光倒刺鲃的雄性分子标记及其应用的制作方法

1.本发明属于分子生物技术领域，具体涉及光倒刺鲃的雄性分子标记及其应用。


背景技术：

2.光倒刺鲃(spinibarbus hollandi)，隶属于鲤形目，鲤科，鲃亚科，倒刺鲃属。主要分布于中国的长江以南各个水系，是一种具有较高营养和药用价值的名优经济鱼类，深受市场和养殖户喜爱。然而，自20世纪80年代以来，由于各种人为因素导致光倒刺鲃的自然种群资源急剧下降，在我国许多江河已难觅踪迹。为保护这一水产种质资源，农业部先后在广东、广西、江西、福建、湖南、安徽等省建立了10多个光倒刺鲃国家级水产种质资源保护区。
3.光倒刺鲃的生长呈现性别二态性，在成鱼养殖阶段，雌鱼生长比雄鱼快。因此，探索光倒刺鲃性别分化的调控机制，建立全雌或高比例雌性光倒刺鲃培育新技术对其种质资源保护和开发利用具有重要的理论和实际意义。而性别特异分子标记的开发有助于准确快速获取表型，判断性别，从而开展人工繁殖和选育等工作，也有助于在商业生产中开展性别控制育种技术研究，进而建立单性体系。如今，尚无能够成功鉴定光倒刺鲃遗传性别的分子标记的报道，因此，开发一种准确鉴定遗传雄性的分子标记在光倒刺鲃人工繁育中具有极大的生产应用价值。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种可以准确鉴定雄性光倒刺鲃的分子标记。
5.本发明所采取的技术方案是：
6.本发明的第一个方面，提供一种光倒刺鲃的雄性分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明的第二个方面，提供一种引物，扩增本发明第一方面所述的分子标记。
8.在本发明的一些实施方式中，所述引物为：
9.p20
‑
f：5
’‑
tgcaaactgtctggcattctc
‑3’
(seq id no.2)；
10.p20
‑
r：5
’‑
atctactgccctctgtccttt
‑3’
(seq id no.3)。
11.本发明的第三方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明第二方面所述的引物。
12.本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述分子标记或本发明第二方面所述引物或本发明第三方面所述试剂盒在用于鉴定或辅助鉴定雄性光倒刺鲃遗传性别中的应用。采用本发明第二个方面所述引物或本发明第三个方面所述试剂盒对光倒刺鲃进行检测，筛选出雄性光倒刺鲃的品种，有利于鉴定或辅助鉴定雄性光倒刺鲃遗传性别。
13.本发明的第五方面，提供本发明第一方面所述分子标记或本发明第二方面所述引物或本发明第三方面所述试剂盒在光倒刺鲃遗传育种中的应用。
14.本发明的第六方面，提供本发明第一方面所述分子标记或本发明第二方面所述引物或本发明第三方面所述试剂盒在光倒刺鲃种质资源改进中的应用。
15.本发明的第七方面，提供一种用于筛选雄性光倒刺鲃的方法，通过检测本发明第一方面所述分子标记，选择含有分子标记的个体。
16.在本发明的一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
17.(1)提取待检样品基因组dna；
18.(2)以提取得到的dna为模板，利用本发明第二方面所述的引物进行pcr扩增，得到pcr产物；
19.(3)分析电泳结果，如果含有条带，则该样品为雄性光倒刺鲃。
20.本发明的第八方面，提供一种光倒刺鲃辅助育种方法，通过本发明第七方面所述方法，确定待测光倒刺鲃的性别。
21.本发明的有益效果是：
22.本发明公开了一种光倒刺鲃(spinibarbus hollandi)的雄性分子标记，所述雄性分子标记的序列为核苷酸序列如seq id no.1所示，本发明该提供了特异性扩增分子标记的引物，引物的核苷酸序列如p20
‑
f和p20
‑
r所示；还提供了包含上述引物的试剂盒。本发明从光倒刺鲃中筛选获得了雄性特异性的分子标记，根据该分子标记设计的检测引物只能在光倒刺鲃雄性个体中扩增出目的条带，从而可以用该分子标记鉴定或辅助鉴定光倒刺鲃的性别。同时还提供了一种光倒刺鲃性别鉴别的方法。通过该技术可以快速、准确、便捷地鉴定光倒刺鲃的性别，特异性为100％，且对鱼体伤害较低，为光倒刺鲃性控育种和种质资源保护、改进与可持续利用提供帮助。
附图说明
23.图1为实施例2中引物p20
‑
f/r的电泳检测结果。
24.图2为实施例3中引物对p20
‑
f/r对30个dna雌性样品的电泳检测结果。
25.图3为实施例3中引物对p20
‑
f/r对30个dna雄性样品的电泳检测结果。
具体实施方式
26.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
27.实施例1测序文库构建及基因组测序
28.(1)光倒刺鲃dna样品
29.选取性成熟的光倒刺鲃，采集性腺组织，雌性18尾和雄性19尾，采用动物基因组dna提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，参照说明书操作步骤制备dna样品。dna完整性采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外分光光度计测其od值并稀释至50ng/μl。
30.(2)测序文库构建及高通量测序
