一株分泌A型口蹄疫单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

本发明属于生物，具体涉及一株分泌a型口蹄疫单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术：

0、技术背景

1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的重大动物疫病之一，主要感染猪、牛、羊等偶蹄类动物，感染动物发病率和死亡率均较高，世界动物卫生组织(woah)将其归为需要全球范围内通报的动物疫病，我国也将其列为一类动物疫病。口蹄疫病毒属小rna病毒科，口蹄疫病毒属，共7个血清型(o、a、asia-1、c、sat1、sat2、sat3型)，70多个亚型，血清型间无交叉免疫保护作用。

2、评价口蹄疫疫苗免疫效果最常用的方法是区分血清型的elisa血清抗体检测方法，该方法又分为竞争法、液相阻断法、间接法，其中竞争法被认为是较为准确的一种方法，是世界动物卫生组织(woah)指定的国际贸易诊断方法。目前商品化的口蹄疫病毒elisa抗体检测方法多采用基于完整灭活抗原及其制备的多克隆抗体，针对不同的血清型分别制备不同的抗体检测试剂盒。但是由于多克隆抗体诊断试剂固有缺陷，血清型间易产生非特异性反应或血清型内覆盖谱窄，主要表现为：1、国内常用的o型和a型口蹄疫病毒抗体检测技术(试剂盒)中易出现血清型间非特异性交叉反应，导致不能准确评估不同血清型口蹄疫病毒抗体水平；2、单一血清型抗体检测技术不能覆盖血清型内全部毒株产生的抗体，尤其是针对国内常用疫苗毒株，易导致同一血清型内由于接种的不同毒株而出现漏检和误判。

3、单克隆抗体制备技术已发展数十年，在众多病毒性疾病的治疗和检测技术中得到了广泛的应用，其中也开展了一些基于单克隆抗体的口蹄疫病毒抗体检测方法的研究。grazioli等2020年建立了基于单克隆抗体的口蹄疫病毒o型、a型、c型和亚洲1型elisa血清抗体试剂盒(transboundary and emerging diseases,2020,67(6):3005-3015)，但是其单克隆抗体的制备和验证均基于欧洲主要流行毒株，其特异性和敏感性未经过亚洲主要流行毒株标准阳性血清验证。

4、中国专利cn110144329b公开了“杂交瘤细胞株6b1及其分泌的抗口蹄疫a型病毒的单克隆抗体与应用”，该发明建立的elisa检测方法在特异性评价中，对已知猪源a型阴性样品和已知猪源o型抗体阳性样品，阴性检出率为(195/216)90％，特异性偏低，并且该发明样品验证检测谱窄，其建立的阴性样品局限于猪血清，缺少对同样为口蹄疫易感动物的牛和羊阴性血清的验证数据，由于牛羊血清与猪血清抗体背景存在显著差异，因此难以判断其对牛羊血清的特异性检测效果。另外，该发明缺少对目前国内重要疫苗用毒株os/99株(o型cathay遗传谱系)、o/hb/hk/99株(o型panasia遗传谱系)的交叉反应数据，而这两种毒株的抗原和抗体是容易获得的,由于口蹄疫病毒的易变异性，因此针对这两种病毒特异性验证是必要的。

5、中国专利cn111172118a公开了“抗a型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗a型口蹄疫抗原单克隆抗体及其应用”，该发明仅采用了1种间接elisa进行筛选，对筛选过程中使用的病毒和方法未作详述，仅在western blot验证过程中涉及o型缅甸98、0s99泛亚谱系i、a型阿克陶58、亚i江苏05、亚i克州03病毒抗原，o型、a型毒株没有涵盖国内主要流行毒株，并且国内目前已宣布无亚洲1型口蹄疫病毒流行，相关疫苗生产和科学研究2017年即已被禁止。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一株分泌a型口蹄疫病毒型单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

2、本发明提供了一株分泌a型口蹄疫病毒型单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为:小白鼠脾脏-骨髓瘤细胞杂交瘤细胞株，保藏编号为：cgmcc no.46034；保藏地址为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为：2024年8月8日。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

3、本发明同时提供了所述口蹄疫a型病毒mc10h2-f2杂交瘤细胞株cgmccno.46034分泌的口蹄疫a型病毒特异性单克隆抗体a10h2-f2。

4、本发明同时提供了所述口蹄疫a型病毒mc10h2-f2杂交瘤细胞株在口蹄疫病毒检测中的应用，所述检测包括抗原检测或抗体检测，所述检测可特异性检出口蹄疫a型病毒抗原和抗体，与口蹄疫o型病毒及其他病毒抗原和抗体无反应。

5、本发明同时提供了所述口蹄疫a型病毒特异性单克隆抗体a10h2-f2在口蹄疫病毒检测中的应用，所述检测包括抗原检测或抗体检测，所述检测可特异性检出口蹄疫a型病毒抗原和抗体，与口蹄疫o型病毒及其他病毒抗原和抗体无反应。

