一种基于光学薄膜的多功能显微成像载片的制作方法

1.本发明涉及高对比度的暗场光学显微成像领域，特别涉及一种基于光学薄膜的多功能显微成像载片领域。


背景技术：

2.显微技术是人们了解微观世界最直接的手段，光学显微技术将微观世界图像直接呈现在我们眼前，是所有显微技术中最直观也是最常用的一种显微技术。暗场显微技术则是通过在光学显微成像的过程中，减少照明光的收集，增强照明后散射光的收集，以提高成像系统的信噪比。根据照明光的数值孔径大小，暗场显微镜能够提供透射，和全内反射等照明方式。上述主要显微技术在实际应用中具有一定局限性，其存在的问题为：
3.(1)光学结构复杂。传统暗场显微方式依赖于暗场环，聚光镜，暗场收集物镜等各种光学元件之间相互配合，结构搭建复杂，所占空间大。
4.(2)使用成本高。传统暗场显微镜所需的各种光学元件，数量多，制作加工的成本高，需要与成套的显微镜系统配套搭建，整体使用和搭建的成本相对于显微系统而言较为高昂。
5.(3)使用便捷性差。针对不同的暗场照明模式，传统的暗场显微镜的需要精细调整暗场环，收集物镜等元件，十分依赖熟练的光学系统调整经验，对于大部分用户使用便捷性差。


