纳米荧光探针、其制备方法及应用与流程

1.本发明涉及纳米材料领域，特别涉及一种纳米荧光探针、其制备方法及应用。


背景技术：

2.血晶素(hematin)又称羟高铁血红素或高铁卟啉，是一种原卟啉和三价铁的络合物。由亚铁血红素氧化生成，而亚铁血红素是血红蛋白的重要组成成分。过量的血红素因为其代谢产物胆红素对大脑和神经系统是有毒物质，对人体健康是有害的。另外，有相关研究表明，高水平的血红素可能导致各种疾病，包括免疫系统失调，血管疾病和真性红细胞增多症等。所以，实现对血红素的灵敏和快速检测是有重大意义的。
3.目前已有的血晶素检测方法有电化学法、质谱分析、比色法、高效液相色谱法等。这些方法要么需要昂贵的仪器支持，要么检测准确度和精度不够。因此，开发新型的血晶素检测探针以及相关方法很有必要。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种纳米荧光探针、其制备方法及应用。
5.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种纳米荧光探针，其通过以下方法制备得到：
6.1)将柠檬酸三钠、fecl3和乙二胺共同溶于乙二醇中，超声搅拌至溶液澄清；
7.2)将步骤1)得到的混合液转移至聚四氟乙烯为内衬的反应釜中，加热条件下反应；
8.3)反应结束后，冷却至室温，将反应后的溶液离心，然后用旋转蒸发仪去除乙二醇；
9.4)将步骤3)得到的溶液用透析袋透析，收集透析袋内溶液，冷冻干燥，得到纯化的碳量子点，即为所述纳米荧光探针。
10.优选的是，其通过以下方法制备得到：
11.1)将1000mg柠檬酸三钠、1000mg fecl3和2ml乙二胺共同溶于30ml乙二醇中，超声搅拌至溶液澄清；
12.2)将步骤1)得到的混合液转移至100ml的聚四氟乙烯为内衬的反应釜中，在烘箱中200℃下反应8小时；
13.3)反应结束后，冷却至室温，将反应后的溶液在10000转/分钟下离心10min，然后用旋转蒸发仪去除乙二醇；
14.4)将步骤3)得到的溶液用截断分子量为1000da的透析袋透析24小时，收集透析袋内溶液，冷冻干燥，得到纯化的碳量子点，即为所述纳米荧光探针。
15.本发明还提供一种如上所述的纳米荧光探针用于血晶素浓度的检测中的应用。
16.优选的是，该纳米荧光探针用于血晶素浓度检测的方法包括以下步骤：
17.1)制定标准曲线：称取干燥的碳量子点，加入超纯水，配置成浓度为c的碳量子点水溶液，等体积分为若干份，在365nm激发条件下，测试每份碳量子点水溶液在450nm处的荧光强度，记为原始荧光强度；
18.在每份碳量子点水溶液中加入不同量的血晶素，从而得到具有不同血晶素浓度的碳量子点水溶液，然后在365nm激发条件下，测试每份碳量子点水溶液在450nm处的荧光强度，记为测量荧光强度；
19.将原始荧光强度和测量荧光强度的比值的以10为底的对数作为y轴，对应的血晶素浓度作为x轴，进行线性拟合，得到表征血晶素浓度与荧光强度关系的标准曲线；
20.2)对待测溶液的血晶素浓度进行检测：称取干燥的碳量子点，加入超纯水，配置成浓度为c的碳量子点水溶液，向其中加入一定体积的待测溶液，在365nm激发条件下，测试得到的混合溶液在450nm处的荧光强度，对照标准曲线，计算出待测溶液中的血晶素浓度。
21.优选的是，该纳米荧光探针用于血晶素浓度检测的方法包括以下步骤：
22.1)制定标准曲线：称取干燥的碳量子点，加入超纯水，配置成浓度为5μg/ml的碳量子点水溶液，等体积分为15份，在365nm激发条件下，测试每份碳量子点水溶液在450nm处的荧光强度，记为原始荧光强度；
23.在15份碳量子点水溶液中分别加入0、1、2、3、4、5、7、9、11、13、15、18、21、24、27μm的血晶素，从而得到具有不同血晶素浓度的碳量子点水溶液，在365nm激发条件下，测试碳量子点水溶液在450nm处的荧光强度，记为测量荧光强度；
24.将原始荧光强度和测量荧光强度的比值的以10为底的对数作为y轴，对应的血晶素浓度作为x轴，进行线性拟合，得到表征血晶素浓度与荧光强度关系的标准曲线；
25.2)对待测溶液的血晶素浓度进行检测：称取干燥的碳量子点，加入超纯水，配置成浓度为5μg/ml的碳量子点水溶液，向其中加入5μl的待测溶液，在365nm激发条件下，测试得到的混合溶液在450nm处的荧光强度，对照标准曲线，计算出待测溶液中的血晶素浓度。
26.优选的是，所述步骤1)中配置得到浓度为5μg/ml的碳量子点水溶液后，先用0.1mol/l naoh溶液调节该碳量子点水溶液的ph值至10.0，然后再等体积分为15份。
27.优选的是，所述步骤2)中，若测得的荧光强度高于标准曲线的范围，则先将待测溶液按照一定倍数稀释后再进行测量，直至测得的荧光强度处于标准曲线的范围内。
28.本发明还提供一种如上所述的纳米荧光探针作为蓝色荧光染料用于荧光成像中的应用。
29.本发明的有益效果是：
30.本发明的开发了一种碳量子点作为所述纳米荧光探针，该碳量子点具有制备方法简单、水溶性好、生物相容性好、无毒副作用等特点，可实现规模化生产；
