流体连通。而是，第一组分支(填充)通道8030可以从第一主通道8026延伸，第二组分支(真空)通道8030可以从第二主通道8028延伸。相应的连接通道8032可以从每个分支通道8030延伸到相应的孔8004。第一连接通道8032可以将特定的孔8004流体地连接到孔8004 的第一侧上的相邻的分支真空通道8030，第二连接通道8032可以将该特定的孔8004流体地连接到孔8004的第二侧上的相邻的分支填充通道8030。
[0293]
如上所述，真空端口8008不需要设置在孔8004的与流体开口8010相对的一侧。例如，真空端口8008可以设置在孔8004的与流体开口8010相同或相邻的侧面上。说明性地，真空端口8008和流体开口8010可以设置在孔8004的该相同或相邻的侧面的相对端上。真空端口8008甚至可以邻近流体开口8010设置。例如，在替代实施例中，通道系统8006或其歧管通道组件8024可以仅具有一个主通道8026。说明性地，端口通道8036可以从主通道8026延伸，从而真空端口8008或其孔8008a可以与主通道8026流体连通。在这种配置下，与进入通道8034流体连通的流体通道仍可以是可打开地密封(例如，与流体开口8010相邻)，并且仍通过真空端口8008施加真空罐。
[0294]
图9a和图9b示出了使用阻隔层的第二级9580的说明性实施例。夹在贮袋9510的第一层9518和第二层9519之间的是具有孔9582的高密度阵列9581。如图9b中最佳所示，具有穿孔9586的穿孔层9585设置在高密度阵列9581的一侧上以用作物理屏障以最小化在填充阵列9581时孔9582之间的串扰，第二层9587设置在高密度阵列9581的相对侧上以形成孔9582的底部。在所示的实施例中，第二级阵列9580被制造成具有接合到第一层9518 的穿孔层9585。在层9518中，例如通过以下方式形成特征：将选择的区域接合并且将特征压印到膜层9518中以形成流体流动通道9053和同时的真空通道9050，以允许原位(即在使用时)在阵列上抽真空，作为在真空下制造和存储阵列的替代。说明性地，层9518包括通过将层9518接合(例如，通过激光焊接)到层9585而形成的流体填充通道9053。由激光焊接线9052限定的流体填充通道9053被形成为与层9585中的每个穿透孔9586流体连通。真空通道9050与流体填充通道9053同时并形成在其中，并且还与层9585中的每个穿透孔9586流体连通。在一个实施例中，可以通过用热线等使膜层 9518的膜成形以将通道压入膜中来加热形成真空通道9050。说明性地，穿孔层9585和第一层9518在9026处围绕它们的边缘彼此接合(例如焊接)。穿孔层9585例如通过黏合剂层和/或热密封接合到高密度阵列层9581，第一层 9518在平行于穿孔层孔9586的列并在这些列之间的几条焊接线9052处接合 (例如，激光焊接)到穿孔层9585，以限定填充通道9053。流体填充通道 9053、穿孔层9585和开口9586以及阵列孔9582可以经由流体通道开口9565 与上游流体孔流体连通。
[0295]
图9c示出了阵列9580的各层沿线c
‑
c的截面。虽然以分解图示出了图9a，但是图9c示出了贮袋膜和阵列层、真空通道9050和流体流动通道 9053的关系。第二级扩增区9580的“堆叠”包括第一贮袋膜层9518(即，贮袋的第一外层)、穿孔层9585，阵列9581、第二层9587(即，阵列背层) 和第二贮袋膜层9519(即，第二外部贮袋膜层)。图9c的横截面示出了一个
穿孔9586和一个孔9582，以及它们如何与真空通道9050、流体流动通道 9053以及焊接处9052和9026相关。虽然为了简单和清晰，示出了一个穿孔 9586和一个孔9582，但是可以从图9a和图9c中看到，真空通道9050和流体流动通道9053流体地连接到第二级扩增区9580的所有穿孔9586和孔 9582。
[0296]
