专利名称：叔丁氧羰基-l-酪氨酰-肽聚糖单体及其125i-标记的衍生物，其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体及其125I-标记的衍生物，还涉及其制备方法以及本发明新化合物在药学上的应用。已证明叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体在药学上尤其具有免疫调节和抗肿瘤的作用，而新的125I-标记的衍生物显示出抗PGM抗体结合作用。
已发现，作为叉开短杆菌细胞壁肽聚糖最小重复单元的肽聚糖单体(PGM，GlcNAc-β-(1-4)-MurNAc-L-Ala-D-iGln〔(L)-meso-Azpm-(D)-amide-(L)-D-Ala-D-Ala〕)具有免疫刺激、抗肿瘤和抗转移作用(Tomasic，J.and Hrsak，I.(1988)，peptidoglycan monomer originating from Breviacterium divarccatum-its metafalism amd fvological actiuities in the host，inSurface Structuie of Microorganisms and Their Interaction with the Mammalian Host(Schuinner，E，Richhmond，M.H.，Seibert，G and Schwartz，U.，Eds.)，p113-121，VCH Verlagsge-sellschabt，Weinheim)。
也已知道，在氨基酸满足下列条件的情况下可形成肽键a)首先通过加入所谓的保护基将其转化为N-保护的氨基酸，b)在羧基上被活化，c)与C-末端被保护的氨基酸、二、三或多肽发生反应，及d)通过特定的反应小心地除去所得的二、三或多肽上的保护基(Houben-Weyl，Methoden der organischen Chemie，4.Auflage，herausgegeben Von Egon Muller，Synthese Von Peptidon Ⅰ und Ⅱ，Bd 1511 und 1512，Georg Thieme Verlag，Stuttgart 1974)。
而且，在具有很复杂结构的多官能团分子，如由二糖戊肽(糖和肽残基)组成的肽聚糖单体中，还必须a)保护GlcNAC和MurNAC(分子的糖部分)上的羟基，及b)在形成肽键的反应完成之后脱去糖基上的保护基。
并且还知道，将酪氨酸插入肽或蛋白质的常规方法是“活性酯法”，其中Boc-L-Tyr-ONSu是酰化成分(Assoian，R.R.(1980)Anal.Biochem，103，70)。
对潜在的具有免疫刺激作用和抗肿瘤活性的新物质的不断增长的需求导致了本发明的构思。它涉及的是式Ⅰ的叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体(Boc-Tyr-PGM)新物质及其125I-标记的衍生物。
新的肽聚糖单体(Ⅰ)有可能提供一种亲脂性得到提高的化合物，它使得该物质易于透过细胞壁并延长其在生物体内的残留时间。这一效果是通过向PGM分子中加进一个天然芳香族氨基酸酪氨酸而获得的。在加入酪氨酸之后，由二糖戊肽得到了二糖己肽(Boc-Tyr-PGM)，再用放射性125I标记后就得到了其衍生物在制备新的肽聚糖单体衍生物的方法方面，所使用的是肽化学领域的已知方法;但在合成过程中，首次使用了完全未被保护的具有非常复杂结构的分子。
制备本发明新的PGM衍生物的方法可用下面的反应路线表示
按照本发明，是在三乙胺存在下将Boc-Tyr-ONSu与PGM分子中内消旋二氨基庚二酸上的ω-氨基进行区域选择性反应，产生新的二糖-己肽衍生物，然后首先在Sephadex G-25柱、接着在硅胶柱上通过凝胶层析分离，最后通过在Biogel p-2上进行凝胶层析完全纯化并用于生物研究。
Boc-Tyr-PGM的放射性碘标记可用标准的T氯胺法(Bolton，AA.E.(1985)，inRadioiodination Techniques，Second Edition，p109，Amersham lnt.plc.englond)完成。
通过在酪氨酸羟基的邻位上进行苯酚环的亲电子取代反应，可获得具有高比活性和足够的放射化学稳定性的125I-标记的分子。
以下反应路线代表了制备方法，
按照本发明，放射性碘标记的Boc-Tyr-PGM的合成是通过标准的T氯胺法利用Na〔125I〕来完成，得到碘化的产物Ⅱ，然后通过在Sephadex G25柱上的凝胶层析分离，并用于抗原-抗体结合反应的检查。
新的PGM衍生物二糖己肽可用在具有免疫调节和抗肿瘤活性的药物中，而新的125I-标记的衍生物可用在具有抗PGM抗体结合作用的药物中。
下面通过实施例说明本发明实施例1叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体(Ⅰ)在加入三乙胺(30μl)的情况下，将肽聚糖单体(PGM，100mg，0.1mmol)溶于无水二甲基甲酰胺(DMF，2.6ml)。然后在搅拌下，将固体Boc-Tyr-ONSu(56mg，0.12mmol)分批加至(冰-水)冷却的溶液中。于室温反应16小时，然后利用机械泵产生的真空蒸发DMF。将粘稠的浆状蒸发残渣溶于水，用固体柠檬酸酸化至pH3，并用乙酸乙酯(3×10ml)萃取。将水溶性部分浓缩至2ml，并装入水中的Sephadex G-25柱(90×2.5cm)上。通过230nm处的吸收分析各级分(3ml)，并合并和蒸发对应于高分子量化合物的级分。将所得玻璃状残渣(110mg)溶于正丁醇、乙醇、NH3(25%)和水(5∶3∶2∶2)的混合物中，并利用相同的洗脱液在硅胶柱上层析，用HOAC中和并蒸发后得到产物，最后通过Biogel P-2柱(70×2.5cm)上的凝胶层析纯化(用水洗脱)。合并流动性最强的组分，浓缩并冻干。得到58mg(46%)纯的Boc-Tyr-PGM(Ⅰ).
