一种针对低起始量样本的磷酸化肽富集方法

本发明涉及蛋白质磷酸化修饰，尤其是涉及一种针对低起始量样本的磷酸化肽富集方法。

背景技术：

1、磷酸化是一种常见的蛋白质翻译后修饰，参与调控细胞内众多信号通路。蛋白质磷酸化状态的异常改变往往与疾病的发生、进展及预后密切相关，因此，对磷酸化蛋白质的深入研究对于疾病机制的阐明及生物标志物的发现具有重要意义。

2、随着质谱技术的不断发展，基于质谱的磷酸蛋白质组学研究取得了显著进展。然而，由于磷酸化肽段在蛋白质组中的丰度较低，直接进行质谱分析往往难以获得准确和全面的信息。因此，磷酸化肽段的富集是磷酸蛋白质组学研究的关键步骤。

3、目前，磷酸化肽段的富集方法主要包括金属离子亲和色谱(imac)、金属氧化物亲和色谱(moac)等。其中，imac利用固定化的带正电荷的金属阳离子与带负电荷的磷酸基团之间的亲和力富集磷酸化肽段，常用的金属离子包括fe3+、ti4+和zr4+等。moac则利用金属氧化物与磷酸基团之间的亲和力富集磷酸化肽段，常用的金属氧化物包括tio2、zro2和sio2等，其中tio2的运用最为广泛。

4、尽管这些方法在一定程度上提高了磷酸化肽段的富集效率，但传统方法通常需要较大的样本起始量，限制了其在低样本量情况下的应用，尤其是对于一些珍贵的临床样本或稀有样本，往往难以满足需求。近年来，一些研究尝试通过使用新型材料或自动化富集设备来提高富集效率和重复性，但需要较高的设备成本和复杂的操作流程，限制了其在普通实验室的应用。此外，一些创新的富集策略，如结合多种蛋白酶消化(analchem 2020,92(13),8943–8951)和创新标记技术(commun biol2023,6(1),70)，虽然提高了富集效率，但往往依赖于高成本的试剂和严苛的实验条件。

5、而如cn110128499a中公开了一种磷酸化肽段富集的方法、检测和定量的方法，其中，磷酸化肽段富集的方法包括蛋白质组样本的裂解、酶解和基于二氧化钛的磷酸化肽段富集的步骤，其中，蛋白质组样本的裂解、酶解后得到的溶液中包含磷酸化肽段和非磷酸化肽段，磷酸化肽段和非磷酸化肽段之和为总肽段，在基于二氧化钛的磷酸化肽段富集的步骤中二氧化钛与总肽段的质量比例为10～100:1。但cn110128499a中的磷酸化肽段富集的方法，富集起始量需求高，在300μg-1mg之间，其方法不适用微量样本。

6、因此亟需一种降低成本、提高磷酸化肽段的富集效率的针对低起始量样本的磷酸化肽富集方法。

技术实现思路

1、本发明的目的就是为了提供一种针对低起始量样本的磷酸化肽富集方法，通过优化的富集条件实现低成本且高效的富集，具体通过优化富集过程中富集材料用量、孵育时间和关键溶液等参数，以实现对低样本量中磷酸化肽段的高效富集，该方法具有检测灵敏度高、特异性强、成本低等优点。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

3、本发明的目的是提供一种针对低起始量样本的磷酸化肽富集方法，使用二氧化钛作为富集材料，在一定的二氧化钛(tio2)用量、一定的肽段与tio2振荡孵育时间、一定的反应体积、一定的上样缓冲液和一定的洗脱方式的条件下，对低起始量样本的磷酸化肽进行富集；所述低起始量样本的量为1-10μg，所述低起始量样本为包括磷酸化肽的肽段；所述tio2用量为1mg；所述肽段与tio2振荡孵育时间为0.5h；所述反应体积为20μl；所述上样缓冲液包括10wt％的乳酸；所述洗脱方式为先用2vt％氨水和后用50vt％乙腈分步洗脱。

4、进一步地，所述反应体积为复溶肽段的溶液(上样缓冲液)体积，以及富集过程中用于平衡二氧化钛和清洗非磷酸化肽所加入的各种试剂(包括清洗液、上样缓冲液等)的单次使用体积。

5、进一步地，所述对低起始量样本的磷酸化肽进行富集的过程通过tio2富集柱(二氧化钛富集柱)实现。

6、进一步地，所述tio2富集柱的制备过程包括：使用10μl移液器吸头制作富集柱，移液器吸头的底层填充一层c8膜，称取1mg tio2，将二氧化钛加入清洗液(wash buffer)制成悬液，将悬液转移到有c8膜的移液器吸头中，以500-1000g的离心力离心1min。

7、进一步地，通过tio2富集柱对低起始量样本的磷酸化肽进行富集之前，对富集柱进行预处理。

8、进一步地，所述预处理包括如下过程：

9、向富集柱中加入20μl清洗液(wash buffer)，以500-1000g的离心力离心1min，之后向富集柱中加入20μl上样缓冲液(loading buffer)，以500-1000g的离心力离心1min。

10、进一步地，所述对低起始量样本的磷酸化肽进行富集的过程包括如下步骤：

11、将低起始量样本(1-10μg肽段)溶解于20μl上样缓冲液(loading buffer)中，加入富集柱中，室温条件下震荡孵育0.5h，之后以500-1000g的离心力离心1min；

12、肽段和tio2震荡孵育后，向富集柱中加20μl上样缓冲液(loading buffer)，以500-1000g的离心力离心1min，之后加入20μl清洗液(wash buffer)，以500-1000g的离心力离心1min，之后加入20μl水，以500-1000g的离心力离心1min。

