苏丹黑B2染料及染色液、使用其的检测方法、含有其的凝胶电泳体系、试剂盒及制备方法与流程

苏丹黑b2染料及染色液、使用其的检测方法、含有其的凝胶电泳体系、试剂盒及制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，具体为一种苏丹黑b2染料及染色液、使用其的检测方法、含有其的凝胶电泳体系、试剂盒、制备方法及应用。


背景技术：

2.目前，对于脂代谢的检测，大部分试剂盒采用单项进行检测，或者采用血脂四项同时进行检测，但其中低密度脂蛋白的含量主要通过公式进行计算，常常会导致低密度脂蛋白定量检测结果的不准确；对于亚型的检测，主要用核磁共振，非变性梯度凝胶电泳、密度梯度离心等方法，这些方法费时费力，试验过程不好控制，需要大型仪器极高技能的专业人士进行操作。
3.此外，有部分使用凝胶电泳方法检测脂蛋白亚分型，但由于常规使用的苏丹黑b为重氮染料，能使中性脂肪呈蓝黑色，显示磷脂效果最好；而脂蛋白中各个亚型高密度、低密度等的主要成分有差异，所以苏丹黑b与脂蛋白的各个亚型的结合不均一，导致染色结果的差异很大，造成不能很好的同时定性检测脂蛋白各个亚分型，包括高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及极低密度脂蛋白。同时，由于苏丹黑b需要在37℃下进行染色，不易操作，容易导致实验结果不准确。针对上述问题，目前还没有很好的解决方案。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种苏丹黑b2染料及染色液、使用其的检测方法、含有其的凝胶电泳体系、试剂盒、制备方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：根据本发明的一个方面， 提供一种苏丹黑b2染料，所述苏丹黑b2由苏丹黑b的结构改造获得，其具有如下所示的结构：。
6.根据本发明的一个方面，提供一种苏丹黑b2染色液，包含上述的苏丹黑b2染料。
7.根据本发明的一个方面，提供上述染色液的制备方法，包括下列步骤：取浓度为质量体积比0.1
‑
1.5%的上述的苏丹黑b2染料，将所述苏丹黑b2加入到选自丙酮、丙二醇、异丙醇和乙二醇组合中的一种中，以加入的丙酮或丙二醇或异丙醇或乙二醇的总体积计，其中含有的丙酮或丙二醇或异丙醇或乙二醇的体积百分比范围为大于等于98.0%并小于等于99.3％；在其中加入体积比为0.5
‑
1.5%的n,n
‑
二甲基甲酰胺（n,n
‑
dimethylformamide, dmf）或1
‑
甲基
‑
2吡咯烷酮；再在其中加入辛基酚类聚氧乙烯醚表面活性剂（triton x
‑
405）、聚乙二醇辛基苯基醚、吐温三者中的一种作为表面活性剂，所述表面活性剂的使用体积比为0.05
‑
0.5%（v/v）；将上述混合溶液充分混合后，避光保存，即获得所述染色液。
8.根据本发明的一个方面，提供一种脂蛋白亚分型定量检测方法，所述脂蛋白亚分型包括极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein, vldl）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein, ldl）及其1
‑
7亚分型、高密度脂蛋白（high density lipoprotein, hdl），所述检测方法按照下列步骤进行：s01：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对血清或血浆中的脂蛋白进行分离；s02：将所述血清或血浆中的脂蛋白用上述染料或上述的染色液或上述制备方法制得的染色液染色后，取混合液30μl加入到凝胶柱上；s03：在电泳槽中的电场作用下，经过聚丙烯酰胺凝胶分子筛效应，脂蛋白亚分型按照脂蛋白颗粒大小依次被分离开来；s04：所述脂蛋白亚分型电泳分离的结果经电泳装置的扫描系统得到脂蛋白电泳条带的光密度图谱；s05：将所述光密度图谱通过分析软件转换为峰型图谱，并进行所述峰型图谱中各峰型面积比例分析；s06：根据检测到的总胆固醇含量和所述各峰型面积的比例得到脂蛋白亚分型各组分的准确含量。
9.根据本发明的一个方面，提供一种检测试剂盒，包含上述的苏丹黑b2染料或上述的染色液或上述制备方法制得的染色液。
10.进一步地，所述试剂盒还包括凝胶柱，所述凝胶柱分为上下两层，其中，上层凝胶柱的浓度为2.7
‑
3.0 wt%聚丙烯酰胺，下层凝胶柱的浓度为3.4
‑
3.8 wt%聚丙烯酰胺，其中，所述聚丙烯酰胺包含丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺，所配制的凝胶液的主要组成成分为：丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、n,n,n',n'
‑
四甲基二乙胺、过硫酸铵及蔗糖、proclin300；优选的，所述上层凝胶柱的使用体积为140
‑
200μl，所述下层凝胶柱的使用体积为1.2
‑
1.6 ml，所述三羟甲基氨基甲烷的使用量浓度为质量体积比0.2
‑
2%，所述蔗糖的使用浓度为质量体积比0.5
‑
2%，所述n,n,n',n'
‑
四甲基二乙胺的使用浓度为体积比0.3
‑
2%, 所述凝胶液的ph值为6.8
±
0.2，所述proclin300的浓度为体积比0.05
‰‑5‰