氨基酸分析GlcNH20.82;MurNH20.57;Ala，3;
Glu，1;A2pm 0.98;Tyr，0.80。
1H-NMR谱(D2O)1.29(s，Me3C)，1.34-1.70(m，partial overlapping with Me3C，21 H，3x Me-Ala lactoyl-Me)，1.89 and 1.98(2s，6H，2x NAc)，6.77 and 7.07(2d，2H each，IH，H8.55Hz，-C6H4-).
薄层层析正丁醇-乙醇-NH3(25%)-水(5∶3∶2∶2)，用碘蒸气和肽反应物检测，Rf＝0.5。
实施例Ⅱ叔丁氧羰基-〔125I〕-L-酪氨酰-肽聚糖单体(Ⅱ)向Boc-Tyr-PGM(5μg)的磷酸盐缓冲液(25μ，0.5M，pH7.5)溶液中加入Na〔125I〕(10μl，3.7×10βq，1mci)和氯胺T(50μg)的磷酸盐缓冲液(25μl，0.25M，pH7.5)。45秒钟后，加入焦亚硫酸钠(50μg)的25μl水溶液以终止反应。然后将反应混合物装入预先用人白蛋白溶液洗过并用0.025M磷酸盐缓冲液(pH7.5)(它也用于洗脱)平衡过的Sephadex G-25柱(30×1.5cm)上。取2ml各级分样品测试放射性，并合并对应于Boc-〔125I〕-L-Tyr-PGM的级分。所得衍生物Ⅱ的比活性约3.12MBq/μg(0.087mCi/μg)。
实施例Ⅲ叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体(Boc-Tyr-PGM)的免疫刺激活性在绵羊红细胞(绵羊红血细胞，SRBC)免疫过的小鼠中测试Boc-Tyr-PGM的免疫刺激活性。
通过腹膜注射，用绵羊红细胞(1×108SRBC)的Hank氏溶液免疫每组5只的小鼠(CBA或AKR)。第二天( 1天)，通过静脉注射仅给对照小鼠服用Hank氏溶液，而试验小鼠则通过静脉注射服用200μg Boc-Tyr-PGM的Hank氏溶液;用作阳性对照的一组小鼠则通过静脉注射服用200μg肽聚糖单体(PGM)的Hank氏溶液。四天后( 4天)，利用Gerne的技术(Jerne，N.K.Nordin，A.A.，and Henry，C.(1963)，The agar plaqul techniqul porrecognizcing antibody producing cells;in“Cell Bound Antibodies”，p109，Wistar Institute Press，Philadalphia)，测定脾中抗体形成细胞(噬斑形成细胞，PFC)的数目。
试验结果列于表1
Boc-Tyr-PGM证实了两个鼠系中的免疫刺激(辅助)活性，测得的PFC数与对照组相比提高约50%。两个试验中Boc-Tyr-PGM的效力均可与阳性对照(即肽聚糖单体)的效力相比。
实施例Ⅳ叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体(Boc-Tyr-PGM)的抗肿瘤(抗转移)活性对Boc-Tyr-PGM的抗肿瘤活性的研究是在接种了黑素瘤B-16的小鼠中进行。
在0天，给每组5只的每只小鼠(C57BL/6，雄性，4月龄)静脉注射1×105个黑素瘤细胞。
选择其中一组作为对照，不经任何其它处理。
按照以下方案对实验组的每只小鼠静脉注射1mg BOC-Tyr-PGM第1组-第3天第2组-第7天第3组-第3天和第7天(共2mg Boc-Tyr-PGM)而选择对照的三组小鼠则按同样方案静脉内接受PGM(PLIVA)。
于第23天处死小鼠后对肉眼可测的肺转移瘤进行计数，所得结果列于表Ⅱ。
用Boc-Tyr-PGM进行处理引起抗转移作用，导致所有处理小鼠组中转移瘤数目的减少(抑制率为37.8%-43.6%)。在不同时间(第3天或第7天)用不同总剂量(第3天和第7天各接受1mg或第3天和第7天共接受2mg)处理的小鼠中未观察到明显的抑制差别。
Boc-Tyr-PGM的效果可与用作阳性对照的PGM(PLIVA)的效果相比。
权利要求
1.下式的叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体及其125I-标记的衍生物(125I-Boc-Tyr-PGM)