在所示的实施例中，流体流动通道9053形成为在焊接处9052和9026 处接合在一起(例如，激光焊接)的第一层9518和穿孔层9585之间的开口空间，该焊接处9052和9026限定流体流动通道9053。说明性地，真空通道 9050可以形成为层9518中的子通道。在所示的实施例中，真空通道9050具有拱形形状，该拱形形状被设计为保持通道9053打开并将通道9053连接至穿孔层9585中的穿孔9586以及连接至孔9582，尽管其他形状也是可能的。在没有形成的具有某些膜或其他材料的真空通道9050的情况下，当对通道施加真空时，通道9053可能趋于“亲吻式”关闭，并妨碍阵列抽空。在一实施例中，真空通道9050可利用热成型固定装置(例如，适当成形的热“凹陷”线)形成在层9518中。在其他实施例中，真空通道9050可以通过激光蚀刻、 x线摄影等形成。
[0297]
穿孔层9585和第二层9587是塑料膜，其已经说明性地通过热密封(例如，热激活的密封)而被密封到高密度阵列9581，尽管可以理解的是，可以采用其他密封方法。还应理解，用于高密度阵列9581的材料以及用于穿孔层 9585和第二层9587的材料应彼此兼容，与密封方法以及所使用的化学物质兼容。当用于pcr时，可以用于高密度阵列9581并可以热密封的兼容塑料的示例为pe、pp、和其他嵌段共聚物弹性体。如果在检测化学中使用荧光染料，则可能希望由黑色或其他相对荧光不透明的材料形成高密度阵列9581，以最小化从一个孔9582到其相邻孔的信号流，并且可能希望层 9585和9587中的至少一层相对地荧光透明。对于穿孔层9585和第二层9587，可以使用强工程塑料(例如或pet)与可热封塑料层(例如，pe、pp 和)的层压。对于基于黏合剂的系统，可以使用诸如pet或聚碳酸酯的刚性工程塑料来形成高密度阵列9581，然后将与pcr兼容的塑料膜用作穿孔层9585和第二层9587。在一个示例性实施例中，高密度阵列 9581由黑色pe制成，复合聚乙烯/pet层压(或pn 104702热层压贮袋材料)用于穿孔层9585和第二层9587，它们被热密封至高密度阵列9581，复合聚丙烯/pet被用于贮袋9510的第一层9518和第二层9519。
[0298]
应当理解的是，穿孔9586与孔9582对齐。还应理解的是，穿孔9586 足够小，从而在没有一些力的情况下，流体不容易流过穿孔9586。说明性穿孔可以为0.001
‑
0.1mm，更说明性地为0.005
‑
0.02mm，更说明性地为约0.01mm。在说明性实施例中，通过经真空端口9051经真空通道9050在孔9582上抽真空，然后密封(例如热密封)真空通道9050，将真空原位施加到第二级扩增区域9580。随后，当提供流体时，真空使流体通过穿孔9586吸入到每个孔9582中。一旦孔9582被填充且压力相等，就不再存在力以迫使流体进入或流出孔9582。说明性地，可以通过施加基本上垂直于填充通道 9052的热密封来在填充之后密封孔。在另一个实施例中，然后可以激活邻近第二级扩增区9580的气囊(未示出，但是位置上与气囊880/882相似)以将第一层9518相对高密度阵列9581按压并将流体密封到孔9582中。尽管贮袋9510的第一层9518用于密封孔9582，但应理解，可以在穿孔层9585和第一层9510之间设置可选的密封层。
[0299]
在一个说明性示例中，可以如下制备第二级扩增区9580。可以通过首先冲压、模制或以其他方式在塑料片材(例如0.1至1mm厚)中形成孔9582 的阵列来制备高密度阵列9581。孔可以形成期望的任何规则或不规则阵列，并且可以具有示例性地为0.05μl至20μl，并且更示例性地为0.1μl至4μl 的体积。然后例如通过加热或黏合剂将背层(例如，9587)层压到高密度阵列9581的第一表面9581a。如图9b所示，第二层9587被施加到第一表面 9581a。然后，通过手动移液或自动移液(示例性地，使用x/y可定位的点样器(spotter)，例如针式点样器、点矩阵打印机、小容量自动移液器或微流体微接触点样器，例如通过引用并入本文的美国专利申请号2017
‑