；优选的，所述试剂盒还包括电泳缓冲体系；优选的，所述试剂盒还包括质控品，更优选的，所述质控品包括质控品1和质控品2。
11.进一步地，所述检测试剂盒应用上述的脂蛋白亚分型定量检测方法。
12.根据本发明的一个方面，提供上述的检测试剂盒的制备方法，包括下列步骤：步骤（1），配液，将丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、n,n,n',n'
‑
四甲基二乙胺过硫酸铵、蔗糖、proclin300按照实际的使用浓度，加入到纯净水或去离子水中，充分搅拌均匀后，调节ph值，加入1.2
‑
1.6 ml到玻璃柱内，加入水或者乙醇进行压胶，时间不低于40分钟，成胶后得到聚丙烯酰胺含量为3.4
‑
3.8 wt%的凝胶柱，即为下层凝胶柱；步骤（2），配液，将丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、n,n,n',n'
‑
四甲基二乙胺、过硫酸铵、蔗糖、proclin300按照实际的使用浓度，加入到纯净水或去离子水中，充分搅拌均匀后，调节ph值，加入140
‑
200μl到玻璃柱内，加入水或者乙醇进行压胶，时间不低于40分钟，成胶后得到聚丙烯酰胺含量为2.7
‑
3.0wt%的凝胶柱，即为上层凝胶柱；步骤（3），将步骤（1）和（2）所得的凝胶柱放入到广口塑料瓶中，加入储存缓冲液；步骤（4），配液，取浓度为质量体积比0.1
‑
1.5%的上述的染料苏丹黑b2加入到选自丙酮、丙二醇、异丙醇和乙二醇组合中的一种中，以所述加入的丙酮或丙二醇或异丙醇或乙二醇的总体积计，其中含有的所述丙酮或丙二醇或异丙醇或乙二醇的体积百分比范围为大于等于98.0%并小于等于99.3％；在其中加入dmf或1
‑
甲基
‑
2吡咯烷酮，体积比为0.5
‑
1.5%；再在其中加入辛基酚类聚氧乙烯醚表面活性剂（triton x
‑
405）、聚乙二醇辛基苯基醚、吐温三者中的一种作表面活性剂，所述表面活性剂的使用体积比为0.05
‑
0.5%（v/v）；将上述混合溶液充分混合后，分装，避光保存；步骤（5），电泳缓冲粉的混合，其中，三羟甲基氨基甲烷的用量为5 g/l
‑
15 g/l,硼酸用量为3 g/l
‑
10 g/l；将上述两种物料通过搅拌机进行搅拌混匀，按照16.5 g/瓶的用量，将混合后的混合物进行分装到玻璃瓶中；步骤（6），质控的配制，将收到的样本，通过安全性检测后，进行56℃灭活30分钟，混合后，在进行检测赋值，分装作为质控，每支分装100μl；步骤（7）,将所述步骤（3）、（4）、（5）、（6）的组份进行贴签；所得的半成品进行检验；步骤（8），将步骤（7）检验合格的所述半成品进行装盒，即得所述检测试剂盒；优选的，所述制备方法还包括下列步骤：步骤（9），将步骤（8）所得的所述检测试剂盒进行成品检；步骤（10），将步骤（9）检验合格的所述成品贴合格签后入库。
13.根据本发明的一个方面，提供一种凝胶电泳体系，所述凝胶电泳体系应用上述的定量检测方法，使用上述的苏丹黑b2染料或上述的染色液或上述制备方法制得的染色液。
14.进一步地，所述凝胶电泳体系还包括凝胶柱，所述凝胶柱分为上下两层，其中，上层凝胶柱的浓度为2.7
‑
3.0 wt%聚丙烯酰胺，下层凝胶柱的浓度为3.4
‑
3.8 wt%聚丙烯酰胺，其中，所述聚丙烯酰胺包含丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺，所配制的凝胶液的主要组成成分为：丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、n,n,n',n'
‑
四甲基二乙胺、过硫酸铵及蔗糖、proclin300；优选的，所述上层凝胶柱的使用体积为140
‑
200μl，所述下层凝胶柱的使用体积为1.2
‑
1.6 ml，所述三羟甲基氨基甲烷的使用量浓度为质量体积比0.2
‑
2%，所述蔗糖的使用浓度为质量体积比0.5
‑
2%，所述n,n,n',n'
‑
四甲基二乙胺的使用浓度为质量体积比0.3
‑
2%, 所述凝胶液的ph值为6.8
±
0.2，所述proclin300的浓度为体积比0.05
‰‑5‰
。
15.根据本发明的一个方面，提供上述的苏丹黑b2染料、上述苏丹黑b2染色液、上述制备方法所制得的染色液、上述检测试剂盒及上述凝胶电泳体系在脂蛋白亚分型的定量检测中的应用。
16.进一步地，所述脂蛋白亚分型包括极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein, vldl）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein, ldl）及其1
‑
7亚分型、高密度脂蛋白（high density lipoprotein,hdl）。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、通过本发明的技术方案，能够提供一种新改良的苏丹黑b的衍生物苏丹黑b2染料，通过对苏丹黑b进行改性及上下层胶的优化，大大提高了染料的脂溶性，使得染料和脂蛋白的结合条件更简单，结合时间更短，染色效果及染色效率更高，常温下15分钟即可；2、通过本发明的技术方案，对低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的检测，与其它试剂的检测的低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白含量结果更为接近；3、通过本发明的技术方案，有效的降低了脂蛋白组份的异质性导致的分辨率降低，可以准确区分各脂蛋白组份，包括高密度脂蛋白hdl、低密度脂蛋白ldl和极低密度脂蛋白vldl；4、通过本发明的技术方案，能够对脂蛋白亚分型的定量检测及对低密度脂蛋白组分的分析，可用于脂代谢的评估，通过对脂代谢的评估进一步可判断心脑血管疾病风险。
