与人IL-4Rα中特定表位结合的抗体及其应用的制作方法

与人il-4r
α
中特定表位结合的抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物制药领域，具体而言，本发明涉及能够与人il-4rα中特定表位结合的抗体及其应用。


背景技术：

2.人白细胞介素4受体(interleukin 4receptor，il-4r)是一种i型跨膜蛋白，其于全身各种组织器官中、尤其是免疫器官中广泛表达，例如扁桃体、阑尾、淋巴结、脾脏和骨髓等。il-4r与白细胞介素4(il-4)和白细胞介素13(il-13)等配体结合后可以发挥多种免疫调节效应，例如促进th2细胞的分化、调节b细胞分泌ige抗体以及刺激巨噬细胞替代性激活等。
3.il-4r是由两条多肽链组成的异二聚体，其中的一条α链(il-4rα)对il-4有很高的亲和力；并且，il-4rα链会与il-13的细胞表面受体α链(il-13rα)组成另一种形式的il-4r异二聚体，由此对il-13也有很高的亲和力。
4.il-4rα可产生一种可溶形式的蛋白(sil-4rα)，这种可溶形式的蛋白可以抑制一系列炎症相关的信号传导，例如il-4介导的细胞增殖和t细胞介导的il-5上调等。因此将该蛋白作为靶点的阻断抗体有助于治疗和缓解过敏性鼻炎、鼻窦炎、哮喘或湿疹等病症。并且，il-4和il-13都是具有非常广谱生物学活性的细胞因子，涉及很多种炎症相关的反应，大部分由活化的t细胞、单核细胞、肥大细胞、嗜碱粒细胞和嗜酸粒细胞产生。这两种白细胞介素在生物功能方面有许多共性，其主要的生物作用有刺激th2细胞的分化增殖、刺激活化b细胞分泌ige抗体等。研究表明，il-4和il-13在介导自身免疫性疾病、过敏性疾病、肿瘤等疾病的免疫反应中有非常重要的作用，一直是人们关注的研究热点之一。
5.由于sil-4rα对il-4结合起主导所用，并且其还涉及其他细胞因子，因此目前对sil-4rα这个靶点相关抗体的研究很多，并且临床上已经证明针对该靶点的人单克隆抗体可以有效缓解和治疗哮喘、特应性皮炎等疾病。但是，目前对sil-4rα在免疫效应中的表位研究较少，人们尚不清楚其具体的表位情况。


技术实现要素：

6.针对上述技术问题，本发明的发明人对sil-4rα的表位进行了研究，根据新获得的抗体及其与sil-4rα作用时存在的人和猴的物种特异性，筛选人sil-4rα中的一些位点进行了突变，并进行相关实验，找到了若干关键的表位结合氨基酸。这些表位结果对sil-4rα以及相关抗体的进一步研究具有重大意义。
7.因此，本发明的一个目的是提供一种结合人白细胞介素4受体(il-4r)的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与人il-4r的α链(il-4rα)中特定表位相结合。
8.基于本发明提供的所述抗体或其抗原结合片段，本发明的其他目的是提供一种核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段中关键结构域的核苷酸序列；提供含有核酸分子的载体；提供含有所述载体的宿主细胞；提供所述抗体或其抗原结合片段的制
备方法；提供含有所述抗体或其抗原结合片段的药物组合物；提供所述抗体或其抗原结合片段或所述药物组合物的制药用途。
9.基于本发明提供的人il-4r的α链(il-4rα)中的特定表位，本发明还提供所述表位在制备抗人il-4r抗体中的用途。
10.本发明的具体方案如下：
11.一方面，本发明提供一种结合人白细胞介素4受体(il-4r)的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合的表位位于人il-4r的α链(il-4rα)，且所述表位包括选自seq id no：1所示氨基酸序列中的氨基酸残基d92、v94、d97、l67、l68、a96、h156、c207、q63和l64中的一个或多个。
12.优选地，所述表位包括seq id no：1所示氨基酸序列中的氨基酸残基d92、v94和d97中的一个或多个。
13.根据本发明的具体实施方式，所述表位包括seq id no：1所示氨基酸序列中的如下氨基酸残基：
14.(1)d92；
15.(2)d97；
16.(3)d92、v94和d97；
17.(4)d92和v94；
18.(5)d92和d97；或
19.(6)v94和d97。
20.和/或，本发明提供的抗体或其抗原结合片段与人il-4rα的结合表位包括seq id no：1所示氨基酸序列中的如下氨基酸残基：
21.(i)q63和l64。
22.并且，本发明提供的抗体或其抗原结合片段不具有与猴il-4r的种属交叉结合活性；优选地，不结合猴il-4r；更优选地，不结合猴il-4rα；进一步优选地，不结合seq id no：2所示氨基酸序列。
23.就上述交叉结合活性而言，本发明提供一种结合人白细胞介素4受体(il-4r)的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合的表位位于人il-4r的α链(il-4rα)，且所述表位包括seq id no：1所示氨基酸序列中的氨基酸残基l67、l68和a96中的一个或多个。
24.优选地，所述表位包括seq id no：1所示氨基酸序列中的如下氨基酸残基：
25.①
l67和l68；
26.②
l67、l68和a96；或
27.③
