一种抗p-Tau231单克隆抗体、其制备方法及其检测试剂盒及应用与流程

本发明涉及生物，具体为一种抗p-tau231单克隆抗体、其制备方法及其检测试剂盒及应用。

背景技术：

1、阿尔茨海默症（alzheimer's disease，ad）是一种以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性疾病，是导致老年期痴呆的主要原因。tau蛋白是一种微管相关蛋白，在正常生理条件下能够与微管蛋白相互作用，促进微管组装，调节微管稳定性和动力学。在ad患者脑中，tau蛋白发生异常过度磷酸化修饰，从微管上脱离，导致微管解体，并自行聚集形成神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，nfts）。神经原纤维缠结是ad的两大核心病理特征之一（另一特征为β-淀粉样蛋白沉积形成的老年斑），其形成与ad患者的认知功能下降密切相关。因此，tau蛋白及其磷酸化形式已成为ad诊断和治疗研究的重要靶点。

2、目前，脑脊液中aβ42、总tau蛋白（t-tau）和磷酸化tau蛋白（p-tau）是反映ad病理生理改变的三大核心生物标志物。然而，脑脊液样本的获取需要通过腰椎穿刺，属于有创操作，患者接受度低、依从性差，不利于大规模筛查和长期随访监测。因此，开发基于外周血（血浆/血清）的ad生物标志物检测方法已成为当前研究的热点和难点。

3、近年来，随着超灵敏检测技术的发展，血液中p-tau蛋白的检测取得了重要突破。研究发现，多种p-tau形式（如p-tau181、p-tau217和p-tau231）在ad患者外周血中特异性升高，能够有效区分ad患者与健康对照者及其他神经退行性疾病患者。其中，p-tau231在ad病程的早期阶段即开始升高，被多项研究证实为ad早期筛查的潜在生物标志物。

4、目前，血液p-tau检测主要依赖于simoa（单分子免疫阵列检测技术）等超敏检测平台。simoa技术通过将免疫反应限定在飞升级别的微孔阵列中，实现了对极低浓度目标分子的数字化计数检测，具有极高的灵敏度。然而，simoa检测平台存在以下局限性：（1）设备和试剂成本高昂，限制了其在临床常规检测中的推广应用；（2）检测通量较低，难以满足大规模人群筛查的需求；（3）操作流程复杂，对操作人员和实验环境要求较高。上述缺陷使得simoa技术难以作为常规临床检测手段在各级医疗机构中普及应用。

5、此外，现有技术中的p-tau231抗体也存在特异性不足的问题。tau蛋白的磷酸化位点众多，不同位点的磷酸化模式在不同疾病阶段和不同病理类型中具有不同的分布特征。如果抗体不能精准区分不同位点的磷酸化修饰，将导致检测信号中混杂其他p-tau亚型的干扰，影响检测结果的准确性和临床解读的可靠性。例如，某些商业化的p-tau231抗体可能与非磷酸化tau蛋白或其他磷酸化位点发生交叉反应，限制了其在精准诊断中的应用价值。

6、综上所述，现有技术主要存在以下缺陷：（1）缺乏高特异性的抗p-tau231单克隆抗体。现有抗体对p-tau231的识别特异性不足，存在与p-tau181、p-tau217或其他磷酸化/非磷酸化tau蛋白的交叉反应，难以满足精准检测的需求；（2）现有p-tau231的检测方法（主要为simoa法）依赖进口昂贵设备和试剂，检测成本高、通量低、操作复杂，难以在临床常规检测和大规模筛查中广泛应用；（3）缺乏基于高特异性抗体且适用于临床常规检测的p-tau231诊断试剂盒。目前市场急需一种兼具高灵敏度、高特异性、低成本、高通量、操作简便的p-tau231检测产品，以满足ad早期大规模筛查的临床需求。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中所存在的上述缺陷，本发明提供了一种抗p-tau231单克隆抗体、其制备方法及其检测试剂盒及应用。