技术实现要素：

6.本发明的技术解决问题：克服传统暗场显微镜光学结构复杂、使用成本高且使用便捷性差的不足，提供一种基于光学薄膜的多功能显微成像载片，该载片利用制备多层光学薄膜结构，利用传统显微系统的垂直入射照明光，针对一个或多个工作波长同时实现包括大数值孔径透射、全反射暗场和表面等离激元照明等多种功能，降低暗场显微系统的使用成本并提高使用便捷性。
7.本发明实现上述目的的技术方案如下：一种基于光学薄膜的多功能显微成像载片，所述载片包括：光子晶体入射层(1)、散射薄膜层(2)、光子晶体功能层(3)和样品层(4)；
8.所述光子晶体功能层(3)通过禁带设计，对于所设计的多个入射工作波长的入射角度和偏振进行调制，针对全内反射所设计的光子晶体功能层(3)的要求透射数值孔径大于1，对于透射式暗场则要求光子晶体功能层的透射数值孔径大于收集系统数值孔径，则光束透过光子晶体功能层(3)后在样品层(4)的表面发生全内反射和暗场透射，实现针对液体环境中直径100纳米以下的有机纳米球和纳米线实现对比度高于0.1的高对比度无标记显微图像，相比于传统的暗场成像效果，其对比度可以上升8
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10倍；
9.光子晶体入射层(1)通过设计禁带使得一个或多个的目标波长，能够在接近零度的垂直入射情况下通过，从而照射至散射薄膜层(2)发生散射，同时限制散射薄膜层(2)散射和光子晶体功能层(3)反射的非垂直出射光束，从而提高成像载片的利用效率；
10.散射薄膜层(2)处于光子晶体功能层(3)和光子晶体入射层(1)之间，为透过入射层的光束提供散射波矢来源，同时散射被光子晶体功能层(3)和光子晶体入射层(1)所反射回的光束；
11.样品层(4)用来承载样品，通过折射率匹配油与其它各层结合，方便分离和替换，以降低使用成本，提高使用便捷性。
12.所述样品层(4)，对于透射或全内反射系统要求，采用玻璃基底，对于表面等离激元体系，只需要将其更换为金属纳米薄膜就能够实现。
13.所述光子晶体功能层(3)通过调整禁带位置能够灵活调整其功能的性质，满足多个工作波长同时对应多种不同功能。
14.所述光子晶体功能层(3)由一维光子晶体氮化硅氧化硅层叠构成，通过化学和物理气相沉积方式实现精确加工。相比于传统的照明，薄膜厚度可以对应于所设计的例如640纳米或750纳米波长进行选择加工。
15.所述散射薄膜层(2)由掺杂于旋涂玻璃材料中的纳米颗粒通过旋涂成膜工艺制备成，由相对于介质材料的折射率差提供散射效率，同时增加荧光或量子点类的有源材料时，能够很容易地获得相对于入射光不同的工作波长。
16.所述光子晶体入射层(1)由多层介质薄膜构成，光子禁带将接近垂直入射的小角度(正负10度)条件之外的光束反射，从而被散射薄膜层(2)散射和光子晶体功能层(3)反射的光束绝大部分都能够被约束在成像载片中，从而增加成像载片的能量利用效率。
17.所述针对有多个入射波长的需求的入射层，需要在已加工的光子晶体的基础上重复加工所需波长的光子晶体即可实现其透射入射光束的功能。
18.所述光子晶体入射层(1)、散射薄膜层(2)和光子晶体功能层(3)通过物理和化学的成膜工艺连续加工，实际使用时各层别加工与玻璃基底上，由折射率匹配油粘合使用，使用后分别替换清洗。相比于传统薄膜成像器件能够增加使用便利性，降低使用成本。
19.本发明和现在有成像技术相比的优势为：
20.(1)本发明中光子晶体能够通过多层介质薄膜的厚度与折射率的调节实现光子晶体禁带位置和宽度特性的精确调制，从而对特定波长的辐射和反射光进行角度偏振等调控，使其满足例如暗场显微镜、全内反射显微镜、表面等离激元共振显微镜等高对比度成像方式的数值孔径和偏振要求。光子晶体入射层位于载片底层，允许垂直入射光进入载片，并通过角度约束限制散射后的光离开载片。散射层使入射光散射为各个角度，使之满足光子晶体功能层的辐射要求。光子晶体功能层通过禁带设计使满足暗场、全内反射和表面等离激元模式的光通过，不满足者反射回散射层。样品层位于最顶层，用于承载所观测样品便于替换。各层可以利用膜层加工的方式逐层制备，也可以分别制备后利用折射率匹配油组合起来。本发明成像载片第一次利用制备的光子晶体结构，将垂直入射光转化为大数值孔径出射光、全内反射光和表面等离激元，成功在传统显微镜上实现了高对比度的暗场和表面等离激元成像。
21.(2)光学结构简单：摒弃了传统暗场显微成像复杂的光学结构和元器件，将暗场照明的功能集中在光学薄膜器件上加工成为成像载片，高度集成化。
22.(3)使用成本低：相对于传统暗场显微成像所需特殊设计的光学元件，本发明使用的成像载片仅需简单的薄膜加工工艺，且样品薄膜可分离和重复清洁使用，使用成本极低。