a96。
28.根据本发明的具体实施方式，所述表位包括seq id no：1所示氨基酸序列中的如下氨基酸残基：
29.(a)l67、l68、a96、h156和c207；
30.(b)a96、h156和c207；
31.(c) l67、l68、h156和c207；
32.(d) l67、l68、a96和c207；或
33.(e)l67、l68、a96和h156。
34.特别优选地，本发明的表位包括seq id no：1所示氨基酸序列中的如下氨基酸残基：
35.(p-1)d97、l67和l68；
36.(p-2)d97、l67、l68、a96和d92；
37.(p-3)d97、l67、l68和d92；
38.(p-4)d97、q63和l64；
39.(p-5)d97、q63、l64和d92；
40.(p-6)d97、q63、l64、d92和a96；或
41.(p-7)d97、q63、l64、l67和l68。
42.检测本发明的抗体与抗原il-4rα的结合，发现本发明的抗体与sil-4rα的结合活性ec50不超过50ng/ml、30ng/ml、20ng/ml或10ng/ml。并且发现，本发明的抗体在100ul
×
2500ng/ml下与包被的100ul
×
0.5ug/ml的sil-4rα-97不显示结合活性，所述sil-4rα-97为sil-4rα的97位氨基酸残基d被突变为a后所得。进一步还发现，本发明的抗体在100ul
×
2500ng/ml下与包被的100ul
×
0.5ug/ml的选自sil-4rα-qsmdh和sil-4rα-63/64中至少一个突变抗原不显示结合活性或结合活性显著下降。
43.所述结合活性通过本技术具体实施方式部分“(一)结合活性检测方法”所述操作过程测得。此外，本发明的抗体可以阻断il-4与il-4r的结合，因此可以用作il-4与il-4r结合的阻断剂。
44.就所包含的结构域氨基酸序列而言，本发明提供的抗体或其抗原结合片段包含以下重链互补决定区hcdr1、hcdr2、hcdr3和轻链互补决定区lcdr1、lcdr2、lcdr3的组合：
45.(1)依次示于seq id no：35、36、37的hcdr1、hcdr2、hcdr3；和，依次示于seq id no：53、54、55的lcdr1、lcdr2、lcdr3；
46.(2)依次示于seq id no：41、42、43的hcdr1、hcdr2、hcdr3；和，依次示于seq id no：59、60、61的lcdr1、lcdr2、lcdr3；
47.(3)依次示于seq id no：44、45、46的hcdr1、hcdr2、hcdr3；和，依次示于seq id no：56、57、62的lcdr1、lcdr2、lcdr3；
48.(4)依次示于seq id no：44、47、46的hcdr1、hcdr2、hcdr3；和，依次示于seq id no：63、64、65的lcdr1、lcdr2、lcdr3；
49.(5)依次示于seq id no：48、49、46的hcdr1、hcdr2、hcdr3；和，依次示于seq id no：66、67、68的lcdr1、lcdr2、lcdr3；
50.(6)依次示于seq id no：44、50、51的hcdr1、hcdr2、hcdr3；和，依次示于seq id no：56、57、69的lcdr1、lcdr2、lcdr3；或
51.(7)依次示于seq id no：52、36、37的hcdr1、hcdr2、hcdr3；和，依次示于seq id no：53、54、55的lcdr1、lcdr2、lcdr3。
52.本发明提供的轻重链cdr的组合来自本发明的抗体或其片段，基于给定抗体或其抗原结合片段包含的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定其中包含的cdr。例如，根据本发明的具体实施方式，采用imgt工具划分可变区氨基酸序列中的cdr。以本领域已知方法划分得到的轻重链cdr的组合也被涵盖在本发明的范围内。
53.在本发明提供的抗体或其抗原结合片段中，优选地，所述重链可变区包含选自以下的序列：示于seq id no：3、seq id no：7、seq id no：9、seq id no：11、seq id no：15、seq id no：17、seq id no：19、seq id no：23或seq id no：27的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或，
54.优选地，所述轻链可变区包含选自以下的序列：示于seq id no：4、seq id no：8、seq id no：10、seq id no：12、seq id no：16、seq id no：18、seq id no：20、seq id no：28、seq id no：33或seq id no：34的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
55.根据本发明的具体实施方式，本发明提供的抗体或其抗原结合片段包含以下重链可变区vh和轻链可变区vl的组合：
56.(1)示于seq id no：3的氨基酸序列或与示于seq id no：3的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于seq id no：4的氨基酸序列或与示于seq id no：4的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
