飞蝗脱水抗性基因LmDesi及其dsRNA的应用的制作方法

飞蝗脱水抗性基因lmdesi及其dsrna的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及飞蝗脱水抗性基因lmdesi及其dsrna的应用。


背景技术：

2.蝗灾与旱灾多为链性发生，提示其爆发与蝗虫对干燥胁迫耐受能力密切相关。我国历史上造成灾害最多，为害最严重的是飞蝗。飞蝗是危害极强的农业害虫，喜干热环境，在世界范围内广泛分布，得益于该物种对干燥环境的适应能力强。然而，目前对于飞蝗耐受干燥环境的机制是什么还不清楚。目前，最有效的飞蝗防治方法仍以化学手段为主，但存在农药残留和导致昆虫产生抗药性等问题，而且只能应一时之需，不能保证长治久安。因此，在研发新型环境友好型杀虫剂逐渐成为现阶段防治热点的大背景下，了解昆虫迅速适应干燥环境的分子机制将有助于新的生物防治策略的发展。
3.脱水抗性基因desi在果蝇幼虫中随生存环境由湿润转入干燥后表达升高，在果蝇适应干燥环境中起重要作用，但gc
‑
ms检测发现，该基因提高昆虫耐受干燥能力的机制并非通过改变昆虫表皮碳氢化合物的成分和含量来实现，且其具体机制尚不清楚。本发明将以飞蝗为研究对象，验证该基因是否与飞蝗耐受干燥环境有关，并进一步深入探讨其抵御干燥环境的分子机制。通过分析多个飞蝗转录组数据库，搜索脱水抗性基因desi的cdna序列，分析该基因分子特性，并在不同湿度条件下采用rna干扰技术研究其生物学功能解析其在飞蝗干燥适应过程中的生理机制，为害虫防治提供理论支持。
4.rna干扰(rnai)技术，是一种由双链rna分子引起的特要异性转录后基因沉默技术，在2006年获得了诺贝尔奖后，在多个领域都被广泛应用。该技术为基因功能、人类疾病治疗和作物害虫防治等方面的研究都开辟了新途径。通过rna干扰进行害虫防治具有如下特点：杀虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；防治害虫具有高效性，rna介导的基因沉默效率较高；rna在自然界极易降解，无残留，不会污染环境；rna干扰技术可有效控制特定的农作物害虫，在害虫防治领域具有非常重要的应用前景。而实现基于该技术进行害虫防控的关键是筛选出对害虫高效致死的特异dsrna。
5.因此，本发明基于rnai技术，选取飞蝗脱水抗性作为靶标，利用其在飞蝗体内的重要生物学作用，旨在为后续研究昆虫适应性演化对昆虫辐射爆发的影响奠定基础，并为害虫新型防治提供靶标基因。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了提供一种飞蝗脱水抗性基因lmdesi全长序列及其合成的dsrna在飞蝗防治中的应用。
7.为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
8.飞蝗脱水抗性基因lmdesi，其全长序列的核苷酸序列为seq id no：1。该基因全长序列是基于飞蝗转录组数据库，搜索获得的片段通过genedoc软件结合飞蝗基因组序列对其进行拼接，设计引物进行pcr扩增，纯化pcr产物并将其与peasy
‑
blunt zero载体连接后
转入trans1
‑
t1感受态细胞中培养，挑斑、检测、送公司测序，测序结果与转录组搜索结果比对，获得该核苷酸长度为1000bp，orf序列全长781bp，编码269个氨基酸，含有1个信号肽结构域、1个跨膜结构域和一个未知功能pfam：dm4
‑
12结构域。
9.基于飞蝗脱水抗性基因lmdesi合成dsrna的方法，包括以下步骤：
10.以所述脱水抗性基因lmdesi克隆载体为模板，根据seq id no：1设计上游引物seqid no：3和下游引物seq id no：4，通过pcr扩增获得seq id no：2，其产物含有t7启动子；产物经纯化后按照试剂盒说明体外转录合成dsrna。
11.上述合成dsrna方法合成的dsrna的应用，在飞蝗干燥适应中的应用。
12.与现有技术相比本发明具有以下优点：
13.据飞蝗脱水抗性基因lmdesi合成双链dslmdesi，将dslmdesi注射进飞蝗体内，分别饲喂麦麸麦苗，特异性沉默相关靶基因，飞蝗饲喂麦麸组将会出现蜕皮困难死亡以及干燥死亡两种表型，且表型率可达95％，具有特异性与高效性，本发明筛选获得的lmdesi基因可以作为飞蝗防控的重要分子靶标，为害虫防治提供了绿色高效的新途径。
附图说明