31.分别取3例雌鱼和3例雄鱼的dna样品，构建插入片段大小为350bp的双末端测序文库，文库构建完成后以qpcr方法和agilent 2100bioanalyzer(agilent technologies,usa)进行质控。对质检合格的dna文库采用illumina hiseq novaseq6000(illumina,usa)高通量测序平台进行测序，测序策略为pe150(pair
‑
end 150)。分别获得雌、雄基因组测序
clean data：60,601,902,080bp和50,978,294,016bp。通过比较分析初步判定待测光倒刺鲃属于xy型性别决定机制。
32.在上一步骤验证结果基础上，通过批量验证雌性样品，在更大的范围验证性别特异分子标记的可靠性。从其余15份雌鱼和16份雄鱼的dna样品中，各取等量dna混匀成雌、雌鱼dna混合池。通过构建插入片段大小为350bp的双末端测序文库，采用illumina hiseq novaseq6000(illumina,usa)高通量测序平台进行测序，分别为获得雌、雄鱼dna混合池测序clean data：39,467,339,700bp和32,166,459,600bp。
33.(3)雄性特异序列检测
34.序列比对采用bwa(0.7.17
‑
r1188)序列比对软件，分别将雌、雄性样品双端测序序列比对到雌、雄性参考基因组，统计在雄性参考基因组的条件下，筛选符合被所有雄性样品覆盖，而不被任一雌性样品以及雌性混池样品覆盖的序列为雄性特异序列；同时筛选符合被所有雌性样品覆盖，而不被任一雄性样品覆盖的序列为雌性特异序列。首轮针对3例雄性性腺样品测序数据和3例雌性性腺样品测序数据分析，首轮检测到一定数量的雌性特异序列和雄性特异序列。第二轮将首轮检测到的特异序列分别用混池测序数据再筛选。
35.两轮筛选后的特异序列可能存在一些无效特异序列，比如：重复序列，n碱基占比较大的序列等，这类序列容易出现组装错误，且后续无法通过实验验证，定义为无效特异性序列，此类序列将进行人工排除。经过几轮筛选后，得到特异序列如表1所示。通过比对分析，获得88条光倒刺鲃雄性特异性候选序列，没有获得雌性特异性序列。
36.表1光倒刺鲃特异性序列候选信息
37.序列类型序列数量全长(nt)最大长度(nt)最小长度(nt)平均长度(nt)雄性8813540856053641539雌性00000
38.实施例2 y染色体分子标记的筛选与确定
39.(1)引物设计与合成
40.基于上述88条雄鱼候选特异性序列，采用primer premier 5软件随机在5条候选序列区域各设计1对pcr引物，引物由上海生工生物科技有限公司合成。
41.(2)y染色体分子标记的筛选与确定
42.选择上述5对引物对雌雄各8尾个体进行pcr检测验证。pcr反应体系为25μl：2
×
taq pcr master mix[0.1u taq dna polymerase/ml、500mmol/l dntp each、50mmol/l tris
‑
hcl(ph 8.7)、20mmol/l kcl、4mmol/l mgcl2]12.5μl、上下游引物(10μmol/l)各1μl、模板dna(50～100ng)2μl；ddh2o 8.5μl。扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。pcr产物在1％琼脂糖凝胶电泳中检测分析其特异性。
[0043]
琼脂糖凝胶电泳结果如图1所述，可以看出，5对引物中，引物对p20在雄性个体中有特异扩增条带，在雌性个体中均未检测到特异扩增片段。引物对p20所在的特异性候选序列编号为gdm
‑
20，其特异性扩增的序列为：
[0044]
seq id no.1：
[0045]
tgtgactgcacacgaacgagggggaaacctcaaacccatacagaaagtactgtccgacaagaaaggccacctcgaacatgagccggaacacgagctgcagtatgtacacattcatgaggccttcctgctttattccccgcagcc
cgtcgttgatccatggattctcttcatttttgtgagtgatcttgtgaatagcatagctcaggtacactgcaatgggggctgtggttatgatgatctgaaaagcccaagagcggattggagacagtgctgacaatgcaccattgcaaactgtctggcattctcgttgaagtgtgttgcactcaaaggtgctttgactgtcagagtaaatcgagtttgcaatcacatcaagcagcagaacctggaagaagataaatattaatctcatcttccccagaaaggtgaagcttgagaagaggtttctaagaaagctccagcccatagtgccttgagaagatccagtcctgcataagaagtttgtgagattgttggaaacagaaaacagttgtttttaaatagtgaaaatatttcaaaattgtactgtttttgctgtactttgaatcaaataaatgcaggcttggtgagcagaagagaattctttaagaaacactaaaaaacttactgttcaaaatgtgtatttatgattttttttttttaacatgatcctcgttagacatttaacattacagcaaaattgaaagctatcaatttcaacatttattaggcttataaaaataacgttttaatttaagtgaatttacttaatttcaagttcatttcatattcaaaatgcactgaaactaacacttttcagcttttacagtcttcacttcatgaataaaaaaataaatatagattaatccttattaaagctacaaattctctgttaatgttattttcaagttttaatttttagcattaagaataacaacaacaacaacaaaaaaagcataaactgtcgatcaaaggacagagggcagtagattgtgtacaacaggttttttgtaaattcaattgtctgactacgtgctgacaaagaaatttaaaaaggaaacaaacaaatcttaccgtggtatttttcaaaatgttgttgctgatgcagagatgaacagttgtatagaattcagaaaatgatttttaaaccatttaaaaaaatagtaaactggccacacctttgttctgtggattggctaggtaacagtcagtgacatcaatgcaggagtgacttaccaaactcatcagaccacaatgggattcactgtcctgcagccctcctcttagagagtaaaaaaaaaaaaaacatcttttaatgactcttttgtcgatttgggcgcaccaaaggacattaaggaatgaaaacaaaacaaaaacatgttttcaaacaaatgctagggcaactgcttctttacagtataaaaagacaatggtttattcattgtttcccctttgattttctccacgagaaaaacaatcttcaaattactggaaggttattattgttgtagataataattattatttgacccttgtgtggtgttcatatttttgttattcagccagcgtttgtgggtctggtggaccagctgcatttttgggtttttaattaaacacaatcaaacaattttatgctaaatactcaacagacgtttacttcatcccagttgcaagcaatataaacagcacatatggttaataccttgtgtgggagcggcaggggcagaagcacaaaactcactcacacacacacacacacacacacacacacacacagcaaataagccaaggccatggagtccgagtttgaaaaattgtataatttttcttttgataaaaaatgaaaatgggtcccacgaacctgaacaccatgatctgtcactaggcaattttaatggaaaaagggggctctgaaaagtcactaaatcttgggttcaaatgctttccattttatgaacagtttacgttagcgtaagcggtcatctcatgataaaattgaaatcaacacattatgctgggcagaaatacatacatctt。
[0046]
引物对p20的序列为：
[0047]
p20
‑
f：5
’‑
tgcaaactgtctggcattctc
‑3’
(seq id no.2)；
[0048]
p20
‑
r：5
’‑
atctactgccctctgtccttt
‑3’
(seq id no.3)。
[0049]
通过5对引物在雌雄各8个个体的pcr验证，初步判断其中1条候选序列是y染色体特异片段，可作为光倒刺鲃的雄性分子标记。
[0050]
实施例3引物验证
[0051]
(1)光倒刺鲃dna样品制备
[0052]
在繁殖期间选取性成熟的光倒刺鲃，采集光倒刺鲃雌性、雄性各30尾，分别剪取尾鳍，采用动物基因组dna提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，参照说明书操作步骤制备dna样品。dna完整性采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外分光光度计测其od值并稀释至50ng/μl。
[0053]
(2)pcr扩增与检测
[0054]
运用引物对p20
‑
f/r对上述雌雄各30个dna样品进行pcr验证，pcr反应体系为25μ
l：2
×
taq pcr master mix[0.1u taq dna polymerase/ml、500mmol/l dntp each、50mmol/l tris
‑
hcl(ph 8.7)、20mmol/l kcl、4mmol/l mgcl2]12.5μl、上下游引物(10μmol/l)各1μl、模板dna(50～100ng)2μl；ddh2o 8.5μl。扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。pcr产物在1％琼脂糖凝胶电泳中检测分析其特异性。
[0055]
琼脂糖凝胶电泳结果显示：引物p20
‑
f/r在30尾雌鱼dna样品中均不能扩增出雄性特异性的dna条带(图2)，在30尾雄鱼dna样品中均能扩增出条带(图3)，扩增产物的分子大小是721bp。表明分子标记gdm
‑
20可用于鉴定光倒刺鲃的性别。
[0056]
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。