2、一种抗p-tau231单克隆抗体，所述单克隆抗体包含：

3、a）抗体重链互补决定区，其包括cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3，其中：

4、cdr-h1具有序列seq id no.1: sydis的氨基酸序列或与seq id no.1具有至少90%的同一性，

5、cdr-h2具有序列seq id no.2: wifpgdgrtkynekfkg的氨基酸序列或与seq idno.2具有至少90%的同一性，

6、cdr-h3具有序列seq id no.3: pgpnswfay的氨基酸序列或与seq id no.3具有至少90%的同一性；

7、b）抗体轻链互补决定区，其包括cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3，其中：

8、cdr-l1具有序列seq id no.4:rasksvstsgysymh的氨基酸序列或与seq id no.4具有至少90%的同一性，

9、cdr-l2具有序列seq id no.5: lvsnles的氨基酸序列或与seq id no.5具有至少90%的同一性，

10、cdr-l3具有序列seq id no.6: qhirelpg的氨基酸序列或与seq id no.6具有至少90%的同一性。

11、进一步的，所述单克隆抗体包含抗体重链可变区vh和抗体轻链可变区vl，其中：

12、vh具有序列seq id no.7：

13、nsngnsevqlqesgaelvkpgasvklsckasgytfksydiswvrqrpeqglewigwifpgdgrtkynekfkgkatlttdkssstaymqlsrltsedsavyfcvrpgpnswfaywgqgtlvtvsaakttppsvyplapgcgdttgppys的氨基酸序列或与seq id no.7具有至少90%的同一性；

14、vl具有序列seq id no.8：

15、msdieltqspaslavslgqratisyrasksvstsgysymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhirelpg的氨基酸序列或与seq id no.8具有至少90%的同一性。

16、本发明还提供一种检测p-tau231蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的单克隆抗体。

17、进一步的，所述试剂盒为磁微粒化学发光检测试剂盒，包含：

18、试剂a，所述试剂a包含包被有权利要求1或2所述单克隆抗体的磁性微球；以及

19、试剂b，所述试剂b包含标记有化学发光标记物的t-tau抗体。

20、进一步的，所述单克隆抗体为生物素化抗体，所述磁性微球为链霉亲和素包被的磁性微球，所述化学发光标记物为吖啶酯。

21、本发明还提供上述单克隆抗体在制备用于检测p-tau231蛋白或用于诊断阿尔茨海默症的试剂盒中的应用。

22、本发明还提供一种检测p-tau231蛋白的方法，包括上述单克隆抗体与待测样本接触的步骤。

23、进一步的，上述方法为磁微粒化学发光检测法，包括：将待测样本与包被有上述单克隆抗体的磁性微球以及标记有化学发光标记物的t-tau抗体反应，然后检测化学发光信号。

24、本发明还提供制备上述单克隆抗体的方法，包括以下步骤：

25、（a）以p-tau231磷酸化多肽作为免疫原免疫动物；

26、（b）分离免疫后动物的脾细胞；

27、（c）将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞；

28、（d）筛选能够分泌特异性识别p-tau231蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

29、（e）培养所述杂交瘤细胞株，从培养物中分离所述单克隆抗体。

30、进一步的，所述p-tau231磷酸化多肽的氨基酸序列为seq id no.9，所述动物为balb/c小鼠。

31、本发明的有益技术效果是：

32、1、本发明筛选获得的2-1a单克隆抗体能够特异性识别p-tau231蛋白，与p-tau181和p-tau217无交叉反应（p/n=35.41），且亲和力达到nm级别（kd=9.86×10-10 m），抗体纯度高达95.42%。此外，本发明明确了该抗体的cdr序列和抗原识别表位（229-pt-233），为阿尔茨海默症相关检测提供了关键的抗体材料。

33、2、本发明将所述单克隆抗体与磁微粒化学发光技术相结合，建立了双抗体夹心检测体系。该试剂盒的检测结果与simoa金标准方法的相关系数r²=0.9954，具有高度一致性，检测准确度高，能够满足临床样本中p-tau231蛋白的准确定量检测需求。

34、3、本发明试剂盒操作简便、适用于全自动化高通量检测，可实现外周血中p-tau231蛋白的快速定量，为阿尔茨海默症的大范围早期筛查和辅助诊断提供了高性价比的技术手段，具有重要的临床应用价值和社会意义。