57.(2)示于seq id no：7的氨基酸序列或与示于seq id no：7的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于seq id no：8的氨基酸序列或与示于seq id no：8的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
58.(3)示于seq id no：9的氨基酸序列或与示于seq id no：9的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于seq id no：10的氨基酸序列或与示于seq id no：10的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
59.(4)示于seq id no：11的氨基酸序列或与示于seq id no：1l的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于seq id no：12的氨基酸序列或与示于seq id no：12的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
60.(5)示于seq id no：15的氨基酸序列或与示于seq id no：15的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于seq id no：16的氨基酸序列或与示于seq id no：16的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
61.(6)示于seq id no：17的氨基酸序列或与示于seq id no：17的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于seq id no：l8的氨基酸序列或与示于seq id no：18的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
62.(7)示于seq id no：19的氨基酸序列或与示于seq id no：19的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于seq id no：20的氨基酸序列或与示于seq id no：20的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
63.(8)示于seq id no：27的氨基酸序列或与示于seq id no：27的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于seq id no：34的氨基酸序列或与示于seq id no：34所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
64.(9)示于seq id no：27的氨基酸序列或与示于seq id no：27的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于seq id no：33的氨基酸序列或与示于seq id no：33的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
65.(10)示于seq id no：27的氨基酸序列或与示于seq id no：27的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于seq id no：28的氨基酸序列或与示于seq id no：
28的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
66.(11)示于seq id no：23的氨基酸序列或与示于seq id no：23的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于seq id no：34的氨基酸序列或与示于seq id no：34的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
67.(12)示于seq id no：23的氨基酸序列或与示于seq id no：23的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于seq id no：33的氨基酸序列或与示于seq id no：33的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；或
68.(13)示于seq id no：23的氨基酸序列或与示于seq id no：23的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于seq id no：28的氨基酸序列或与示于seq id no：28的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