23.(4)使用便捷性高：只需利用传统明场照明方式，即可在传统显微镜上获得高对比度的暗场显微成像效果，无需进行光学结构改造。同时由于光子晶体特殊的禁带设计优势，可以将数个波长和多种暗场、表面等离激元共振成像功能集中在同一个成像载片上，仅需要切换入射波长就可以实现功能切换，进一步提高了使用便捷性。
附图说明
24.图1为本发明一种基于光学薄膜的多功能显微成像载片的结构示意图；
25.图2为直径70nm的纳米线的明场(左)和暗场(右)成像结果，色彩条为灰度的对数分布，标尺长度10um；
26.图3为直径200nm的标准ps小球的明场(左)和暗场(右)成像结果，色彩条为灰度分布，标尺长度10um。
具体实施方式
27.下面结合附图对本发明做进一步详细描述。
28.如图1所示，本发明的一种基于光学薄膜的多功能显微成像载片，包括：光子晶体入射层1、散射薄膜层2、光子晶体功能层3、样品层4。
29.首先物理和化学沉积氮化硅和氧化硅的方式在玻璃基底表面加工光子晶体入射层1，当工作需求有2个以上工作波长时，例如同时工作于640纳米和750纳米，则在已加工光子晶体入射层的基础上继续加工光子晶体，即可使得光子晶体入射层能够在需求波长实现临近垂直角度(正负10度)的高透射。如需精确调整工作波长只需要在物理和化学沉积过程中调整光子晶体层厚和折射率，工作波长移动10纳米对应层厚更改3纳米或折射率更改0.1左右，从而改变光子晶体禁带位置，即可实现。散射薄膜层2通过将纳米颗粒掺杂于旋涂玻璃材料中，并通过旋涂成膜工艺制备成，根据散射效率要求散射薄膜层2总厚度为1微米到3微米。通过将荧光分子和量子点类的有源材料加入散射薄膜层中就能够获得不同于入射波长的其他工作波长。加工时可以直接加工于玻璃表面或者光子晶体入射层1表面。光子晶体功能层3同样由物理和化学沉积氮化硅和氧化硅的方式制备而成，通过精确调整工作波长的功能同样只需要在沉积过程中调整光子晶体，工作波长移动10纳米对应层厚更改3纳米附近或折射率更改0.1左右，从而改变光子晶体禁带位置，即可实现。使用表面等离子体成像体系时，只需在光子晶体功能层3上加工小于100纳米的金属薄膜即可。使用时，物镜油或其他折射率匹配油将入样品层4、光子晶体功能层3、散射薄膜层2和光子晶体入射层1通过折射率匹配油粘合在一起，组成完整的基于光学薄膜的多功能显微成像载片，并将其放置在普通明场光学显微镜样品台上，普通明场显微镜即具备了暗场成像的能力。入射光垂直入射进入结构后与散射薄膜层2发生散射，散射后满足光子晶体功能层3出射条件的光束则能够出射或发生全内反射，照明样品层4表面的样品，样品的散射信号被数值孔径小于照明光的物镜所收集，实现暗场成像的功能。散射薄膜层2的主要功能为将入射光束散射成各种角度，包含实现多功能暗场成像所需的波矢和偏振。光子晶体功能层3主要功能为选择出所需的透射暗场光束和全内反射光束，不满足功能层要求的光束则被其反射回散射薄膜层2再次发生散射，从而将入射能量大部分约束在了显微成像载片中，增加了成像载片的能量利用效率。更改明场显微镜的入射波长后同样进入多功能显微成像载片中，根据功能层的
设计对应各自透射、全内反射和表面等离激元的功能。样品层4所承载的纳米线和纳米球以及实际生物化学样品即可被光子晶体功能层3发出的透射照明光束、全内反射和表面等离激元照明光所点亮，从而被普通明场显微镜收集成像，而光子晶体发出的透射照明光束或者全内反射照明光则不会被显微镜系统收集。只需要在明场显微镜样品台上放置该种基于光学薄膜的多功能显微成像载片，即可实现高对比度的暗场显微镜功能。针对小于100纳米的透明材料，仍然拥有最大超过0.2的成像对比度。同时成本低廉使用方便。
30.如图2所示，利用本发明基于光学薄膜的多功能显微成像载片放置于普通明场显微镜上获得的明场和暗场成像功能成像效果对比图。两幅图拍摄的都是针对搭桥在5微米粗的水凝胶微米线上直径接近70纳米的尼龙纳米线的成像效果。其中左图为普通明场成像功能拍摄的透射明场的成像效果，成像对比度小于0.05，右图展示的是本发明的暗场成像功能拍摄的高对比度暗场显微成像效果，对于紧贴基片表面处可以实现高达0.2的暗场成像对比度。
31.如图3所示，是利用本发明的基于光学薄膜的多功能显微成像载片放置于普通明场显微镜上获得的明场和表面等离激元成像功能成像效果对比图。两幅图拍摄的是直径为100纳米的标准聚乙烯微球的成像效果，其中左图为普通明场成像功能拍摄的透射明场的成像效果，其平均的成像对比度小于0.03，右图展示的是利用本发明的表面等离激元成像功能拍摄实现的高对比度表面等离激元效果，其平均的成像对比度大于0.15。
32.本发明未详细阐述的部分属于本领域公知技术。