附图说明
18.图1为本发明具体实施方式中苏丹黑b改造前后的结构式。其中，1a为苏丹黑b，1b为苏丹黑b衍生物苏丹黑b1,1d为苏丹黑b衍生物苏丹黑b3,1e为标注r1、r2位置的苏丹黑b及其衍生物的结构通式，1c为苏丹黑b2，系本发明技术方案提供的染料；图2为本发明具体实施方式中苏丹黑b与苏丹黑b2染料与样本染色扫描图；图3为本发明具体实施方式中配制的苏丹黑b（批号1）与1#样本反应后分析结果；图4为本发明具体实施方式中配制的苏丹黑b（批号1）与2#样本反应后分析结果；图5为本发明具体实施方式中配制的苏丹黑b（批号2）与1#样本反应后分析结果；图6为本发明具体实施方式中配制的苏丹黑b（批号2）与2#样本反应后分析结果；图7为本发明具体实施方式中配制的苏丹黑b2染色液与1#样本反应后分析结果；图8为本发明具体实施方式中配制的苏丹黑b2染色液与2#样本反应后分析结果；图9为本发明具体实施方式中实施案例7中，苏丹黑b2染色液与12份临床样本反应后的扫描图；图10为本发明具体实施方式中实施案例7中，用长沙中生众捷生物技术有限公司生产的脂类多项测试卡（干化学）对图9中的12份临床样本检测的结果；图11为本发明具体实施方式中实施案例7中，12份临床样本检测的结果；图12
‑
图23为本发明具体实施方式中实施案例7中，12份临床样本用本发明检测后的分析结果，其中，图12为本发明试剂盒检测分析8021#样本的分析图，图13：本发明试剂盒检测分析8008#样本的分析图，图14：本发明试剂盒检测分析7122#样本的分析图，图15本发明试剂盒检测分析7117#样本的分析图，图16本发明试剂盒检测分析7103#样本的分析图，
图17本发明试剂盒检测分析7103#样本的分析图，图18本发明试剂盒检测分析7037#样本的分析图，图19 本发明试剂盒检测分析4109#样本的分析图，图20本发明试剂盒检测分析4087#样本的分析图，图21本发明试剂盒检测分析4080#样本的分析图，图22本发明试剂盒检测分析1068#样本的分析图，图23本发明试剂盒检测分析1008#样本的分析图；图24为本发明具体实施方式中实施案例7中，本发明检测的vldl与商用试剂盒检测到的甘油三酯结果的相关性；图25为本发明具体实施方式中实施案例7中，本发明检测的ldl与商用试剂盒检测到的ldl结果的相关性；图26为本发明具体实施方式中实施案例7中，本发明检测的hdl与商用试剂盒检测到的hdl结果的相关性；图27为本发明具体实施方式实施案例14中，苏丹黑b与3份样本染色30分钟与苏丹黑b2染料与3份样本染色15分钟后染色效果电泳扫描对比图；图28为本发明具体实施方式中实施案例16中，用苏丹黑b与样本1#反应后分析的结果；图29为本发明具体实施方式中实施案例16中，用苏丹黑b2染色液与样本1#反应后分析的结果；图30为本发明具体实施方式中实施案例16中，用苏丹黑b与样本2#反应后分析的结果；图31为本发明具体实施方式中实施案例16中，用苏丹黑b2染料与样本2#反应后分析的结果；图32为本发明具体实施方式中实施案例16中，用苏丹黑b与样本3#反应后分析的结果；图33为本发明具体实施方式中实施案例16中，用苏丹黑b2染色液与样本3#反应后分析的结果；图34为本发明具体实施方式中实施案例16中，用苏丹黑b与样本4#反应后分析的结果；图35为本发明具体实施方式中实施案例16中，用苏丹黑b2染色液与样本4#反应后分析的结果；图36为脂蛋白亚分型定量分析结果简要说明。
具体实施方式
19.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.请参阅图1
‑
36，根据本发明的一典型实施方式，提供一种苏丹黑b2染料，其是苏丹黑b的衍生物。苏丹黑b2由苏丹黑b的结构改造获得，具体地说，苏丹黑b2染料是在苏丹黑b的结构r2位置添加一个羟甲基，其具有如下所示的结构：
。根据本发明的一典型实施方式，提供一种苏丹黑b2染色液，包含苏丹黑b2染料。
21.苏丹黑b改造前后的结构式见图1，在苏丹黑b的结构基础上增加特定的化学基团形成的苏丹黑b的衍生物，其中，图1的1a为苏丹黑b的化学结构，图1的1b为苏丹黑b1的化学结构，图1的1c为苏丹黑b2的化学结构, 图1的1d为苏丹黑b3的化学结构，图1的1e为标注r1、r2位置的苏丹黑b及其衍生物的结构通式。在苏丹黑b的结构r1位置添加一个羟乙基变成苏丹黑b1，在苏丹黑b的结构r2位置添加一个羟甲基变成苏丹黑b2，在苏丹黑b的结构r2位置添加一个羟基变成苏丹黑b3；优选的，苏丹黑b的结构r2位置添加一个羟甲基变成苏丹黑b2。
22.根据本发明的一典型实施方式，提供苏丹黑b2染色液的制备方法，包括下列步骤：取浓度为质量体积比0.1
‑
1.5%的上述的苏丹黑b2染料，将所述苏丹黑b2加入到选自丙酮、丙二醇、异丙醇和乙二醇组合中的一种，以加入的丙酮或丙二醇或异丙醇或乙二醇的总体积计，其中含有的丙酮或丙二醇或异丙醇或乙二醇的体积百分比范围为大于等于98.0%并小于等于99.3％；在其中加入体积比为0.5
‑
1.5%的n,n
‑
二甲基甲酰胺（n,n