69.特别地，本发明的抗体或其抗原结合片段至少包含重链可变区和轻链可变区，二者均包括上述cdr以及间隔的框架区(framework region，fr)，各个结构域的排列方式为：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。进一步可选地，所述“至少75％同一性”导致的氨基酸序列的至多25％差异可存在于重链可变区或轻链可变区中的任意框架区中，或者存在于本发明的抗体或其抗原结合片段中重链可变区和轻链可变区以外的任意结构域或序列中。所述差异可以由任何位置的氨基酸缺失、添加或置换产生，其中置换可以是保守置换或非保守置换。
70.优选地，本发明提供的抗体可以为单克隆抗体或单链抗体。优选地，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体或完全或部分人源化抗体。优选地，所述抗原结合片段为所述抗体能够特异性结合il-4rα的片段。例如，所述抗原结合片段为抗体的fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段或fv片段(如scfv)。
71.优选地，所述抗体或其抗原结合片段还包含人或鼠源的恒定区，优选包含人或鼠源的重链恒定区(ch)和/或轻链恒定区(cl)。进一步优选地，所述抗体分子或其抗原结合片段包含重链和轻链。例如，所述抗体为免疫球蛋白，具体为iga、igd、ige、igg或igm，更优选为igg1、igg2、igg3或igg4亚型。
72.优选地，本发明提供的抗体或其抗原结合片段包含igg、iga、igm、igd或ige的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区，例如重链恒定区为igg(如igg1或igg4)型，轻链恒定区为κ型。进一步优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区包含由示于seq id no：70或seq id no：71的核酸序列编码的氨基酸序列或者与由示于seq id no：70或seq id no：71的核酸序列编码的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链恒定区包含由示于seq id no：72的核酸序列编码的氨基酸序列或者与由示于seq id no：72的核酸序列编码的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
73.在本发明的上下文中，“至少75％同一性”为75％至100％之间的任何百分比数字的同一性，例如75％、80％、85％、90％，甚至91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
74.另一方面，本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明抗体或其抗原结合片段中的重链可变区、轻链可变区、重链和/或轻链的核苷酸序列。
75.本发明的核酸分子可以被克隆到载体中，进而转化或转染宿主细胞。因此又一方面，本发明还提供一种载体，所述载体包含本发明的核酸分子。所述载体可以为真核表达载
体、原核表达载体、人工染色体及噬菌体载体等。
76.本发明的载体或核酸分子可以用于转化或转染宿主细胞，用于保存或抗体表达等目的。因此，还一方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的核酸分子和/或载体，或者所述宿主细胞被本发明的核酸分子和/或载体转化或转染。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。
77.本发明提供的抗体或其抗原结合片段可以利用本领域已知的任何方法获得。例如，可以先由本发明提供的核酸分子获得所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区，或者获得所述抗体的重链和/或轻链，然后与所述抗体的任选其他结构域组装成抗体；或者，在允许本发明提供的宿主细胞表达所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区或者所述抗体的重链和/或轻链以组装成所述抗体的情况下，培养所述宿主细胞。任选地，所述方法还包括回收产生的抗体的步骤。
78.本发明提供的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体和/或宿主细胞可以被包含在组合物中，更特别地被包含在药物组合物、例如药物制剂中，从而根据实际需要用于各种目的。因此，在又一方面，本发明还提供一种组合物，优选药物组合物，所述组合物包含本发明所述的抗体或其片段、核酸分子、载体和/或宿主细胞，以及任选的药学上可接受的辅料。
79.再一方面，本发明还提供所述抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物在制备用于预防、治疗或改善炎症或过敏性疾病的药物中的用途，所述疾病包括自身免疫学疾病，例如过敏性皮炎、哮喘、嗜酸性粒细胞食管炎、湿疹、过敏性鼻炎、鼻息肉、类风湿性关节炎等。