2.一种制备权利要求1的式(Ⅰ)叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体的方法，其特征在于将叔丁氧羰基-L-酪氨酰-N-羟基琥珀酰亚胺基酯在三乙胺存在下与未保护的肽聚糖单体缩合，然后将所得的叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体(Boc-Tyr-PGM)先在Sephadex G-25上通过凝胶层析、接着在硅胶柱上通过柱层析以及在Biogel p-2上通过层析分离。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于通过加入Na〔125I〕和氯胺T用125I标记Boc-Tyr-PGM，并在加入亚硫酸钠终止反应后，在Sephadex G-25柱上分离产物(用磷酸盐缓冲液洗脱)。
4.叔丁羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体作为药物的应用。
5.叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体作为具有免疫刺激作用的药物的应用。
6.叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体作为具有抗肿瘤活性的药物的应用。
全文摘要
本发明涉及新的叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体及其
文档编号C07K1/14GK1062735SQ9111172
公开日1992年7月15日 申请日期1991年12月21日 优先权日1990年12月21日
发明者朱德吉卡·节法考维克, B·弗拉尼斯, J·托马塞为克, I·核萨克, B·拉德斯克 申请人:普利瓦药物、化学、食品和化妆品工业公司
技术领域：
本发明涉及叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体及其125I-标记的衍生物，还涉及其制备方法以及本发明新化合物在药学上的应用。已证明叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体在药学上尤其具有免疫调节和抗肿瘤的作用，而新的125I-标记的衍生物显示出抗PGM抗体结合作用。
已发现，作为叉开短杆菌细胞壁肽聚糖最小重复单元的肽聚糖单体(PGM，GlcNAc-β-(1-4)-MurNAc-L-Ala-D-iGln〔(L)-meso-Azpm-(D)-amide-(L)-D-Ala-D-Ala〕)具有免疫刺激、抗肿瘤和抗转移作用(Tomasic，J.and Hrsak，I.(1988)，peptidoglycan monomer originating from Breviacterium divarccatum-its metafalism amd fvological actiuities in the host，inSurface Structuie of Microorganisms and Their Interaction with the Mammalian Host(Schuinner，E，Richhmond，M.H.，Seibert，G and Schwartz，U.，Eds.)，p113-121，VCH Verlagsge-sellschabt，Weinheim)。
也已知道，在氨基酸满足下列条件的情况下可形成肽键a)首先通过加入所谓的保护基将其转化为N-保护的氨基酸，b)在羧基上被活化，c)与C-末端被保护的氨基酸、二、三或多肽发生反应，及d)通过特定的反应小心地除去所得的二、三或多肽上的保护基(Houben-Weyl，Methoden der organischen Chemie，4.Auflage，herausgegeben Von Egon Muller，Synthese Von Peptidon Ⅰ und Ⅱ，Bd 1511 und 1512，Georg Thieme Verlag，Stuttgart 1974)。