0209844中教导的点样器)将试剂9589(例如，阵列的化学物质的独特元素，例如pcr引物对)点样到孔中。在每个孔9582中的试剂9589已干燥之后，可以将先前已经接合到层9518的穿孔层9585施加到阵列9581的第二表面9581b。可以将阵列9581接合到贮袋510的层9519并在适当的位置密封，例如通过热密封、使用黏合剂、超声焊接、机械封闭或在泡罩580内将阵列9581封闭在贮袋510内的其他方式来进行。应当理解，第二级反应区9580经由通道9565 流体地连接至下游流体泡罩(例如，第一级反应区)，并且液体可以从通道 9565流入第二级反应区9580并通过通道9565到穿孔9586之上，该通道 9565与流体流动通道9053和真空通道9050流体连通。
[0300]
第二级反应区9580可以类似于图7a的第二级阵列11000或图7a的阵列组件8000a的方式使用。因为可以对阵列9581施加真空，所以当液体从泡罩下游流体贮存器移至第二级扩增区域9580时，液体样本经过流体流动通道9053和穿孔9586被吸入孔9582中。
[0301]
因为阵列组件设置有与多个孔流体连通的真空端口，所以真空可以(局部地)施加到阵列组件(而不是全局地，在制造或组装分析装置期间，该分析装置例如是其中设置了阵列组件的贮袋)。因此，在制造期间不需要抽气室来施加真空，因为产品不需要在真空条件下组装。而是，可以在使用时甚至在分析方法的其他步骤的执行期间，而不是在分析装置(例如其中设置了阵列组件的贮袋)的组装期间，使用活塞泵(例如，注射器或注射器式真空装置)或其他真空装置按需施加真空。因此，不需要抽气室来施加真空使得可以在真空条件下组装产品。而是，可以使用活塞泵或其他真空装置施加真空。
[0302]
在一个说明性的制造过程中，在包括在真空下包装的阵列组件的分析装置的制造期间使用的抽气室的体积将比阵列组件的孔和通道系统的体积大很多很多倍。抽空更大体积需要比较小体积更大的泵和/或需要更长的时间。较大的泵(例如隔膜真空泵或旋片泵)在较大的体积中抽吸(硬)真空时通常比活塞泵在较小的体积中抽吸(硬)真空时通常更差。此外，能够抽吸由活塞泵抽吸的真空水平的较大泵在获取、操作和/或维护方面可能比活塞泵昂贵得多。此外，活塞泵的单个冲程可以抽出(一定水平的)真空，这对于较大的隔膜泵或旋片泵将需要更长的时间。因此，在给定的时间内，活塞泵可以比较大的隔膜泵或旋片泵抽出更完全的真空(例如更接近总真空)。
[0303]
如上所述，真空也可以按需施加，例如在使用时。因此，真空不需要由阵列组件保持或维持达延长的时间段。而是，与现有系统不同，现有系统中分析装置是在真空下包装的，使得在储存、运输、转移分析装置期间以及在分析过程中的预备步骤期间分析装置必须保持或维持真空，而按需真空可以在通过打开流体密封件释放或使用真空以将流体抽到孔中(例如，通过通道系统)之前的时刻施加到孔和/或被保持到正好直到通过打开流体密封件释放或使用真空以将流体抽到孔中(例如，通过通道系统)时。例如，在一个优选的实施例
中，在将液体样本吸入孔中之前，真空仅需要由阵列组件维持几秒钟(即足够长以产生真空密封并打开流体密封件)。以这种方式，在打开流体密封件以释放真空时，高达(几乎)完全的抽吸真空的水平可用于将完全的、恒定量的流体抽吸到每个孔中。
[0304]
另外，因为没有经由流体开口经过液体样本抽真空，所以真空的水平或强度不限于液体样本的分压。这种较强的真空的负压水平(例如，在2mbar和 140mbar之间)可以从阵列组件中彻底抽出空气，从而使阵列组件中的残留空气最小化，其最小化可能被通道和孔或阵列组件中的吸入流体困住的气泡。而且，阵列组件可以被配置为(例如，尺寸化和结构化)，使得不需要抽气室来施加真空。而是，孔和通道系统的组合体积可以足够小，以允许利用活塞泵的单个冲程抽出所有或基本上所有的空气。然而，将理解，在一些实施例中，可以使用其他类型的真空装置(例如，旋转叶片或隔膜泵)。
[0305]
图11a示意性地示出了系统1100，该系统1100包括能够在执行分析方法的一个或多个步骤的同时在反应容器中原位抽真空的仪器1101。在1102 处示出了示例性反应容器，其被配置为将真空原位施加到反应容器的一个或多个组件(例如，泡罩、第二级阵列、试剂孔或泡罩等)。尽管反应容器1102 具有特定的形式和布局，但是将意识到，这仅是示例性的，并且其他反应容器，例如贮袋8000a，可适于原位施加真空。
[0306]