80.另一方面，本发明还提供一种预防、治疗或改善炎症或过敏性疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用本发明的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物，所述疾病包括自身免疫学疾病，例如过敏性皮炎、哮喘、嗜酸性粒细胞食管炎、湿疹、过敏性鼻炎、鼻息肉、类风湿性关节炎等。优选地，所述受试者为哺乳类动物；更优选地，所述受试者为人。
81.基于本发明提供的人il-4r的α链(il-4rα)中的特定表位，本发明还提供所述特定表位在制备结合人白细胞介素4受体(il-4r)、优选il-4rα的结合剂(例如，抗体)中的用途，其中所述表位包括选自seq id no：1所示氨基酸序列中的氨基酸残基d92、v94、d97、l67、l68、a96、h156、c207、q63和l64中的一个或多个。
82.优选地，所述表位包括seq id no：1所示氨基酸序列中的氨基酸残基d92、v94和d97中的一个或多个。
83.根据本发明的具体实施方式，所述表位包括seq id no：1所示氨基酸序列中的如下氨基酸残基：
84.(1)d92；
85.(2)d97；
86.(3)d92、v94和d97；
87.(4)d92和v94；
88.(5)d92和d97；或
89.(6)v94和d97。
90.和/或，所述表位包括seq id no：1所示氨基酸序列中的如下氨基酸残基：(i)q63
和l64。
91.和/或，所述表位包括seq id no：1所示氨基酸序列中的氨基酸残基l67、l68和a96中的一个或多个。
92.优选地，所述表位包括seq id no：1所示氨基酸序列中的如下氨基酸残基：
93.①
l67和l68；
94.②
l67、l68和a96；或
95.③
a96。
96.根据本发明的具体实施方式，所述表位包括seq id no：1所示氨基酸序列中的如下氨基酸残基：
97.(a)l67、l68、a96、h156和c207；
98.(b)a96、h156和c207；
99.(c)l67、l68、h156和c207；
100.(d)l67、l68、a96和c207；或
101.(e)l67、l68、a96和h156。
102.特别优选地，本发明的表位包括seq id no：1所示氨基酸序列中的如下氨基酸残基：
103.(p-1)d97、l67和l68；
104.(p-2)d97、l67、l68、a96和d92；
105.(p-3)d97、l67、l68和d92；
106.(p-4)d97、q63和l64；
107.(p-5)d97、q63、l64和d92；
108.(p-6)d97、q63、l64、d92和a96；或
109.(p-7)d97、q63、l64、l67和l68。
110.实验证明，本发明提供的抗体或其抗原结合片段对人白细胞介素4受体(il-4r)的结合表位位于人il-4r的α链(il-4rα)，并且所述表位包括选自seq id no：1所示氨基酸序列中的氨基酸残基d92、v94、d97、l67、l68、a96、h156、c207、q63和l64中的一个或多个。在此之前，对sil-4rα在免疫效应中的表位研究较少，而本发明首次明确了抗il-4r抗体与il-4r结合的关键位点。
111.因此，本发明提供了具有全新的il-4r结合表位的抗人il-4r、特别是il-4rα的抗体，该抗体可以作为预防、治疗或改善炎症或过敏性疾病的新型有效抗体。并且，通过本发明抗体与人il-4rα结合的关键位点的阐明，本发明为开发针对il-4r、特别是人il-4rα潜在抗体或药物提供了另一途径。
附图说明
112.以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
113.图1示出人l-4rα(序列_1；seq id no：1)和猴l-4rα(序列_0；seq id no：2)的序列比对结果。
114.图2示出本发明抗体的稳定性，其中图2a为40℃放置2周后的结果，图2b为40℃放置4周的结果。
具体实施方式
115.在本发明中，术语“表位”是指抗体或其片段与抗原结合时结合部位所对应的抗原氨基酸残基及其在抗原序列中的相应位置；并且，如通过本技术下文“(一)结合活性检测方法”所述操作过程测得的，突变所述表位位置的氨基酸残基将导致结合活性的下降大于102ng/ml或失去结合活性。
116.本发明中涉及以下实验操作或定义。应注意，本发明还可采用本领域其他常规技术进行实施，并不仅限于以下实验操作。
117.(一)结合活性检测方法
118.1、试剂的配制
119.抗原的的配制：使用pbs将抗原配制成100ug/ml溶液，分装后于-20℃冰箱中保存。
120.待测抗体的准备：使用含1％bsa的pbs将待测抗体稀释至所需浓度：0、0.032、0.16、0.8、4、20、100、500、2500ng/ml。
121.二抗工作溶液的配制：使用含1％bsa的pbs将二抗母液(goat anti-human igg-fc secondary antibody(hrp)，sino biological，cat number：ssa001)稀释16000倍，即为工作溶液。例如取1ul二抗母液加入到15999ul的1％bsa的pbs中，反复上下颠倒混匀。可根据实验需求等比例放大，配制所需体积的二抗工作溶液。
122.2、elisa检测