14.图1为注射合成的dsrna48h后饲喂不同湿度食物(麦麸、麦苗)对飞蝗脱水抗性基因的转录影响，rpl
‑
32为内参基因，其中***p<0.001。
15.图2为注射合成的dsrna后对饲喂湿度不同食物(麦麸、麦苗)对飞蝗发育的影响。
16.图3为注射合成的dsrna后对饲喂麦麸、麦苗对飞蝗表皮chcs的影响。
具体实施方式
17.实施例1
18.飞蝗脱水抗性基因lmdesi全长序列的获得
19.1.基于飞蝗的转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗脱水抗性基因进行搜索，经过序列分析，拼接及比对后，获得飞蝗脱水抗性基因(lmdesi)序列。
20.2.选取生长健康，大小一致雌雄各半的五龄飞蝗若虫，在体式显微镜下将其表皮快速解剖下来，并冷冻于液氮中，3头一个生物学重复，设置四个生物学重复，依照takara trizol试剂盒提取rna。采用m
‑
mlv反转录酶将所提rna反转录成第一链cdna，以此做为模板，设计上下游引物，通过pcr扩增获得脂肪酸延伸酶基因全长片段，扩增产物纯化以后将其连接至t4载体，后转入trans1
‑
t1感受态细胞中培养，挑斑、检测、送公司测序，测序结果与转录组搜索结果比对，验证并获得该基因的核苷酸全长序列，其核苷酸序列为seq id no：1。
21.实施例2
22.蝗脱水抗性基因(lmdesi)特异dsrna的合成方法
23.1)飞蝗脱水抗性基因dsrna引物的设计
24.基于飞蝗脱水抗性基因序列seq id no：1，采用primer premier 5.0软件设计dsrna引物，其上下游引物序列分别为seq id no：3和seq id no：4。上下游引物均携带t7启动子序列。所有引物均由上海生物工程有限公司合成。
25.2)飞蝗脱水抗性dsrna的合成
26.以上述脱水抗性基因克隆载体为模板，seq id no：3和seq id no：4为上下游引物，进行pcr扩增。将扩增的pcr产物，经gel extraction kit(sigma)试剂盒纯化后按照t7 ribomax
tm
express rnai system(promega)试剂盒说明体外转录合成dsrna(dslmdesi)，以绿色荧光蛋白基因gfp为对照，合成dsgfp。使用nanodrop 2000(thermo scientific)进行定量，使其终浓度达到6μg/μl。保存于
‑
80℃超级低温冰箱备用。
27.实施例3
28.飞蝗脱水抗性基因dsrna致死飞蝗试验
29.1.飞蝗脱水抗性基因dsrna注射
30.选取生长健康、大小一致、雌雄各半15头五龄第1天若虫进行试验。将合成的dslmdesi使用25μl规格微量注射器将5μl(30μg)顺着血流方法轻轻注射进入若虫侧腹部的二、三腹节之间。同时选取30头若虫设立为对照组。注射相同体积和浓度的dsgfp至对照组体内。分别将注射后飞蝗置于30℃恒温生化培养箱中饲养(光照：黑暗时间＝14h:10h，温度30
±
2℃，湿度50％)，每天饲喂新鲜小麦幼苗、麦麸。
31.2.飞蝗脱水抗性基因沉默检测
32.饲喂麦麸组和麦苗组各收集9头注射dsgfp和dslmdesi 96h后若虫虫体进行总rna提取，并反转录成第一链cdna，每组设置3个生物学重复，每个生物学重复3头若虫。采用real
‑
time pcr方法分别检测目的基因(lmdesi)和管家基因(rpl
‑
32)的相对表达量，对其沉默效率进行计算。结果如图1所示，与对照组比较，注射dslmdesi后，两组处理组脱水抗性基因表达显著降低，其沉默效率达到93％。
33.3.注射dsrna后五龄若虫表型观察
34.如图2所示，左为注射dsgfp的对照组，右为注射dsrna的实验组，实验组出现蜕皮困难死亡以及蜕皮后失水死亡死亡情况。
35.五龄若虫注射dsrna后，对照组第八天后全部成功蜕皮至成虫，且蜕皮后生长发育状况良好。而实验组注射dslmdesi后，有5头无法成功蜕皮直至死亡，同时有9头若虫在发育至第八天之前陆续死亡，两种表型死亡率达到95％。
36.4.注射dsrna后若虫的gc
‑
ms检测chcs含量试验
37.五龄若虫注射dsrna后，分别选取饲喂麦麸、麦苗组蜕皮前实验组以及相同数量正在蜕皮前对照组若虫，进行表皮脂含量检测，结果如图3所示，图3中a
‑
c表明在喂食麦麸的飞蝗中，与注射dsgfp的飞蝗相比，注射dslmdesi的飞蝗表皮chcs总量升高。深入分析chcs组成和含量表明，注射dslmdesi飞蝗表皮中8种中性脂(c
