一种构建DNA拓扑结构的方法

本发明属于dna纳米，具体涉及一种构建dna拓扑结构的方法。

背景技术：

1、拓扑学不仅是数学的重要分支，也是物理与生命科学的重要研究方向。在自然界中，拓扑结构广泛存在于dna、蛋白质等生物大分子中，并在其执行生物学功能的过程中发挥关键作用。例如，在蛋白质折叠过程中，多肽链会形成具有特定交叉的拓扑构象；而在基因组dna的复制与转录过程中，dna链也会形成临时性的拓扑结构，并最终由dna拓扑异构酶进行精确解结。人工合成拓扑分子结构在研究分子异构酶活性等生物学问题上具有重要作用。然而，目前在分子尺度上通过人工设计实现复杂度可控的拓扑化合物仍然是一项极具挑战的问题。

2、现有合成dna拓扑结构的技术主要存在以下缺点：1）组装过程繁琐：构建复杂拓扑结构时通常需分步进行，即先组装基础拓扑单元，再通过单元间杂交集成，该过程繁琐且难以实现高阶复杂拓扑结构的构建。2）拓扑结构简单，复杂度受限：现有方法多局限于构建结点数有限的简单或经典拓扑结构，在实现更复杂的高阶链环等方面存在显著瓶颈。3）折叠路径容错性差：在基于单链自折叠的路径中，链内自缠绕易产生多余分结点，且随着交叉数增加，正确折叠率急剧下降，折叠错误一旦发生难以逆转，导致缺陷结构积累，影响产物均一性与产率。

3、基于上述问题，本发明提供一种dna拓扑结构的构建方法以克服现有技术中分步组装繁琐、结构复杂度有限及折叠过程容错性低等关键问题。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种构建dna拓扑结构的方法，以克服现有技术的不足。

2、为实现以上发明目的，本发明采用了如下所述的技术方案：

3、作为发明的第一个目的，本发明提供一种构建dna拓扑结构的方法，包括：将dna单链的末端5’磷酸化修饰后进行定向连接，以及自下而上的dna自组装形成具有可编程结点数的编织式的dna格栅纳米阵列结构；所述dna格栅纳米阵列再经酶促反应连接成共价键形成闭合的环形dna单链，实现结点位置的精准定位，构建得到dna拓扑结构；其中，所述dna格栅纳米阵列结构的基本结构单元是由四条dna单链通过碱基配对而成的dna四臂交叉结构(dna four-way junction) 。

4、dna自组装技术由于其高度可编程性有望用于合成高度复杂的dna拓扑结构，dna自组装是一种基于碱基互补配对原理、以dna链为原料的自下而上组装技术，能够可编程地合成具有纳米级精度、尺寸可控且空间可寻址的复杂结构。本发明将dna自组装技术用于dna拓扑结构的构建，通过自下而上的dna自组装成具有可编程结点数的dna格栅纳米阵列，并借助酶促反应，最终实现结点位置精确可编程、结构复杂度高度可定制的dna拓扑结构的构建，从而克服现有技术中分步组装繁琐、结构复杂度有限及折叠过程容错性低等关键问题理论上，该构建方法可实现任意复杂度的功能材料构建，展现出在制备拓扑结点与复杂度均可定制的dna拓扑结构方面的巨大潜力。

5、作为一种优选的实施方式，所述dna格栅纳米阵列由辅助链单链和拓扑链单链合成得到。

6、作为一种优选的实施方式，所述拓扑链单链进行5’磷酸化修饰，再加入辅助链单链，退火组装形成具有磷酸化位点的所述dna格栅纳米阵列结构，然后加入t4连接酶，使所述dna格栅纳米阵列结构内的5’磷酸基和3’羟基连接形成环状dna，即得到所述dna拓扑结构。

7、需要说明的是，所述dna格栅纳米阵列结构中，每个dna格栅结构根据交叉点之间的距离不同，使所述dna拓扑结构中的dna双螺旋结构具有两种不同的分布方式；当交叉点之间的距离是整数倍的螺旋数时，dna双螺旋保持在同侧；当交叉点之间的距离是半数倍的螺旋数dna双螺旋之间呈编织状交替的排布。