123.取50ul 100ug/ml抗原溶液，加入到9.95ml pbs中，上下颠倒混匀，即为0.5ug/ml抗原包被液。将配好的抗原包被液加入到加样槽中，使用12通道移液器(rainin)加入96-well酶标板(corning)中，每孔100ul。将96-well酶标板用保鲜膜包裹(或加盖)后，4℃冰箱中孵育过夜。第二天，将96-well酶标板取出，弃去其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。向96-well酶标板中逐排加入pbs，每孔300ul。室温静置3min，弃溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。重复洗涤3次。向96-well酶标板中逐排加入含2％bsa的pbs，每孔300ul。将酶标板用保鲜膜包裹(或加盖)后，于37℃恒温培养箱中孵育2h。将96-well酶标板取出，弃去其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。向96-well酶标板中逐排加入含0.05％tween-20(beyotime，cat number：st825)的pbs，每孔300ul。室温静置3min，弃溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。重复洗涤3次。
124.将稀释好的待测抗体分别依次加入到相应的孔中，每个样品做三个复孔，每孔100ul。将酶标板用保鲜膜包裹(或加盖)后，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。将96-well酶标板取出，弃去其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。向96-well酶标板中逐排加入含0.05％tween-20的pbs，每孔300ul。室温静置3min，弃溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。重复洗涤3次。向96-well酶标板中逐排加入二抗工作溶液，每孔100ul。将酶标板用保鲜膜包裹(或加盖)后，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。将96-well酶标板取出，弃去其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。向96-well酶标板中逐排加入含0.05％tween-20的pbs，每孔300ul。室温静置3min，弃溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。重复洗涤3次。向96-well酶标板中逐排加入tmb溶液(surmodics，cat number：tmds-1000-01)，每孔100ul。置于37℃恒温培养箱中放置5分钟，立即向96-well酶标板中加入2m h2so4溶液终止反应。将96-well酶标板置于flexstation 3(molecular devices)中，读取od450的值，数据收集计算分析。
125.(二)细胞功能活性检测方法
126.1、试剂的配制
127.人il-4(invivogen，货号：rhil-4)的配制：使用pbs将人il-4配制成100ug/ml溶液，分装后于-20℃冰箱中保存。
128.quanti-blue(i)溶液的配制：将一包quanti-blue粉末倒入一个无菌的250ml瓶子里，加入100ml无菌水，轻轻混匀，37℃温浴30min，完全溶解后，在4℃冰箱避光放置过夜，然后按10ml每支分装，于-20℃避光保存，可保存6个月。
129.待测抗体的准备：用含10％fbs(hyclone，cat no.sv30184.02)的dmem培养基(hyclone，cat no.sh30022.01)将抗体稀释至所需浓度(1000、200、40、8、1.6、0.32、0.064、0.0128、0.00256、0ng/ml)。
130.2、细胞培养
131.在液氮中取出冻存的hek blue il-4/il13(invivogen，cat no.hkb-i1413)细胞，在37℃水浴中不停轻柔震荡，使其迅速溶解。将溶解后的细胞悬液移至15ml离心管内，加dmem培养基(含10％fbs，10μg/ml blasticidin，100μg/ml zeocin，100μg/ml normocin)至10ml，800rpm离心5min，吸去上清，保留细胞沉淀，重复洗涤一次，加入10ml dmem培养基，调整细胞密度为1
×
10
5-1
×
106个/ml，移至t75细胞培养瓶(nunc)中，置于37℃，5％co2培养箱(thermo)中静置培养。每隔2-3天，取细胞悬液，800rpm离心5min，用10ml培养基重悬细胞，计数细胞1
×
106个细胞移入新的t75细胞瓶中，同时补加培养基至10ml，连续传代2-3次，至细胞状态良好(细胞透亮，单一贴壁的梭状细胞)后可进行实验。
132.3、阻断实验
133.取t75细胞瓶中生长状态良好细胞，弃上清，用10ml pbs将贴壁细胞轻轻吹打下来，移入15ml离心管内，800rpm离心5min，取细胞沉淀，再次用10ml pbs重悬细胞，800rpm离心5min，弃上清，取细胞沉淀。用5ml含10％fbs的dmem培养基重悬细胞，细胞计数后，补加培养基，调整细胞密度至6.6
×