反应容器1102包括可用于将样本引入反应容器中的样本泡罩1103。在一个实施例中，可以用拭子1104引入样本。但是，拭子1104仅是示例性的。在其他实施例中，可以用例如移液管引入液体样本，或者可以将干燥样本(例如，受污的组织)放入样本泡罩1103中。反应容器1102还包括裂解区1105 和反应区1106，在该裂解区1105中，可以裂解样本中的细胞和病毒以释放其核酸用于分析，在该反应区1106中可以进行各种方法步骤，例如但不限于核酸恢复和净化、第一级多重pcr和制备第一级产品用于第二级pcr。在一个实施例中，裂解区1105和反应区1106可以组合成一个区用于裂解、核酸净化、第一级pcr等。在另一实施例中，裂解区1105和反应区1106可以在专用于分开的功能的多个分离泡罩之间划分。贮袋510是这样的反应容器的示例，其具有专用于不同功能的多个分开的泡罩。
[0307]
说明性反应容器1102还包括多个试剂泡罩1107a
‑
1107d，其可用于提供试剂以用于在反应容器中进行的化验。试剂泡罩可包含干燥试剂、液体试剂或两者的组合。虽然示出了四个试剂泡罩，但是将意识到可以包括更多或更少的试剂泡罩，这取决于要在反应容器中进行的化验。同样，取决于在反应容器中进行的化验，试剂泡罩可以以多种不同的配置连接到反应泡罩。反应容器1102还包括用于连接反应容器的区域的多个通道1109a
‑
1109g。在一个实施例中，通道1109a
‑
1109g可以被可打开地密封，如本文其他地方详细说明的。反应容器1102还包括阵列1181，该阵列1181包括多个孔1182，该多个孔1182被配置用于各个化验反应。
[0308]
尽管仅示意性地示出了仪器1101，但是普通技术人员将理解，仪器1101 可以被配置为在执行分析方法的过程中对反应容器1102执行许多操纵、加热步骤、冷却步骤等。在一个实施例中，仪器1101可以包括一个或多个加热器，其被配置为控制反应容器1102的一个或多个部分的温度。例如，此类加热器可被配置为热循环反应容器1102的一个或多个部分，以执行一个或多个pcr反应。类似地，这样的加热器可以被配置用于反应容器1102的一个或多个部分中的一个或多个等温过程。在一个实施例中，仪器1101可以包括裂解装置(例如，类似图2的元件804的珠磨器、桨珠磨器、超声波仪等) 以在反应容器1102的一个或多个部
分中进行细胞裂解。在一个实施例中，仪器1101可包括用于磁珠捕捉的磁体。在一个实施例中，仪器1101可包括用于在反应容器1102的一个或多个部分内移动流体的致动器。在一个实施例中，仪器1101可以包括一个或多个密封件(例如，可伸缩密封件和/或热密封件)，用于控制流体在反应容器1102的一个或多个部分内的移动。在一个实施例中，仪器1101可以包括用于从反应容器1102的一个或多个部分的光学(例如荧光)激发和数据收集的光源和图像捕获系统。
[0309]
另外，仪器1101可以包括计算机(内部或外部计算机，或两者兼有)、集成显示器、将热封施加到反应容器1102的一个或多个部分的热封装置和/ 或用于将反应容器1102的一个或多个部分向仪器1101的组件压缩的压缩构件(例如，可充气气囊)。例如，压缩构件可用于改善反应容器1102的一个或多个部分与一个或多个加热器之间的热接触。在一个实施例中，仪器1101 被配置用于在反应容器1102中进行至少一个pcr反应。仪器1102中可以包括的其他组件在图2
‑
图4中示出，并在随附的文本中讨论。然而，将认识到，在仪器1102中，图2
‑
图4中所示的组件的形式和布置可以不同，但是功能可以相同或相似。
[0310]
除了前述内容之外，仪器1101和反应容器1102可以被配置为在执行分析方法之前或同时在反应容器1102的一个或多个部分中抽真空。如本文其他地方所详细讨论的，使反应容器1102的一个或多个部分在局部真空下可以便于用流体填充一个或多个部分。例如，通过使阵列1181处于局部真空下，可以极大地便于填充阵列孔1182。
[0311]