‑
dimethylformamide, dmf）或1
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甲基
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2吡咯烷酮；再在其中加入辛基酚类聚氧乙烯醚表面活性剂（triton x
‑
405）、聚乙二醇辛基苯基醚、吐温三者中的一种作为表面活性剂，所述表面活性剂的使用体积比为0.05
‑
0.5%；将上述混合溶液充分混合后，避光保存，即获得所述染色液。
23.根据本发明的一典型实施方式，提供一种脂蛋白亚分型定量检测方法，所述脂蛋白亚分型包括极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein, vldl）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein, ldl）及其1
‑
7亚分型、高密度脂蛋白（high density lipoprotein, hdl），所述检测方法按照下列步骤进行：s01：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对血清或血浆中的脂蛋白进行分离；s02：将所述血清或血浆中的脂蛋白用上述染料或上述的染色液或上述制备方法制得的染色液染色后，取混合液30μl加入到凝胶柱上；s03：在电泳槽中的电场作用下，经过聚丙烯酰胺凝胶分子筛效应，脂蛋白亚分型按照脂蛋白颗粒大小依次被分离开来；s04：所述脂蛋白亚分型电泳分离的结果经电泳装置的扫描系统得到脂蛋白电泳条带的光密度图谱；
s05：将所述光密度图谱通过分析软件转换为峰型图谱，并进行所述峰型图谱中各峰型面积比例分析；s06：根据检测到的总胆固醇含量和所述各峰型面积的比例得到脂蛋白亚分型各组分的准确含量。
24.发明人通过反复试验发现：苏丹黑b的衍生物苏丹黑b2染料作为代替苏丹黑的染色液，对脂蛋白亚分型的染色效果更清晰，使得脂蛋白亚分型分离效果更容易、准确，脂蛋白亚分型包括极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein, vldl）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein, ldl）及其1
‑
7亚分型、高密度脂蛋白（high density lipoprotein,hdl）能被清晰分离并定量检测出准确数值。图2中凝胶柱9和凝胶柱10为配制的第一批苏丹黑b与两份样本一起反应15分钟后，电泳后扫描得到图3和图4；图2中凝胶柱11、凝胶柱12为配制的第二批苏丹黑b与相同两份样本一起反应15分钟后，电泳后扫描得到图5和图6；图2中凝胶柱13、凝胶柱14为配制的苏丹黑b2与相同两份样本一起反应15分钟后，电泳后扫描得到图7和图8；苏丹黑b2分别与两份样本染色扫描图，与两个批号的苏丹黑b与两份样本染色扫描图对比图显示，凝胶柱13比凝胶柱9和凝胶柱11染色更深，凝胶柱14比凝胶柱10和凝胶柱12染色更深。苏丹黑b染料和苏丹黑b2所用的染料的摩尔浓度均相同，通过分析软件进行分析，观察图7、图5、图3可以看到中间密度脂蛋白的染色效果更佳。证明苏丹黑b2比苏丹黑b的可以在更短的时间内染色，而且染色效果更佳。
25.根据本发明的一典型实施方式，提供一种检测试剂盒，包含上述的苏丹黑b2染料或上述的染色液或上述制备方法制得的染色液。
26.进一步地，所述试剂盒还包括凝胶柱，所述凝胶柱分为上下两层，其中，上层凝胶柱的浓度为2.7
‑
3.0 wt%聚丙烯酰胺，下层凝胶柱的浓度为3.4
‑
3.8 wt%聚丙烯酰胺，其中，所述聚丙烯酰胺包含丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺，所配制的凝胶液的主要组成成分为：丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、n,n,n',n'
‑
四甲基二乙胺、过硫酸铵及蔗糖、proclin300；优选的，所述上层凝胶柱的使用体积为140
‑
200μl，所述下层凝胶柱的使用体积为1.2
‑
1.6 ml，所述三羟甲基氨基甲烷的使用量浓度为质量体积比0.2
‑
2%，所述蔗糖的使用浓度为质量体积比0.5
‑
2%，所述n,n,n',n'
‑
四甲基二乙胺的使用浓度为体积比0.3
‑
2%, 所述凝胶液的ph值为6.8
±
0.2，所述proclin300的浓度为体积比0.05
‰‑5‰
；优选的，所述试剂盒还包括电泳缓冲体系；优选的，所述试剂盒还包括质控品，更优选的，所述质控品包括质控品1和质控品2。
27.进一步地，所述检测试剂盒应用上述的脂蛋白亚分型定量检测方法。
28.根据本发明的一典型实施例，提供上述的检测试剂盒的制备方法，包括下列步骤：步骤（1），配液，将丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、n,n,n',n'
‑
四甲基二乙胺、、过硫酸铵、蔗糖、proclin300按照实际的使用浓度，加入到纯净水或去离子水中，充分搅拌均匀后，调节ph值，加入1.2
‑
1.6 ml到玻璃柱内，加入水或者乙醇进行压胶，时间不低于40分钟，成胶后得到聚丙烯酰胺含量为3.4
‑