105个/ml。将细胞悬液按每孔30ul体积加入384孔板内。将准备好的不同浓度的抗体10ul加入384孔的细胞内(3个重复孔)。用含10％fbs的dmem培养基稀释人il-4至2.5ng/ml。将2.5ng/ml的人il-4按照10ul每孔的体积分别加入384孔板上对应的细胞孔内，使得每孔中最终的细胞数量为2
×
104个，人il-4终浓度为0.5ng/ml，最终384孔板每孔体积为50ul。将384孔细胞板置于37℃，5％co2培养箱中静置培养。
134.4、数据统计
135.384孔细胞板在5％co2培养箱中静置培养22h后，在新的384孔板中每孔加入45ul的quanti-blue试剂。将之前孵育了22h的板子里每孔吸取5ul上清加入到新的384孔板对应的孔中。37℃静置孵育60min。将384孔板置于flexstation iii中，读取od650的值，数据收集计算分析。
136.以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
137.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中：
138.人sil-4rα：np_000409.1，met1-his232，见seq id no：1；
139.猴sil-4rα：ehh60265.1，met1-arg232，见seq id no：2。
140.实施例1鼠抗、嵌合抗体、人源化抗体的制备
141.使用人sil-4rα(seq id no：1)免疫十只小鼠，采血，进行如上(一)结合活性和(二)细胞功能活性检测。综合两种检测的结果，选择结果最好的两只小鼠分别进行融合。
142.将融合得到的多组细胞上清再次进行如上(一)结合活性和(二)细胞功能活性检测，综合两种检测的结果，筛选出活性最高的母克隆进行亚克隆，经(一)结合活性和(二)细胞功能活性检测，最终筛选得到14株单克隆鼠源抗体。对这14株单克隆进行测序，为9对全新序列的抗体，其对应的重链可变区和轻链可变区见下；采用imgt工具划分的cdr以下划线示出。
143.y0188-1
144.重链可变区(seq id no：3)
[0145][0146][0147]
轻链可变区(seq id no：4)
[0148][0149]
y0188-2
[0150]
重链可变区(seq id no：5)
[0151][0152]
轻链可变区(seq id no：6)
[0153][0154]
y0188-3
[0155]
重链可变区(seq id no：7)
[0156][0157]
轻链可变区(seq id no：8)
[0158][0159]
y0188-4
[0160]
重链可变区(seq id no：9)
[0161][0162]
轻链可变区(seq id no：10)
[0163][0164]
y0188-6
[0165]
重链可变区(seq id no：11)
[0166][0167]
轻链可变区(seq id no：12)
[0168][0169]
y0188-8
[0170]
重链可变区(seq id no：13)
[0171][0172]
轻链可变区(seq id no：14)
[0173][0174]
y0188-9
[0175]
重链可变区(seq id no：15)
[0176][0177]
轻链可变区(seq id no：16)
[0178][0179]
y0188-10
[0180]
重链可变区(seq id no：17)
[0181][0182]
轻链可变区(seq id no：18)
[0183][0184]
y0188-14
[0185]
重链可变区(seq id no：19)
[0186][0187]
轻链可变区(seq id no：20)
[0188][0189]
根据上述可变区序列进一步构建得到9个嵌合抗体，采用seq id no：71所示序列作为重链恒定区编码序列，seq id no：72所示序列作为轻链恒定区编码序列，表达纯化这9个嵌合抗体，以鼠抗名称加上q进行命名，使用上文“(二)细胞功能活性检测方法”所述操作过程检测嵌合抗体的ic50，用biacore检测嵌合抗体与人sil-4rα的亲和力kd，结果见下表1。
[0190]
表1.嵌合抗体的细胞功能活性和亲和力检测结果
[0191]
嵌合抗体ic50(ng/ml)kd(m)y0188-1q242.62.96e-09y0188-2q283.22.31e-09y0188-3q231.23.20e-09y0188-4q1309.04.91e-09y0188-6q121.64.05e-09y0188-8q239.72.72e-09y0188-9q357.83.67e-09y0188-10q130.94.17e-09y0188-14q30.182.91e-09
[0192]
选择14号克隆的嵌合抗体(y0188-14q)进行人源化，得到7条人源化的重链可变区和7条人源化的轻链可变区。人源化的重链可变区和轻链可变区见下；采用imgt工具划分的cdr以下划线示出。
[0193]
重链可变区：
[0194]
＞hv3-15-14h(seq id no：21)
[0195][0196]
＞hv3-48-14h(seq id no：22)
[0197][0198]
＞hv3-73*2-14h(seq id no：23)
[0199][0200]
＞hv3-72-14h(seq id no：24)
[0201][0202]
＞y01-14h(seq id no：25)
[0203][0204]