25
、c
26
、c
27
、c
28
、c
29
、c
30
、c
31
和c
33
)和6种甲基酯(3
‑
mec
25
、4
‑
mec
26
、3
‑
mec
26
、3
‑
mec
27
、3
‑
mec
29
和3
‑
mec
31
)的含量都显著升高。图3中d
‑
e表面在喂食新鲜麦苗的飞蝗中，与注射dsgfp的飞蝗相比，注射dslmdesi的飞蝗表皮chcs总量无显著变化，深入分析chcs组成成分和含量发现，注射dslmdesi飞蝗表皮的8种中性脂和7种甲基酯的含量均无显著变化。
38.序列表
39.seq id no：1：
40.cccacaccagcggcccagcactcgctactcacaccacggcgcagcacggcacggcacaccgagacatggctcagagtaagacgttttcctccgtggcactggcggtcattgcgctgtccctcctgacgcaaagaagcagcgcggtgcccaagaagtacgacccccacagcgctaaccagccggtggaccagcaggcgatggagagccaggcagcggcggcctc
ggtgtctgctcaggaccctgaagcgcgcttcggcttcgccaccaccggactgggcgcggtgggcgcgaccagcctgctgccgactaccgccagcaccctgcgtctggacctgggcggcgtgttactgggggcggcgctgggcttcggcgcggtgctgctgctgcccaagctgctgcacgtgctcgacgtgcagccgcactcctaccacggctacgacggcgggtaccgcaggagtgaggagagccccgcagcggcggccacggagctggcggtgtcgctgctgtcccgggtggacgctgcgctgtcccgccaccacgtggactccgcggcctgcgtgcagcgcgccgtctgctcccaagtgcgaagtgcgggacagcaggtggccaagggggacgccagtgcctgggacgaagccgtggcacagatctccagtaactcgttgacaagctttctgctggacggaacgagcatcaagcaggcggtggagctgggtagagaaggcggtgactgcgaggcgcagttcgcgcgttgctcgctgagcaaggaggcgctgatggcggcggtgcgaggattgctgccggatccagaaccacaggcgcaggcgcagaagcagcaggccacgcagccctcgccagtgcgcatgcgcaagtagagcacggcgcccgacgacagcacagaaaatggacgaagctcgatgttat
41.seq id no：2：
42.cgctgtccctcctgacgcaaagaagcagcgcggtgcccaagaagtacgacccccacagcgctaaccagccggtggaccagcaggcgatggagagccaggcagcggcggcctcggtgtctgctcaggaccctgaagcgcgcttcggcttcgccaccaccggactgggcgcggtgggcgcgaccagcctgctgccgactaccgccagcaccctgcgtctggacctgggcggcgtgttactgggggcggcgctgggcttcggcgcggtgctgctgctgcccaagctgctgcacgtgctcgacgtgcagccgcactcctaccacggctacgacggcgggtaccgcaggagtgaggagagccccgcagcggcggccacggagctggcggtgtcgctgctgtcccgggtggacgctgcgctgtcccgccaccacgtggactccgcggcctgcgtgcagcgcgccgtctgctcccaagtgcgaagtgcgggacagcaggtggccaagggggacgccagtgcctgggacgaagccgtggcacagatctccagtaactcgttgacaa
43.seq id no：3：
44.caccgagacatggctcagagtaagac
45.seq id no：4：
46.ctgctggtccaccggctggttagcgc