3.8 wt%的凝胶柱，即为下层凝胶柱；步骤（2），配液，将丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、n,n,n',n'
‑
四甲基二乙胺过硫酸铵、蔗糖、proclin300按照实际的使用浓度，加入到纯净水或去离子水中，
充分搅拌均匀后，调节ph值，加入140
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200微升到玻璃柱内，加入水或者乙醇进行压胶，时间不低于40分钟，成胶后得到聚丙烯酰胺含量为2.7
‑
3.0 wt%的凝胶柱，即为上层凝胶柱；步骤（3），将步骤（1）和（2）所得的凝胶柱放入到广口塑料瓶中，加入储存缓冲液；步骤（4），配液，取浓度为质量体积比0.1
‑
1.5%的苏丹黑b2染料加入到选自丙酮、丙二醇、异丙醇和乙二醇组合中的一种中，以所述加入的丙酮或丙二醇或异丙醇或乙二醇的总体积计，其中含有的所述丙酮或丙二醇或异丙醇或乙二醇的体积百分比范围为大于等于98.0%并小于等于99.3％；在其中加入dmf或1
‑
甲基
‑
2吡咯烷酮，体积比为0.5
‑
1.5%；再在其中加入辛基酚类聚氧乙烯醚表面活性剂（triton x
‑
405）、聚乙二醇辛基苯基醚、吐温三者中的一种作表面活性剂，所述表面活性剂的使用体积比为0.05
‑
0.5%（v/v）；将上述混合溶液充分混合后，分装，避光保存；步骤（5），电泳缓冲粉的混合，其中，三羟甲基氨基甲烷的用量为5 g/l
‑
15 g/l,硼酸用量为3 g/l
‑
10 g/l；将上述两种物料通过搅拌机进行搅拌混匀，按照16.5 g/瓶的用量，将混合后的混合物进行分装到玻璃瓶中；步骤（6），质控的配制，将收到的样本，通过安全性检测后，进行56℃灭活30分钟，混合后，在进行检测赋值，分装作为质控，每支分装100μl；步骤（7）,将所述步骤（3）、（4）、（5）、（6）的组份进行贴签；所得的半成品进行检验；步骤（8），将步骤（7）检验合格的所述半成品进行装盒，即得成品检测试剂盒；优选的，所述制备方法还包括下列步骤：步骤（9），将步骤（8）所得的所述成品检测试剂盒进行成品检；步骤（10），将步骤（9）检验合格的所述成品贴合格签后入库。
29.根据本发明的一典型实施方式，提供一种凝胶电泳体系，所述凝胶电泳体系应用上述的定量检测方法，使用上述的苏丹黑b2染料或上述的染色液或上述制备方法制得的染色液。
30.进一步地，所述凝胶电泳体系还包括凝胶柱，所述凝胶柱分为上下两层，其中，上层凝胶柱的浓度为2.7
‑
3.0 wt%聚丙烯酰胺，下层凝胶柱的浓度为3.4
‑
3.8 wt%聚丙烯酰胺，其中，所述聚丙烯酰胺包含丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺，所配制的凝胶液的主要组成成分为：丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、n,n,n',n'
‑
四甲基二乙胺、过硫酸铵及蔗糖、proclin300；优选的，所述上层凝胶柱的使用体积为140
‑
200μl，所述下层凝胶柱的使用体积为1.2
‑
1.6 ml，所述三羟甲基氨基甲烷的使用量浓度为质量体积比0.2
‑
2%，所述蔗糖的使用浓度为质量体积比0.5
‑
2%，所述n,n,n',n'
‑
四甲基二乙胺的使用浓度为体积比0.3
‑
2%, 所述凝胶液的ph值为6.8
±
0.2，所述proclin300的浓度为体积比0.05
‰‑5‰
。
31.根据本发明的一典型实施方式，提供上述的苏丹黑b2染料、上述染色液、上述制备方法所制得的染色液、上述检测试剂盒及上述凝胶电泳体系在脂蛋白亚分型的定量检测中的应用。
32.进一步地，脂蛋白亚分型包括极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein, vldl）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein, ldl）及其1
‑
7亚分型、高密度脂蛋白（high density lipoprotein, hdl）。
实施例
33.实施案例1一种检测试剂盒一种检测试剂盒，用于脂蛋白亚分型定性检测，包含凝胶柱、苏丹黑b2染色液、电泳缓冲体系、质控品、说明书、质控赋值说明。
34.实施案例2一种苏丹黑b2染色液及其制备方法将苏丹黑b2染料的重量与总体积之比按0.165%，加入到异丙醇中，以异丙醇的总体积计，其中含有的异丙醇的体积百分比为98.8％；加入的1
‑
甲基
‑
2吡咯烷酮，体积比为1%；再在其中加入triton x
‑
405，其使用体积比为0.2%；将上述混合溶液充分混合后，按照1.2 ml/管进行分装，避光保存，即制得苏丹黑b2染色液。
35.实施案例3 一种苏丹黑b2染色液及其制备方法与实施案例2的差异是加入的苏丹黑b2染料的重量与总体积之比按0.8%（w/v），加入到异丙醇中，以异丙醇的总体积计，其中含有的异丙醇的体积百分比为98.8％；加入的1
‑
甲基
‑
2吡咯烷酮，体积比为1%；再在其中加入triton x
‑
405，其使用体积比为0.2%（v/v）；将上述混合溶液充分混合后，按照1.2 ml/管进行分装，避光保存，即制得苏丹黑b2染色液。
36.实施案例4 一种苏丹黑b2染色液及其制备方法与实施案例2和实施案例3的差异是加入的苏丹黑b2染料的重量与总体积之比按1.5%（w/v），加入到异丙醇中，以异丙醇的总体积计，其中含有的异丙醇的体积百分比为98.8％；加入的1