而且，在具有很复杂结构的多官能团分子，如由二糖戊肽(糖和肽残基)组成的肽聚糖单体中，还必须a)保护GlcNAC和MurNAC(分子的糖部分)上的羟基，及b)在形成肽键的反应完成之后脱去糖基上的保护基。
并且还知道，将酪氨酸插入肽或蛋白质的常规方法是“活性酯法”，其中Boc-L-Tyr-ONSu是酰化成分(Assoian，R.R.(1980)Anal.Biochem，103，70)。
对潜在的具有免疫刺激作用和抗肿瘤活性的新物质的不断增长的需求导致了本发明的构思。它涉及的是式Ⅰ的叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体(Boc-Tyr-PGM)新物质及其125I-标记的衍生物。
新的肽聚糖单体(Ⅰ)有可能提供一种亲脂性得到提高的化合物，它使得该物质易于透过细胞壁并延长其在生物体内的残留时间。这一效果是通过向PGM分子中加进一个天然芳香族氨基酸酪氨酸而获得的。在加入酪氨酸之后，由二糖戊肽得到了二糖己肽(Boc-Tyr-PGM)，再用放射性125I标记后就得到了其衍生物在制备新的肽聚糖单体衍生物的方法方面，所使用的是肽化学领域的已知方法;但在合成过程中，首次使用了完全未被保护的具有非常复杂结构的分子。
制备本发明新的PGM衍生物的方法可用下面的反应路线表示
按照本发明，是在三乙胺存在下将Boc-Tyr-ONSu与PGM分子中内消旋二氨基庚二酸上的ω-氨基进行区域选择性反应，产生新的二糖-己肽衍生物，然后首先在Sephadex G-25柱、接着在硅胶柱上通过凝胶层析分离，最后通过在Biogel p-2上进行凝胶层析完全纯化并用于生物研究。
Boc-Tyr-PGM的放射性碘标记可用标准的T氯胺法(Bolton，AA.E.(1985)，inRadioiodination Techniques，Second Edition，p109，Amersham lnt.plc.englond)完成。
通过在酪氨酸羟基的邻位上进行苯酚环的亲电子取代反应，可获得具有高比活性和足够的放射化学稳定性的125I-标记的分子。
以下反应路线代表了制备方法，
按照本发明，放射性碘标记的Boc-Tyr-PGM的合成是通过标准的T氯胺法利用Na〔125I〕来完成，得到碘化的产物Ⅱ，然后通过在Sephadex G25柱上的凝胶层析分离，并用于抗原-抗体结合反应的检查。
新的PGM衍生物二糖己肽可用在具有免疫调节和抗肿瘤活性的药物中，而新的125I-标记的衍生物可用在具有抗PGM抗体结合作用的药物中。
下面通过实施例说明本发明实施例1叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体(Ⅰ)在加入三乙胺(30μl)的情况下，将肽聚糖单体(PGM，100mg，0.1mmol)溶于无水二甲基甲酰胺(DMF，2.6ml)。然后在搅拌下，将固体Boc-Tyr-ONSu(56mg，0.12mmol)分批加至(冰-水)冷却的溶液中。于室温反应16小时，然后利用机械泵产生的真空蒸发DMF。将粘稠的浆状蒸发残渣溶于水，用固体柠檬酸酸化至pH3，并用乙酸乙酯(3×10ml)萃取。将水溶性部分浓缩至2ml，并装入水中的Sephadex G-25柱(90×2.5cm)上。通过230nm处的吸收分析各级分(3ml)，并合并和蒸发对应于高分子量化合物的级分。将所得玻璃状残渣(110mg)溶于正丁醇、乙醇、NH3(25%)和水(5∶3∶2∶2)的混合物中，并利用相同的洗脱液在硅胶柱上层析，用HOAC中和并蒸发后得到产物，最后通过Biogel P-2柱(70×2.5cm)上的凝胶层析纯化(用水洗脱)。合并流动性最强的组分，浓缩并冻干。得到58mg(46%)纯的Boc-Tyr-PGM(Ⅰ).
氨基酸分析GlcNH20.82;MurNH20.57;Ala，3;
Glu，1;A2pm 0.98;Tyr，0.80。
1H-NMR谱(D2O)1.29(s，Me3C)，1.34-1.70(m，partial overlapping with Me3C，21 H，3x Me-Ala lactoyl-Me)，1.89 and 1.98(2s，6H，2x NAc)，6.77 and 7.07(2d，2H each，IH，H8.55Hz，-C6H4-).