在一个实施例中，反应容器1102包括通道系统，类似于例如图7a、 8a、8c和9a所示的那些，用于对反应容器的一个或多个部分施加真空。另外，仪器1101包括用于在执行分析方法的同时在反应容器1102的一个或多个部分中抽真空的系统。真空系统包括真空线路1110和真空源1112。真空源1112实质上可以是本领域中已知的任何真空源或真空产生装置。示例包括但不限于活塞泵(例如，注射泵)、容积泵(positive displacement pumps)、动量传递泵(也称为分子泵)和截留泵(也称为分子阱(molecular trap))。在一实施例中，真空源1112可包括连接至真空泵的真空室。在这样的系统中，真空室中的局部真空可用于在反应容器1102的一个或多个部分上抽真空，并且继而，真空泵可用于在真空室中抽真空或保持真空。在一实施例中，真空源1112和真空线路1110可在真空端口1108处在阵列1181上抽真空。在一个实施例中，真空源1112可以流体地耦合至至少一条附加的真空线路，以在反应容器1102的至少一个附加部分上抽真空。例如，图11a示出了真空线路1110上的延伸1118，其可以用于经由端口1116在至少一个试剂泡罩上抽真空。
[0312]
在一个实施例中，仪器1101可用于在执行分析方法的同时或在仪器已执行分析方法的至少一个步骤之后向反应容器1102的一个或多个部分施加真空。例如，仪器1101可以在将反应容器插入仪器中的同时或之后、在水合样本的同时或之后、在第一反应区(例如裂解区1105)中执行一个或多个方法步骤或反应的同时或之后、在第二反应区(例如，反应区1106)中执行一个或多个方法步骤或反应的同时或之后、或者在准备用流体填充反应容器 1102的一个或多个部分时在反应容器1102中抽真空。例如，仪器1101可以在准备用流体填充阵列1181或试剂泡罩1107d(或另一试剂泡罩)时在该阵列1181或试剂泡罩1107d中抽真空。
[0313]
在一个示例中，第一反应区中的一个或多个方法步骤或反应可包括但不限于样本裂解(例如，通过珠磨(bead beating))、从裂解物中分离裂解颗粒、将裂解物移至反应容器
中的另一个腔室中、将二氧化硅磁珠与裂解物混合、或捕获磁珠并将它们移至反应容器中的另一个腔室中。在一个示例中，第二反应区中的一个或多个方法步骤或反应可以包括但不限于将二氧化硅磁珠与来自第一反应区的裂解物混合、将用过的裂解物(即，核酸捕捉之后的残留裂解物)移至反应容器中的另一个腔室(例如，废物腔室)、对磁珠进行至少一次清洗并将清洗液移至反应容器中的另一个腔室、从二氧化硅磁珠上洗脱核酸、进行第一pcr反应(例如，单重或多重pcr)或稀释第一pcr 反应的产物以准备在阵列的孔中进行第二pcr反应。
[0314]
图11b和11c更详细地示出了用于对阵列和试剂泡罩抽真空的系统。图11b示出了用于阵列1181的真空歧管1128和1130。真空歧管的实施例的细节以及其与阵列、阵列孔等如何相关在图8a
‑
图8c中示出并在随附文本中进行了讨论。在所示的实施例中，真空线路1110和真空源1112经由真空枢纽1111连接至真空端口1108。真空枢纽1111可以是本领域中已知的诸如吸盘、接套(nipple)等的弹性构件。在一个实施例中，真空枢纽1111可以包括尖锐构件(例如，针等)，其定位成穿透在真空端口1108上方的一层膜。在另一实施例中，真空端口1108可包括挡板阀(flapper valve)或其他阀，使得真空端口通常可以从外部密封，但是当在真空端口1108上抽真空时，阀可以打开以允许空气逸出。在对阵列1181抽真空之后，可以在1164 的区域中施加密封件(例如，热密封件)以将通道1128和1130隔开外部空气而密封，并且在移除真空枢纽1111之后保持阵列中的真空。
[0315]
图11c示出了示例性的泡罩1107d，其可以被配置为具有原位抽吸的真空。并且，尽管示出了一个试剂泡罩1107d，但将认识到，多个试剂泡罩可以关联至一个真空系统，或者像1102这样的反应容器可以包括两个或更多个试剂泡罩，其可以被配置为具有原位施加的真空。在所示的实施例中，真空线路1118和真空源1112通过真空端口1116连接到试剂泡罩1107d，并通过真空枢纽器1117连接到反应容器真空线路1114。与真空枢纽1111一样，真空枢纽1117可以是本领域中已知的诸如吸盘、接套等的弹性构件。在一个实施例中，真空枢纽1117可包括被定位成穿透在真空端口1116上方的一层膜的尖锐构件(例如，针等)。