‑
甲基
‑
2吡咯烷酮，体积比为1%；再在其中加入triton x
‑
405，其使用体积比为0.2%（v/v）；将上述混合溶液充分混合后，按照1.2 ml/管进行分装，避光保存，即制得苏丹黑b2染色液。
37.实施案例5一种检测试剂盒的电泳缓冲体系实施案例1中提及的电泳缓冲体系，包括电泳缓冲液，根据常规的tbe电泳缓冲液，去掉了其中的乙二胺四乙酸（edta）组份，并微调了其中三羟甲基氨基甲烷和硼酸的浓度。通过称取合适的重量后分装到合适的容量瓶中，每瓶重量为16.5 g。当试剂盒使用的时候，根据每16.5 g的粉末加入到1.2 l的去离子水或者纯净水中（含离子的矿泉水不宜）。
38.称取三羟甲基氨基甲烷 1.1 kg，硼酸0.55 kg，将上述两种物料通过搅拌机进行充分搅拌均匀，然后按照16.5 g/瓶进行分装，备用。
39.实施案例6一种检测试剂盒质控品的配制实施案例1中提及的质控品，包括质控品1和质控品2，其配制方法:从临床中收集到血脂四项总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及甘油三酯四项的检测结果符合理想血脂状态下的浓度的样本作为质控品2制备的原料；临床中收集到的血脂四项总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及甘油三酯四项的检测结果一项或者几项超标的样本作为质控品1制备的原料；先将上述样本分别进行混合；再将混合样本通过56℃灭活30分钟；再将样本进行10000 rpm离心15分钟，0.45μm的滤膜过滤；备用。将过滤过的混合样本用血脂四项试纸条分别测定3次，结果质控品2混合液测出的结果血脂四项仍然符合血脂的理想状态范围，而质控品1混合液测出的结果血脂四项至少有一项超标，同时用三批不同的实施案例1中的试剂盒每批进行检测20次，算出各个亚组份的均值
±
2标准差作为质控品的检测范围。
‑
20℃保存备用。
40.实施案例7：凝胶柱
在实施案例1中提及的凝胶柱：凝胶柱分为上下两层，上层凝胶柱的浓度为2.7 wt%聚丙烯酰胺（包含丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺），下层凝胶柱的浓度为3.5 wt%聚丙烯酰胺（包含丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺），配制的凝胶液主要组成成分为：丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、n,n,n',n'
‑
四甲基二乙胺、过硫酸铵。其中上层凝胶柱的丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺的浓度分别为质量体积比2.5 wt%（w/v）和0.2 wt%（w/v），三羟甲基氨基甲烷的使用量浓度为质量体积比1%（w/v），蔗糖的使用量为质量体积比1%（w/v），n,n,n',n'
‑
四甲基二乙胺（temed）的使用浓度为体积比0.15%（v/v）,proclin300的浓度为体积比0.3
‰
，ph值为6.8
±
0.2其中上层胶的使用体积为160μl，下层凝胶柱的使用体积为1.4 ml。
41.按照配制100 ml下层凝胶柱，称取丙烯酰胺3.1 g，甲叉丙烯酰胺0.4 g，三羟甲基氨基甲烷1 g，加入n,n,n',n'
‑
四甲基二乙胺（）100μl。充分溶解后，调节ph值到6.8
±
0.2，取1.4 ml加入到玻璃管中，加入100μl的纯净水进行压胶，静置40分钟后，用真空泵吸取下层胶上的压胶水。
42.按照配制100 ml上层凝胶柱，称取丙烯酰胺2.5 g，甲叉丙烯酰胺0.2 g，三羟甲基氨基甲烷 1 g，蔗糖1 g，proclin300加入30μl，加入temed 150μl。充分溶解后，调节ph值到6.8
±
0.2，取160μl加入到玻璃管中，加入100μl的纯净水进行压胶，静置40分钟后，用真空泵吸取上层胶上的压胶水。
43.所得的凝胶柱置于广口塑料瓶中，加入储存缓冲液，60人份/瓶。
44.实施案例8：凝胶柱与实施案例7的差异主要是通过调整加入的丙烯酰胺的量，使得下层胶的浓度为3.8 wt%，上层胶的浓度为3.0 wt%。
45.实施案例9：电泳实验使用实施例1的试剂盒进行操作，电泳装置进行检测。
46.准备工作1. 血液样本准备及血浆分离1.1受检者采血前需空腹12小时，采血时，用edta抗凝管采集全血4 ml；1.2盖好管盖，缓慢颠倒抗凝管约10次以混匀血样；1.3将血液样本于3000 rpm离心5分钟，移取上层血浆于1.5 ml干净的离心管中；1.4血浆样本在7天内做检测的可保存于2
‑
8℃冰箱备用，超过7天做检测的可保存于
‑
70℃或以下备用。
47.2. 总胆固醇含量检测：使用经nmpa批准的检测总胆固醇的试剂盒检测总胆固醇含量(mol/l或mg/dl)。
48.实验步骤1.从试剂盒中取出一瓶电泳缓冲粉倒入干净的烧杯中，加入1200 ml双蒸水或去离子水配制成电泳缓冲液。
49.2.取出洁净的1.5 ml离心管，用移液枪移取血清或血浆样本50 μl至离心管中，再加入脂蛋白染色液10 μl，于涡旋震荡仪震荡30 s或移液器吹打10次以使样本和染色液充分混匀。
50.3.将上述装有混合液的离心管室温放置15 min，使得脂蛋白染色液对样本中的脂蛋白进行充分染色。