6、进一步，所述口蹄疫a型病毒包括毒株akt-ⅲ、af/72、re-a/wh/2009毒株，所述口蹄疫o型病毒包括毒株mya98/xj/2010、ohm/02、hb/hk/99、gx/09-7、os/99，所述其他病毒包括猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病病毒、蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻病毒、痘病毒、阿卡斑病毒。

7、本发明同时提供了一种分泌a型口蹄疫病毒型单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：

8、s1、a型口蹄疫病毒vp1蛋白原核表达和纯化；

9、s2、将s1获得的纯化后的vp1蛋白作为抗原免疫接种小白鼠，完成免疫后的小白鼠取出脾脏，与骨髓瘤细胞进行融合反应，获得团聚状杂交瘤细胞；

10、s3、首次筛选：当s2所述团聚状杂交瘤细胞克隆生长并占孔底面积约20％以上时，用re-a/wh/2009毒株灭活病毒作为包被抗原的elisa方法进行首次筛选，od450≥0.4判定为阳性克隆，阳性克隆移至24孔培养板中继续培养；

11、s4、第二次筛选：s3培养的阳性克隆杂交瘤细胞生长至50％～80％密度时进行第二次筛选，每孔上清液分别用re-a/wh/2009毒株灭活病毒、含10％血清的bhk-21细胞包被的抗原进行间接elisa板检测，淘汰可以与血清和bhk-21细胞混合液反应的杂交瘤细胞株，扩大培养仅可与口蹄疫病毒反应的杂交瘤细胞株；

12、s5、第三次筛选：s4扩大培养的杂交瘤细胞再次生长至50％～80％密度时进行第三次筛选，即竞争elisa筛选，应用a型akt-ⅲ、af72、re-a/wh/2009毒株和o型mya98/xj/2010、ohm/02、hb/hk/99、gx/09-7、os/99毒株标准阳性血清和杂交瘤细胞上清液分别与包被的a/wh/2009灭活病毒进行竞争反应，筛选出上清液与a型上述所有毒株抗体具有竞争性，即抑制率≥60％，同时与o型所有毒株无竞争性或竞争性较低，即抑制率≤40％的杂交瘤细胞株，即获得分泌a型口蹄疫病毒型单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

13、本发明的有益效果如下：

14、1、本发明公开一株分泌a型口蹄疫病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分泌的单克隆抗体具备高度的血清型特异性，基于该单克隆抗体建立的a型口蹄疫病毒celisa抗体检测方法可特异性检出a型口蹄疫病毒抗体，避免病毒血清型间交叉反应，适用于口蹄疫易感家畜猪、牛、羊，突破性提高检测技术的精准度。

15、2、本发明制备的单克隆抗体可以覆盖目前国内生产的所有a型口蹄疫病毒灭活疫苗抗体，涉及毒株包括：akt-ⅲ毒株、af72毒株、re-a/wh/2009毒株，而与o型口蹄疫病毒mya98/xj/2010、ohm/02、hb/hk/99、gx/09-7、os/99毒株标准阳性血清及其他偶蹄家畜常见易感病毒无交叉反应。

16、3、本发明提供的杂交瘤细胞株生长旺盛，培养和冻存简便，单克隆抗体可以通过杂交瘤细胞培养自然分泌获得，也可以通过将杂交瘤细胞接种小白鼠腹腔后活体吸取腹液获得，单克隆抗体制备较容易。

17、4、基于本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体及在此基础上建立的a型口蹄疫病毒celisa(竞争酶联免疫吸附试验)抗体检测方法，可特异性检出目前国内主要流行毒株和疫苗用毒株a型口蹄疫病毒抗体，涵盖口蹄疫主要易感家畜猪、牛、羊，可提高疫苗免疫效果评价的的准确度和区分野生病毒感染与疫苗免疫产生的抗体。

18、5、本发明使用表达的a型口蹄疫病毒vp1结构蛋白制备单克隆抗体，vp1结构蛋白是病毒主要的血清型特异性蛋白，而现有技术使用的是全病毒颗粒，本发明更具有针对性；而且在a型口蹄疫病毒血清型特异性单克隆抗体筛选过程中，本发明使用了三步筛选方法，用不同的elisa方法(间接elisa方法、竞争elisa方法)逐步淘汰非特异性单克隆抗体和特异性较弱的单克隆抗体，并在第三次筛选过程中使用口蹄疫病毒标准阳性血清进行抑制率验证和筛选，标准阳性血清涵盖了国内目前主要疫苗用o型、a型毒株，适合应用于elisa抗体检测方法，并对疫苗免疫效果进行评价；本发明制备的单克隆抗体和建立的elisa抗体检测方法适用于猪、牛、羊a型口蹄疫病毒抗体检测，覆盖面较广,与口蹄疫病毒抗体经典评价方法中和试验检测结果相比较，阴阳性血清符合率为97.3％，高于现有同类单克隆抗体及检测方法。