13、进一步地，在加入20μl水，以500-1000g的离心力离心1min后，执行如下步骤：

14、富集柱转移到收集管中，加入10μl洗脱液1(elution buffer 1)，室温下孵育震荡5-10min，以500-1000g的离心力离心1min，之后加入10μl洗脱液2(elution buffer 2)，室温下孵育震荡5-10min，以500-1000g的离心力离心1min，合并两次洗脱液，进行浓缩干燥。

15、进一步优选地，洗脱液1(elution buffer 1)和洗脱溶液2(elution buffer 1)孵育时间各为10min。

16、进一步地，所述洗脱液1(elution buffer 1)为体积分数2％氨水的水溶液。

17、进一步地，所述洗脱液2(elution buffer 1)为体积分数50％乙腈的水溶液。

18、进一步地，所述上样缓冲液还包括70vt％乙腈、2-5vt％三氟乙酸。

19、进一步优选地，所述上样缓冲液包括70vt％乙腈、2-5vt％三氟乙酸、10wt％乳酸，余量为水。

20、进一步地，所述tio2的粒径为10μm。

21、进一步地，所述针对低起始量样本的磷酸化肽富集方法包括如下步骤：

22、1)制备富集柱；

23、2)低起始量样本(肽段)准备，制备肽段混合溶液；

24、3)富集柱预处理；

25、4)上样：步骤2)制备的肽段混合溶液加入到完成步骤3)操作的富集柱中，进行上样；

26、5)富集柱清洗及杂质去除；

27、6)洗脱：洗脱后浓缩干燥得到富集的磷酸化肽。

28、进一步地，所述步骤1)包括如下具体过程：

29、在10μl的移液枪头底部填充一层c8膜，制成含填充摸的微量移液管(stagetips)；称取1mg的tio2，加入20μl的清洗液(wash buffer)(包括70vt％乙腈、0.5vt％三氟乙酸，余量为水)震荡混匀成悬液，并转移到stage tips中，以500g的离心力离心1min去除清洗液，得到的富集柱室温保存备用。

30、进一步地，所述步骤2)包括如下具体过程：

31、取1μg的原料肽段，使用20μl上样缓冲液(loading buffer)(包括70vt％乙腈、5t％三氟乙酸、10wt％乳酸，余量为水)复溶，得到肽段混合溶液，备用。

32、进一步地，所述步骤3)包括如下具体过程：

33、步骤1)制备的富集柱加入20μl的清洗液(wash buffer)(包括70vt％乙腈、0.5wt％三氟乙酸，余量为水)，以500g的离心力离心1min，之后向富集柱中加入20μl的上样缓冲液(loading buffer)(包括70vt％乙腈、5vt％三氟乙酸、10wt％乳酸，余量为水)，以500g的离心力离心1min，得到预处理后的富集柱。

34、进一步地，所述步骤4)包括如下具体过程：

35、步骤2)制备的肽段混合溶液加入到完成步骤3)操作的富集柱(预处理后的富集柱)中，放置在恒温混匀仪上，室温下650rpm孵育0.5h，以500g的离心力离心1min去除未结合的非磷酸化肽。

36、进一步地，所述步骤5)包括如下具体过程：

37、加入20μl的上样缓冲液(loading buffer)(包括70vt％乙腈、5vt％三氟乙酸、10wt％乳酸，余量为水)，500g离心1min；加入20μl的清洗液(wash buffer)(包括70vt％乙腈、0.5vt％三氟乙酸，余量为水)，以500g的离心力离心1min；加入20μl的lc-ms(液相色谱-质谱联用)/ms(质谱)级别的水，以500g的离心力离心1min。

38、进一步地，所述步骤6)包括如下具体过程：

39、富集柱转移到收集管中，加入10μl的洗脱液1(elution buffer 1)(质量分数2％氨水)，放置在恒温混匀仪上，室温下650rpm孵育10min，以500g的离心力离心1min；之后加入10μl的洗脱液2(elution buffer 2)(体积分数50％乙腈的水溶液)，放置在恒温混匀仪上，室温下650rpm孵育10min，以500g的离心力离心1min，合并2次得到的洗脱液，进行浓缩干燥(置于真空浓缩仪中抽干)，得到富集的磷酸化肽。

40、进一步地，对步骤6)中得到的富集的磷酸化肽通过液相色谱-串联质谱分析。

41、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

42、(1)本发明提出的一种针对低起始量样本的磷酸化肽富集方法，具体是针对样本量有限、无特殊设备和试剂资源限制的情形，提供一种新型磷酸化肽段富集方法，该方法不仅确保了较高的特异性和重现性，而且适于广泛的使用，此外，本发明所提出的磷酸化肽段富集方法能够支持快速而深入的磷酸化蛋白质组分析，体现了其在科学研究与实际应用中的重要价值和广阔前景。

43、(2)本发明提出的一种针对低起始量样本的磷酸化肽富集方法，通过tio2特异性地结合磷酸肽上的磷酸基团，可高效的富集磷酸肽；通过优化的tio2加入量，可实现更多的磷酸位点鉴定和并提高定量稳定性；通过缩小富集体系至20μl，可降低操作过程中的样品损失；通过在上样缓冲液中加入优化浓度的乳酸，平衡了非磷酸肽与富集材料的特异性结合与磷酸肽的鉴定量以及检测灵敏度；通过优化的tio2与肽段的孵育时间，进一步提高磷酸化位点的鉴定和后续对磷酸化肽的洗脱能力；通过优化的洗脱溶液组合，极大程度地提高了整体的富集效率。本发明实验周期短，1h内即可完成磷酸化肽的富集，且操作简单，各试剂耗材均为常规实验室常见，实验成本低。