51.4.从试剂盒中取出凝胶柱，小心弃除凝胶柱顶端的保存液，将凝胶柱加样口一端向上安装到电泳槽（上部）的橡胶插孔中。
52.5.取适量电泳缓冲液加到电泳槽（下部），没过电极柱为宜。将安装有凝胶柱的上部电泳槽盖在电泳槽（下部）上，并加入适量电泳缓冲液确保凝胶柱上样端和上盖的电极柱均可浸没在缓冲液中。
53.6.取出预染样本，涡旋震荡30 s或用移液枪吹打10次后将预染混合液加入到凝胶柱上样端。
54.7.盖上电泳槽盖，接通电源，打开电泳仪开关，设置电流为3 ma每根凝胶柱，当凝胶柱中底部染料距柱底端约1 cm时结束电泳。
55.8.将电泳槽（上部）电泳缓冲液除去，取出凝胶柱，擦去凝胶柱表面电泳缓冲液，在15分钟内进行扫描分析。
56.实施案例10脂蛋白亚分型定量检测实验使用实施案例1中提及的试剂盒，与商用检测试剂盒对12份血液样品进行脂蛋白亚分型定量检测。对比极低密度数值和商用检测试剂检测得到甘油三酯的值的相关系数，两种检测试剂盒的高密度脂蛋白胆固醇的相关性、低密度脂蛋白胆固醇的相关性。
57.图9为12例样本扫描结果，图10为商用试剂检测结果列表，使用长沙中生众捷生物技术有限公司生产的脂类多项测试卡（干化学），图11：本发明实施例7的试剂盒检测结果，其中，tc总胆固醇，hdl表示高密度脂蛋白、ldl表示低密度脂蛋白、tg表示甘油三酯、ldl
‑
c表示低密度脂蛋白胆固醇、vldl表示极低密度脂蛋白。
58.图12
‑
图23为本发明具体实施方式中实施案例7中，12份临床样本用本发明技术方案检测后的分析结果，图36为脂蛋白亚分型定量分析结果简要说明，其中，1为极低密度脂蛋白测得的浓度，2数字代表低密度脂蛋白的1
‑
7分型，3代表低密度脂蛋白1
‑
7的浓度，4为高密度脂蛋白测得的浓度。
59.图24至图26为本发明实施例7和已经商品化的检测试剂之间的对比，其中，第一列数据分别为商品化的试剂检测得到的tg、hdl和ldl数据，其单位为mmol/l;第二列数据分别为本发明实施例产品所测得的tg、hdl和ldl结果,其单位为mg/dl。采用excel中的函数correl对极低密度脂蛋白数值和商用检测试剂检测得到甘油三酯的值的相关系数，两种检测试剂盒的高密度脂蛋白的相关性、低密度脂蛋白的相关性进行分析。脂蛋白亚分型定量检测实验结果显示：高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的检测结果与商用的试剂盒的相关性均在0.92之上，呈现强相关。极低密度脂蛋白的含量与甘油三酯的含量也呈现明显的相关性，相关系数达到0.923。
60.实施例11脂蛋白亚分型定量检测方法按照下列步骤进行检测：s01：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法来对血清或血浆中的脂蛋白进行分离；s02：将所述血清或血浆中的脂蛋白用染色液染色，室温与染色液反应15分中后，取混合液30μl加入到凝胶柱上；s03：在电泳槽中的电场作用下，经过聚丙烯酰胺凝胶分子筛效应，脂蛋白亚分型按照脂蛋白颗粒大小依次被分离开来；s04：所述脂蛋白亚分型电泳分离的结果经电泳装置的扫描系统得到脂蛋白电泳
条带的光密度图谱；s05：将所述光密度图谱通过分析软件转换为峰型图谱，并进行所述峰型图谱中各峰型面积比例分析；s06：根据检测到的总胆固醇含量和所述各峰型面积的比例得到脂蛋白亚分型各组分的准确含量，其中，1为极低密度脂蛋白测得的浓度，2数字代表低密度的1
‑
7分型，3代表低密度1
‑
7的浓度，4为高密度脂蛋白测得的浓度。
61.实施例12苏丹黑b2染色液的制备方法，包括下列步骤：取苏丹黑b2的浓度为质量体积比0.165%（w/v），加入到异丙醇中，以所述加入的异丙醇的总体积计，其中含有的所述异丙醇的体积百分比范围为98％；在其中加入体积比为1.5%的1
‑
甲基
‑
2吡咯烷酮；再在其中加入triton x
‑
405，其使用体积比为0.5%（v/v）；将上述混合溶液充分混合后，待苏丹黑b2完全溶解后，避光保存，即制得苏丹黑b2染色液。
62.实施例13脂蛋白亚分型定量检测试剂盒的制备方法，包括下列步骤：步骤（1），配液，将丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、n,n,n',n'
‑
四甲基二乙胺、过硫酸铵、蔗糖、proclin300按照实际的使用浓度，加入到去离子水中，充分搅拌均匀后，调节ph值，加入1.6 ml到玻璃柱内，加入纯化水进行压胶，时间为40分钟，成胶后得到聚丙烯酰胺含量为3.5 wt%的凝胶柱，即为下层凝胶柱；步骤（2），配液，将丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、n,n,n',n'
‑
四甲基二乙胺、过硫酸铵、蔗糖、proclin300按照实际的使用浓度，加入到纯化水中，充分搅拌均匀后，调节ph值，加入160μl到玻璃柱内，加入纯化水进行压胶，时间为40分钟，成胶后得到聚丙烯酰胺含量为2.7 wt%的凝胶柱，即为上层凝胶柱；步骤（3），将步骤（1）和（2）所得的凝胶柱放入到广口塑料瓶中，加入储存缓冲液；步骤（4），配液，取苏丹黑b2的浓度为质量体积比0.165%（w/v），加入到异丙醇中，以所述加入的异丙醇的总体积计，其中含有的所述异丙醇的体积百分比范围为99.3％；在其中加入体积比为0.65%的1
‑
甲基
‑
2吡咯烷酮；再在其中加入triton x
‑
405，其使用体积比为0.05%（v/v）；将上述混合溶液充分混合后，待苏丹黑b2完全溶解后，避光保存。