31.本发明进一步基于血晶素对该碳量子点具有特异性荧光猝灭的性能，提供了一种血晶素的检测方法，通过碳量子点荧光强度的变化，能有效检测血晶素浓度。该方法具有操作简便、精确度高、选择型好等优点；
32.本发明更进一步的基于该碳量子点可成像蓝色荧光且物生物毒性的特点，还提供了一种将该碳量子点作为蓝色荧光染料用于荧光成像中的应用。
附图说明
33.图1为本发明的实施例1制得的碳量子点的透射电镜照片；
34.图2为本发明的实施例1制得的碳量子点的紫外
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可见吸收光谱图和荧光激发光谱图；
35.图3为本发明的实施例1制得的碳量子点的荧光光谱图；
36.图4为本发明的实施例1制得的碳量子点的红外图谱；
37.图5为血晶素对本发明的实施例1制得的碳量子点的淬灭结果；
38.图6为血晶素对本发明的实施例1制得的碳量子点的特异性猝灭的干扰实验结果；
39.图7为血晶素对实施例1制得的碳量子点的荧光猝灭的机理分析示意；
40.图8为本发明的实施例1制得的碳量子点对细胞的毒性实验结果；
41.图9为本发明的实施例3中获得的标准曲线；
42.图10为本发明的实施例1制得的碳量子点和lyso
‑
tracker red对hela细胞的荧光成像图片。
具体实施方式
43.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
44.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
45.实施例1
46.本实施例的一种纳米荧光探针，其通过以下方法制备得到：
47.1)将1000mg柠檬酸三钠、1000mg fecl3和2ml乙二胺共同溶于30ml乙二醇中，超声并剧烈搅拌至溶液澄清；
48.2)将步骤1)得到的混合液转移至100ml的聚四氟乙烯为内衬的反应釜中，在烘箱中200℃下反应8小时；
49.3)反应结束后，冷却至室温，将反应后的溶液在10000转/分钟下离心10min，去除大颗粒沉淀，然后用旋转蒸发仪去除乙二醇；
50.4)将步骤3)得到的溶液用截断分子量为1000da的透析袋透析24小时，去除未反应的原料小分子，然后收集透析袋内溶液，冷冻干燥，得到纯化的碳量子点，即为所述纳米荧光探针。
51.实施例2
52.对实施例1制得的碳量子点进行性能测试
53.参照图1，为实施例1制得的碳量子点的透射电镜照片，从图中可以看出，该碳点呈类球形结构，粒径较为均一，单个尺寸约为3
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5nm，且在水中的分散性非常好。左上角的超分辨tem照片显示，碳点具有明显的晶格结构，晶格间距为0.21nm。
54.参照图2，是实施例1制得的碳量子点的紫外
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可见吸收光谱图和荧光光谱图，其中包括碳量子点的吸收光谱图(曲线1：fe,n
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cds)，碳量子点与血晶素的混合物溶液的吸收光谱图(曲线3：fe,n
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cds hematin)，血晶素的吸收光谱图(曲线2：hematin)，碳量子点的荧光激发光谱图(曲线4：fe,n
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cds ex)；
55.从图中曲线1可以看出，碳量子点在200
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500nm区间都有吸收，主吸收峰位于350nm处；从曲线4可以看出，碳量子点的荧光对应最佳激发波长为365nm。血晶素的紫外吸收光谱表明其在300～420nm附近均有强吸收，因为內滤效应引起碳点荧光淬灭，从而达到检测的目的。由于该碳点的应用场景是生物体或者细胞内的血晶素检测，因此，其良好的荧光性能(蓝色荧光，高量子效率)使其能够在荧光显微镜下被观察到是否进入生物体或者细胞内。
56.参照图3，是实施例1制得的碳量子点的荧光光谱图，可以看出，荧光的发射峰是激发依赖的，最佳激发波长为365nm，最佳发射波长为450nm(明亮的亮光)。
57.参照图4，是实施例1制得的碳量子点的红外图谱，分析透射峰强度可知，该碳量子点表面富含羟基、氨基、羰基以及羧基等基团。
58.参照图5，是血晶素对实施例1制得的碳量子点的淬灭结果，由图5可知，在碳点溶液中加入不同浓度的血晶素，碳点蓝色荧光的强度会随着血晶素浓度的增加而逐步下降，在0.005mg/ml的碳点溶液中，当血晶素浓度达到27μm时，碳点的荧光强度下降幅度为82％。