薄层层析正丁醇-乙醇-NH3(25%)-水(5∶3∶2∶2)，用碘蒸气和肽反应物检测，Rf＝0.5。
实施例Ⅱ叔丁氧羰基-〔125I〕-L-酪氨酰-肽聚糖单体(Ⅱ)向Boc-Tyr-PGM(5μg)的磷酸盐缓冲液(25μ，0.5M，pH7.5)溶液中加入Na〔125I〕(10μl，3.7×10βq，1mci)和氯胺T(50μg)的磷酸盐缓冲液(25μl，0.25M，pH7.5)。45秒钟后，加入焦亚硫酸钠(50μg)的25μl水溶液以终止反应。然后将反应混合物装入预先用人白蛋白溶液洗过并用0.025M磷酸盐缓冲液(pH7.5)(它也用于洗脱)平衡过的Sephadex G-25柱(30×1.5cm)上。取2ml各级分样品测试放射性，并合并对应于Boc-〔125I〕-L-Tyr-PGM的级分。所得衍生物Ⅱ的比活性约3.12MBq/μg(0.087mCi/μg)。
实施例Ⅲ叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体(Boc-Tyr-PGM)的免疫刺激活性在绵羊红细胞(绵羊红血细胞，SRBC)免疫过的小鼠中测试Boc-Tyr-PGM的免疫刺激活性。
通过腹膜注射，用绵羊红细胞(1×108SRBC)的Hank氏溶液免疫每组5只的小鼠(CBA或AKR)。第二天( 1天)，通过静脉注射仅给对照小鼠服用Hank氏溶液，而试验小鼠则通过静脉注射服用200μg Boc-Tyr-PGM的Hank氏溶液;用作阳性对照的一组小鼠则通过静脉注射服用200μg肽聚糖单体(PGM)的Hank氏溶液。四天后( 4天)，利用Gerne的技术(Jerne，N.K.Nordin，A.A.，and Henry，C.(1963)，The agar plaqul techniqul porrecognizcing antibody producing cells;in“Cell Bound Antibodies”，p109，Wistar Institute Press，Philadalphia)，测定脾中抗体形成细胞(噬斑形成细胞，PFC)的数目。
试验结果列于表1
Boc-Tyr-PGM证实了两个鼠系中的免疫刺激(辅助)活性，测得的PFC数与对照组相比提高约50%。两个试验中Boc-Tyr-PGM的效力均可与阳性对照(即肽聚糖单体)的效力相比。
实施例Ⅳ叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体(Boc-Tyr-PGM)的抗肿瘤(抗转移)活性对Boc-Tyr-PGM的抗肿瘤活性的研究是在接种了黑素瘤B-16的小鼠中进行。
在0天，给每组5只的每只小鼠(C57BL/6，雄性，4月龄)静脉注射1×105个黑素瘤细胞。
选择其中一组作为对照，不经任何其它处理。
按照以下方案对实验组的每只小鼠静脉注射1mg BOC-Tyr-PGM第1组-第3天第2组-第7天第3组-第3天和第7天(共2mg Boc-Tyr-PGM)而选择对照的三组小鼠则按同样方案静脉内接受PGM(PLIVA)。
于第23天处死小鼠后对肉眼可测的肺转移瘤进行计数，所得结果列于表Ⅱ。
用Boc-Tyr-PGM进行处理引起抗转移作用，导致所有处理小鼠组中转移瘤数目的减少(抑制率为37.8%-43.6%)。在不同时间(第3天或第7天)用不同总剂量(第3天和第7天各接受1mg或第3天和第7天共接受2mg)处理的小鼠中未观察到明显的抑制差别。
Boc-Tyr-PGM的效果可与用作阳性对照的PGM(PLIVA)的效果相比。
权利要求
1.下式的叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体及其125I-标记的衍生物(125I-Boc-Tyr-PGM)
2.一种制备权利要求1的式(Ⅰ)叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体的方法，其特征在于将叔丁氧羰基-L-酪氨酰-N-羟基琥珀酰亚胺基酯在三乙胺存在下与未保护的肽聚糖单体缩合，然后将所得的叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体(Boc-Tyr-PGM)先在Sephadex G-25上通过凝胶层析、接着在硅胶柱上通过柱层析以及在Biogel p-2上通过层析分离。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于通过加入Na〔125I〕和氯胺T用125I标记Boc-Tyr-PGM，并在加入亚硫酸钠终止反应后，在Sephadex G-25柱上分离产物(用磷酸盐缓冲液洗脱)。
4.叔丁羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体作为药物的应用。
5.叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体作为具有免疫刺激作用的药物的应用。
6.叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体作为具有抗肿瘤活性的药物的应用。
全文摘要
本发明涉及新的叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖单体及其
文档编号C07K1/14GK1062735SQ9111172
公开日1992年7月15日 申请日期1991年12月21日 优先权日1990年12月21日
发明者朱德吉卡·节法考维克, B·弗拉尼斯, J·托马塞为克, I·核萨克, B·拉德斯克 申请人:普利瓦药物、化学、食品和化妆品工业公司
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