63.步骤（5），电泳缓冲粉的混合，其中，三羟甲基氨基甲烷的用量为11 g/1.2 l,硼酸用量为5.5 g/1.2 l；将上述两种物料通过搅拌机进行搅拌混匀，按照16.5 g/瓶的用量，将混合后的混合物进行分装到玻璃瓶中；步骤（6），质控的配制，将收到的样本，通过安全性检测后，进行56℃灭活30分钟，混合后，根据需要添加稀释液，在进行检测赋值，分装作为质控，每支分装100μl；步骤（7）,将所述步骤（3）、（4）、（5）、（6）的组份进行贴签；所得的半成品进行检验；步骤（8），将步骤（7）检验合格的所述半成品进行装盒，即得成品脂蛋白亚分型定量检测试剂盒；优选的，所述制备方法还包括下列步骤：步骤（9），将步骤（8）所得的所述成品脂蛋白亚分型检测试剂盒进行成品检；步骤（10），将步骤（9）检验合格的所述成品贴合格签后入库。
64.实施例14苏丹黑b、苏丹黑b2染色液与血浆样本染色时间对比实验图27 为苏丹黑b染色液与3份血浆样本染色30分钟后和苏丹黑b2染色液与3份样本染色15分钟后的染色效果电泳扫描对比图，其中：21为苏丹黑b与1#样本37℃反应30分钟；22为苏丹黑b2染色液与1#样本室温反应15分钟；23为苏丹黑b与2#样本37℃反应30分钟；24为苏丹黑b2染色液与2#样本室温反应15分钟；25为苏丹黑b与3#样本37℃反应30分钟；26为苏丹黑b2染色液与3#样本室温反应15分钟。
65.从染色效果电泳扫描对比图中图片染色的深浅可以看出： 苏丹黑b2染色液与三份样本常温下反应15分钟，其染色强度明显强于苏丹黑b与三份相同样本37℃反应30分钟。本发明技术方案提供的苏丹黑b2染料及包含其的染色液的染色效率及染色效果明显强于苏丹黑b。
66.实施例15 苏丹黑b、苏丹黑b2染色液与血浆样本染色效果对比试验 两批苏丹黑b与苏丹黑b2染色液同2份血浆样本反应后对染色效果进行电泳结果对比。取两批苏丹黑b与苏丹黑b2分别同2份血浆样本进行反应，其中苏丹黑b反应条件为37℃ 30分钟，苏丹黑b2反应时间为常温15分钟。图2为三种不同染料染色后电泳的结果，其中，13、14为苏丹黑b2的染色后的电泳结果，9，10，11，12为苏丹黑b的染色后的电泳结果，明显看到图2中13，14比9，10，11，12颜色更深。对图2扫描结果进行分析，得到图3、图4、图5、图6、图7、图8。表1为对图2扫描结果进行分析后获得的极低密度脂蛋白vldl、低密度脂蛋白ldl及其1
‑
7亚分型mid 、ldl
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1、ldl
‑
2、ldl
‑
3、ldl
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4、ldl
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5、ldl
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6、ldl
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7和ldl、以及高密度脂蛋白hdl的具体分析结果：表1为 两批苏丹黑b和苏丹黑b2与两份血浆样本的分析结果而样本1#用商品化测得的甘油三酯tg、低密度脂蛋白ldl、高密度脂蛋白hdl分别为2.13 mmol，3.72 mmol/l，1.48 mmol/l，换算为mg/dl后结果分别为189 mg/dl，144 mg/dl，57 mg/dl；而样本2#用商品化测得的甘油三酯tg、低密度脂蛋白ldl、高密度脂蛋白hdl分别为1.69 mmol/l，3.64 mmol/l，1.36 mmol/l；换算为mg/dl后结果分别为150 mg/dl，141 mg/dl，53 mg/dl；将甘油三酯的含量除以5后为极低密度脂蛋白的含量，通过计算，可以看到用苏丹黑b2的结果与商品化的试剂对比后，结果更接近。
67.实施例16 苏丹黑b、苏丹黑b2染色液与血清样本染色反应对比试验
图28
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35是血清样本分别与苏丹黑b和苏丹黑b2的染色反应的结果。从临床中取得4份血清样本，用苏丹黑b和苏丹黑b2分别对血清样本进行染色。结果发现所有4份血清样本与苏丹黑b在染色电泳后，进行扫描分析，结果发现苏丹黑b对于血清样本中的ldl密度的染色较差，特别是对于中间密度低密度脂蛋白（图片中的mid区），几乎染不上色。这些没有染上色的结果，导致极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的含量相对变大而不准确。而改良过的苏丹黑b2对于中间密度脂蛋白和低密度脂蛋白的染色良好。由于中间密度脂蛋白是极低密度脂蛋白的代谢产物，其中脂类物质的含量不稳定，而染料与脂蛋白的结合主要是同其脂类结合，对于苏丹黑b不能和中间密度脂蛋白很好的染色，其主要原因可能是中间密度脂蛋白含量少；第二个原因是部分脂类被亲水性的载脂蛋白给包裹住，所以常规的苏丹黑b其染色效果自然就低，改良过的苏丹黑b2其亲水和亲脂性更好，对含量低的脂蛋白也能染色，同时能穿过包裹的蛋白去和脂类发生结合。
68.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。