＞162-14h(seq id no：26)
[0205][0206]
＞vh73-14h(seq id no：27)
[0207][0208]
轻链可变区：
[0209]
＞y01-14l(seq id no：28)
[0210][0211][0212]
＞164-14l(seq id no：29)
[0213][0214]
＞kv4-14l(seq id no：30)
[0215][0216]
＞kv1-27-14l(seq id no：31)
[0217][0218]
＞kv1-9-14l(seq id no：32)
[0219][0220]
＞kv1-nl1-14l(seq id no：33)
[0221][0222]
＞kv1d-43-14l(seq id no：34)
[0223][0224]
将上述轻重链人源化序列两两相互搭配，并采用seq id no：71所示序列作为重链恒定区编码序列，seq id no：72所示序列作为轻链恒定区编码序列，进行表达，然后同样采用上文“(二)细胞功能活性检测方法”所述操作过程检测得到的49个组合抗体的ic50，并且进一步用biacore验证细胞功能活性(kd)，最终优选出6个组合，如表2所示。
[0225]
表2.人源化抗体的细胞功能活性检测结果
[0226][0227][0228]
实施例2结合表位研究
[0229]
2.1抗体与人猴il-4rα结合的种属差异
[0230]
以猴sil-4rα(ehh60265.1，met1-arg232；seq id no：2)为抗原，采用上文“(一)结合活性检测方法”所述操作检测抗体与抗原的结合活性。
[0231]
2.2抗原序列中的突变位点选择
[0232]
将人和猴的il-4rα进行序列比对，见图1。推测人猴的il-4rα序列存在差异的部分位点有可能是抗体与il-4rα结合的关键位点，使得其与人的差异序列结合，而不与猴的差异序列结合，于是对人的sil-4rα中与猴差异的位点进行单点突变或者组合突变成猴sil-4rα中对应位点上的氨基酸，并且对人猴sil-4rα差异位点附近的非丙氨酸进行选择性单点或者组合突变成丙氨酸，然后构建具有不同突变组合的人sil-4rα突变体(见下表3)，并应用细胞功能活性实验加以验证。
[0233]
表3.人sil-4rα突变蛋白
[0234][0235][0236]
2.3结合活性检测
[0237]
以人sil-4rα蛋白和表3所示的不同sil-4rα突变蛋白为抗原，以6个人源化高活性抗体为一抗，采用上文“(一)结合活性检测方法”所述操作检测抗体与抗原的结合活性。结果见表4。
[0238]
同样地，以人sil-4rα蛋白和表3所示的不同sil-4rα突变蛋白为抗原，以筛选得到的9个嵌合抗体为一抗，同样检测抗体与抗原的结合活性。结果见表5。
[0239]
通过筛选，发现抗体与多个人猴差异位点及其附近位点的sil-4rα突变蛋白的结合活性发生变化甚至反转。
[0240]
[0241][0242]
由表4中数据可知，就l67、l68、a96、h156和c207这五个位点而言，将任一个上的氨基酸残基突变成猴il-4rα中对应位点上的氨基酸后，当突变位点组合中包含l67和l68时，本发明人源化抗体的结合活性显著下降；而同时，当仅l67和l68单独突变时，则本发明人源化抗体保持了原有的结合活性。
[0243]
就d92、v94和d97这三个位点而言，将任一个上的氨基酸残基突变成丙氨酸后，当突变位点组合中包含d97或仅突变d97时，本发明人源化抗体结合活性显著下降。
[0244]
[0245][0246]
由表5中数据可知，就d92、v94和d97这三个位点而言，将任一个上的氨基酸残基突变成丙氨酸后，当突变位点组合中包含d97或仅突变d97时，除y0188-2q和y0188-8q外，其余
嵌合抗体的结合活性显著下降。这一点与上文人源化抗体得到的结合结果一致。
[0247]
而就l67、l68、a96、h156和c207这五个位点而言，将任一个上的氨基酸残基突变成猴il-4rα中对应位点上的氨基酸后，当突变位点组合中包含l67和l68或l67、l68和a96时，嵌合抗体y0188-1q、y0188-3q、y0188-10q结合活性显著下降；而同时，当仅l67和l68单独突变时，则除y0188-2q和y0188-8q外的嵌合抗体均保持了原有的结合活性。此外，就a96而言，当突变位点组合包含a96时，嵌合抗体y0188-3q结合活性均显著下降。
[0248]
而就q63和l64这三个位点而言，将二者同时突变成丙氨酸后，除y0188-1q、y0188-2q和y0188-8q外的嵌合抗体结合活性显著下降、甚至失去结合活性。
[0249]
实施例3抗体稳定性
[0250]
取抗体e5、b5，在10mm histidine，150mm nacl，ph 6中配制浓度分别为0.59mg/ml、0.54mg/ml、6.44mg/ml，分别在40℃放置2周和4周后，使用上文所述“(二)细胞功能活性检测方法”检测过程进行实验，得到抗体浓度与od650的关系曲线图，见图2，然后由此计算ic50(ng/ml)，见下表6。
[0251]
表6.抗体的稳定性结果
[0252]
抗体ic50(ng/ml；2周)ic50(ng/ml；4周)e526.724.4b531.129.1
[0253]
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。