59.参照图6，为其他生物小分子以及阴离子对实施例1制得的碳量子点对血晶素的特异性猝灭的干扰实验结果，本实施例中，在碳点的干扰实验中，除了血晶素，还检测了其他离子和小分子的荧光淬灭情况，包括溴离子、氯离子、碳酸根离子、碳酸氢根离子、硝酸根离子、硫酸根离子、过氧化氢、加入辣根过氧化酶的过氧化氢、精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷胱甘肽、抗坏血酸(vc)、葡萄糖(glucose)和牛血红蛋白(hb)。从图6的结果可知，血晶素对碳点荧光强度的淬灭率达到了82％，其他除牛血红蛋白有轻微干扰外(淬灭约18％)，其他离子和生物小分子均对检测没有明显干扰。因此，可以说血晶素对碳点的荧光猝灭是特异性的，几乎不受其他离子及分子的干扰。图6中，f0和f分别表示：不加干扰物的碳量子点溶液的荧光强度和加入干扰物的碳量子点溶液的荧光强度。
60.参照图7，为血晶素对实施例1制得的碳点的荧光猝灭的机理分析示意，首先，本发明的碳点是由乙二胺和柠檬酸三钠以及fecl3合成的，合成的碳点发射明亮的蓝光(发射波长450nm，量子效率28％)。然而碳点的最佳发射波长所对应的最佳激发波长位于365nm，而血晶素在365nm处有强吸收。血晶素与碳点对激发光的竞争作用，大幅度减弱了作用于碳点的激发光强度，最终体现为荧光淬灭。而该碳点除此之外，对过氧化氢和谷胱甘肽等物质有非常好的稳定性，所以利用该碳点对血晶素进行检测是灵敏且特异性很高的。
61.参照图8，为实施例1制得的碳点对细胞的毒性实验结果，本实施例中使用wst
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1试剂盒以hela细胞作为实验对象，横坐标代表加入碳点的浓度，纵坐标代表细胞活力。从图中可以看出，即使在高浓度下(500μg/ml)，碳点对细胞的毒性也非常小(细胞活性仍高于95％)；在低浓度下(100μg/ml以下)，碳点对细胞有略微影响(细胞活性仍高于92％)。事实上，正常实验用的碳点浓度都低于100μg/ml，因此可以认为该碳点本身是无毒的。
62.实施例3
63.本实施例提供一种实施例1制得的碳量子点用于血晶素浓度的检测中的应用。
64.该纳米荧光探针用于血晶素浓度检测的方法包括以下步骤：
65.1)制定标准曲线：称取干燥的碳量子点，加入超纯水，配置成浓度为5μg/ml的碳量子点水溶液，用0.1mol/l naoh溶液调节该碳量子点水溶液的ph值至10.0，等体积分为15份，在365nm激发条件下，测试每份碳量子点水溶液在450nm处的荧光强度，记为原始荧光强度；
66.在15份碳量子点水溶液中分别加入0、1、2、3、4、5、7、9、11、13、15、18、21、24、27μm的血晶素，从而得到具有不同血晶素浓度的碳量子点水溶液，在365nm激发条件下，测试碳量子点水溶液在450nm处的荧光强度，记为测量荧光强度；
67.将原始荧光强度和测量荧光强度的比值的以10为底的对数作为y轴，对应的血晶素浓度作为x轴，进行线性拟合，得到表征血晶素浓度与荧光强度关系的标准曲线；参照图9，为本实施例中获得的标准曲线，在血晶素浓度为0～27μm区间，碳点的荧光下降程度比值的对数与血晶素浓度呈线性关系，相关系数r2达到0.999，说明该碳点能够应用于溶液中血晶素浓度的检测。
68.2)对待测溶液的血晶素浓度进行检测：称取干燥的碳量子点，加入超纯水，配置成浓度为5μg/ml的碳量子点水溶液，向其中加入5μl的待测溶液，在365nm激发条件下，测试得到的混合溶液在450nm处的荧光强度，对照标准曲线，计算出待测溶液中的血晶素浓度。
69.所述步骤2)中，若测得的荧光强度高于标准曲线的范围，则先将待测溶液按照一定倍数稀释后再进行测量，直至测得的荧光强度处于标准曲线的范围内。若测得的荧光强度低于标准曲线的范围，表明未知溶液的血晶素浓度过低，无法检测。
70.实施例4
71.本实施例提供一种实施例1制得的碳量子点作为蓝色荧光染料用于荧光成像的应用。
72.参照图10，为碳量子点和lyso
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tracker red对hela细胞的荧光成像图片，其中，图10(a)为碳点对hela细胞的荧光成像照片(碳点呈现蓝色荧光)，图10(b)图为lyso
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tracker red对hela细胞线溶酶体成像照片(lyso
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tracker red呈现红色荧光)，图10(c)为图10(a)和图10(b)的叠加结果(叠加后呈现紫色荧光)。由图10可知，碳点可以轻松进入hela细胞并大部分富集在溶酶体内，在荧光显微镜下呈现蓝色的荧光。说明该碳点可作为一种无毒、水溶性、生物相容性的蓝色荧光染料，且有选择性的富集在溶酶体内，有望在荧光成像方面得到更多的应用。
73.尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。