8、作为一种优选的实施方式，所述的构建方法，具体步骤包括：

9、s1、设计dna单链，包括拓扑链单链和辅助链单链；

10、s2、拓扑链单链的磷酸化；

11、在所述拓扑链单链中加入磷酸化酶进行一次孵育，使其5’端进行磷酸化；

12、s3、构建dna纳米格栅阵列；

13、将磷酸化后的所述拓扑链单链与所述辅助链单链混合后，在缓冲溶液中进行退火，组装得到具有磷酸化位点的dna格栅纳米阵列；

14、s4、构建dna拓扑结构

15、在s3制备的具有磷酸化位点的dna格栅纳米阵列的混合溶液中加入t4连接酶进行二次孵育，使dna格栅纳米阵列的结构内的所述拓扑链单链的5’端磷酸基团和所述辅助链单链的3’端的羟基连接形成环状dna，即得到dna拓扑结构。

16、作为一种优选的实施方式，s1中，拓扑链单链序列seq id no.1~15。

17、优选地，辅助链单链序列seq id no.16~25。

18、作为一种优选的实施方式，s2中，所述一次孵育的条件为37℃孵育1h。

19、作为一种优选的实施方式，s3中，所述拓扑链单链和所述辅助链单链的摩尔比为1:1。

20、作为一种优选的实施方式，s3中，所述缓冲溶液为含mg2+的te缓冲溶液。

21、优选地，mg2+的浓度为20~40mm。

22、优选地，所述退火的条件包括将温度从85℃降至25℃，退火时间为24~36h。

23、作为一种优选的实施方式，s4中，t4连接酶的添加量1μl（4×105units/ml）。

24、优选地，所述二次孵育的条件为16℃孵育19 h。

25、作为一种优选的实施方式，s4还包括：在生成所述环状dna后，再加入核酸外切酶iii和核酸外切酶i，再次孵育，使所述混合溶液中与环状dna互补的线性dna链和体系内剩余的单链dna降解，最后加入变性剂，使核酸外切酶iii和核酸外切酶i失活。

26、优选地，核酸外切酶iii的浓度为1×105units/ml，添加量为0.5μl。

27、优选地，核酸外切酶i的浓度为2×104units/ml，添加量为1μl。

28、优选地：所述变性剂为1% sds，添加量为20 μl。

29、作为发明的第二个目的，本发明还提供一种dna拓扑结构，采用如上文所述的构建方法制备得到。

30、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

31、1、本发明基于编织式dna格栅纳米阵列构建dna拓扑结构，能够精确定制组装出具有特定数量节点的拓扑结构，理论上可以合成高度复杂的拓扑单链dna结构。

32、2、本发明利用dna自组装技术，采用一锅法退火组装和酶处理的方式，有效避免了分步组装操作繁琐、产率低等问题。合成复杂的拓扑单链dna并不增加实验上的操作流程。

1.一种构建dna拓扑结构的方法，其特征在于，包括将dna单链的末端5’磷酸化修饰后进行定向连接，以及自下而上的dna自组装形成具有可编程结点数的编织式的dna格栅纳米阵列结构；所述dna格栅纳米阵列再经酶促反应连接成共价键形成闭合的环形dna单链，实现结点位置的精准定位，构建得到dna拓扑结构；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，具体步骤包括：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：s2中，所述一次孵育的条件为37℃孵育1h。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：s3中，所述缓冲溶液为含mg2+的te缓冲溶液；

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：s4中，4×105units/ml的t4连接酶的添加量为1μl；

8.根据权利要求3-7任一项所述的方法，其特征在于：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：核酸外切酶iii的浓度为1×105units/ml，添加量为0.5μl；核酸外切酶i的浓度为2×104units/ml，添加量为1μl；

10.一种dna拓扑结构，采用如权利要求1-9任一种所述的方法制备得到。