在另一实施例中，真空端口1116可包括阀，使得真空端口可正常地从外部将其密封，但是当在真空端口1108上抽真空时，阀可以打开以允许空气逸出。可以如本文其他地方所述形成反应容器真空线路1114，以在施加真空时保持线路打开。例如，反应容器真空线路1114 可以包括形成在用于制造反应容器1102的膜中的压印拱形，反应容器真空线路1114可以行程在卡片材料中。如本文其他地方所讨论的，通道1109e中的可打开的密封件1121可以防止施加到泡罩1107d上的真空被施加到反应容器1102的其他区域。在对试剂泡罩1107d抽真空之后，密封件(例如，热封或盖封)可以施加在1122的区域中以在移除真空枢纽1117之后保持试剂泡罩1107d中的真空。
[0316]
在一个实施例中，试剂泡罩1107d可以包括干燥的化学物质1120，其可能需要被再水合以在化验中使用。对试剂泡罩1107d施加局部真空以例如允许再水合流体流入试剂泡罩1107d而没有空气阻塞流体的流动可能是有利的，从而泡罩随后不会被引入反应室(例如，反应室1106)中。干燥的化学药品1120可以风干或冷冻干燥，并且可以包括反应组分(例如，酶)、缓冲剂、稳定剂等。干燥的化学物质1120可以是粉末、干燥的试剂丸、点在滤纸上的试剂的形式或本领域已知的其他形式。
[0317]
应当理解，在本文所述的阵列的各种实施例中，反应组分可以点在孔中。例如，可
在每个孔中点样引物以引发核酸扩增反应。每个孔可以具有不同的引物对，各个孔可以包括在其他孔中发现的引物的重复，或其任何组合。可能点样另外的材料，包括三磷酸核苷酸(ntp)、聚合酶、镁或其他组分中的一种或多种。当在制造过程中点样并干燥这些组分时，这些组分通常在孔的边缘周围干燥，从而留下相对较小的表面积用于再水合。对于快速pcr 实施例，参见例如通过引用并入本文的pct/us2017/18748，这种再水合所需的时间可以延伸经过多个pcr循环，这可能需要额外的循环时间。
[0318]
现在转向图10a
‑
f中，减少在第二级pcr热循环期间用于再水合和溶解所花费的时间的一种方法是在使用阵列时在反应过程中的时间之前，说明性地，在样本制备期间中或在第一级pcr期间，用水合流体充满阵列。图 10a
‑
10e示出了在第二级阵列的示例性孔中使内容物再水合并引发反应的方法的示例。图10f示出了在图10a
‑
10e中所示的方法中引发反应的替代方法。尽管图10a
‑
f示出了阵列1080的一个孔1082，但是应当理解，可以存在多个孔，说明性地，诸如以阵列580、阵列5081和阵列8000的布置以及其他阵列配置。说明性孔1082形成在阵列层1081中，并由穿孔层1085和第二层1087界定。应当理解，层1018可以是贮袋的外层，类似于层518，或者层1018可以是被提供用于再水合方法的额外的柔性的层。阵列1080可以在本文所述的各种实施例中或在其他样本处理系统中使用。
[0319]
阵列1080可以点样有用于样本处理的各种组分1040，例如用于pcr 的组分。对阵列1080点样的说明性方式在美国专利公开号2015/0283531中描述，该专利通过引用并入本文，但应理解，对阵列1080点样的其他方式也在本公开的范围内。点样之后，可以干燥阵列1080。如图10a所示，组分 1040经常干燥到孔1082的角落中。可选地，阵列1080可以在使用时抽空，如图10a中的箭头所示并且如本文其他地方所详细描述。同样，阵列1080 可以在制造时被抽空，然后在真空下存储直到使用时。
[0320]
在图10b中，水合流体1070(例如水或缓冲液)通过开口1086引入孔1082。可以理解，开口1086可以是穿孔，例如本文其他地方所述的穿孔 586，其中，开口1086足够小，在没有力的情况下，流体不容易流过开口1082。然而，在一些实施例中，可能希望开口1086更大，或者可能希望使用其他阻隔层。在填充水合流体1070之后，可以从阵列中去除过量的水合流体，例如，如图10c所示，通过使用辊1050将流体朝向废物容器(未示出)滚动，或者通过在阵列上施加压力，例如，通过位于阵列1080附近的仪器中的气囊。由于每个阵列孔中的材料都需要再水合，因此如果立即去除过量的水合流体1070，则孔之间的交叉污染的量将被最小化，因为当反应组分1040开始再水合到水合流体1070中时，多余的水合流体被去除了。可选地，当过量的水合流体1070被移动到废物容器时，压力可以被施加在层1087上，该压力减小了孔1082的体积，从而导致孔1082未填满。
[0321]
在图10d中，在第一级pcr之后，可以例如通过压力将第一级反应混合物1045移动到阵列1080中。因为每个孔都是柔性的并且已经被填充，但是由于去除了过量的水合流体，说明性地不会被过度填充，因此每个孔可以接受少量的反应材料，例如第一级pcr反应混合物1045。因为仅将少量的第一级pcr反应混合物1045引入到每个孔中，所以可以省略在引入第一级 pcr反应混合物之前的第一级pcr反应混合物的稀释步骤。如果如上所述孔1082未填满，则可引入每个孔的第一级pcr反应混合物1045的量可能会稍大，因此，稀释量会有所减少。可以调节在去除过量水合流体1070期间施加在层1087上的压力的量，以提供适当的稀释量。
[0322]
如图10e所示，可以再次使用辊1050或其他压力以去除过量的第一级 pcr反应混合物1045。在该说明性实施例中，仅推动少量的第一级pcr反应混合物1045通过开口1086。图10f示出了替代实施例，其中，不是迫使过量的第一级反应混合物1045离开阵列1080，而是将层1018密封到穿孔层 1085，例如通过在箭头1090处的压力或热密封。在该实施例中，第一级pcr 反应混合物1045的团块被密封在开口1086的外部，并且第一级pcr反应混合物1045和组分1040可以在随后的热循环期间继续混合。与图10e所示的实施例相比，该实施例可导致较少的稀释。
[0323]
因为阵列1080的这种预先再水合可以包括相关的反应物，所以可能希望在将第一级反应混合物提供给阵列之前从阵列中省略一种反应物，使得反应混合物不完全并且直到提供第一级反应混合物，阵列中的反应才能开始。例如，如果将第二级阵列1080用于pcr，则可以从干燥的阵列组分和水合流体两者中省略镁，从而防止在再水合期间形成引物二聚体。在这种方法中，可以在将第一级反应混合物提供给阵列之前将高浓度的镁添加到第一级反应混合物中，并在将少量的第一级反应混合物引入每个孔中时稀释该混合物为阵列提供了适当浓度的镁，以便进行pcr。应当理解，镁是示例性的组分，并且其他组分可以用于控制扩增的开始。同样，可以理解的是，可以向每个孔提供完整的混合物，并且可以通过控制反应温度来控制反应的开始，例如通过使用加热器(例如加热器888)进行冷却来控制反应的开始。
[0324]
因此，本公开的实施例提供了优于现有系统的众多优点。
[0325]
结论
[0326]
尽管前面的详细描述参考了特定的示例性实施例，但是在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，可以以其他特定形式来体现本公开。因此，所描述的实施例在所有方面仅应被认为是说明性的而非限制性的。例如，可以对所描述和/或示出的实施例进行相关领域的且拥有本公开的技术人员将想到的对在此描述和/或示出的发明特征的各种替代、变更和/或修改以及对在此描述和/或示出的原理的其他应用而不脱离由所附权利要求限定的本发明的精神和范围。
[0327]
权利要求书中记载的限制应基于权利要求书中使用的语言来广义地解释，并且不限于在前述详细说明中描述的特定示例，这些示例应被解释为非排他性和非穷举性的。落入权利要求的等同含义和范围内的所有改变均应包含在其范围之内。
[0328]
还将意识到，某些实施例的各种特征可以与本公开的其他实施例兼容、组合、包括在和/或并入到其他实施例中。例如，根据本公开的某些实施例的系统、方法和/或产品可以包括、并入或以其他方式包括在本文公开和/或描述的其他实施例中描述的特征。因此，相对于本公开的特定实施例的某些特征的公开不应被解释为限制将所述特征应用于或包括在特定实施例中。另外，除非在特定实施例中将特征描述为必需，否则在各个实施例中描述的特征可以是可选的，并且可以不包括在本公开的其他实施例中。而且，除非特征被描述为需要与之组合的另一特征，否则本文的任何特征可以与本文公开的相同或不同实施例的任何其他特征组合。