一种用于检测致癌突变的crRNA、CRISPR-Cas系统及检测试剂盒

本发明属于生物，具体地，涉及一种用于检测致癌突变的crrna、crispr/cas13d检测试剂盒及其应用。

背景技术：

1、癌症是全球范围内导致死亡的主要原因之一，其发生和发展与多种基因突变密切相关。在众多致癌突变中，kras、idh1和braf基因的特定点突变在多种恶性肿瘤中高频出现，具有重要的临床诊断价值和治疗指导意义。

2、单核苷酸变异（snv）的检测是肿瘤分子分型、靶向治疗决策与耐药监测中的基础技术之一。当前临床与科研中常用的snv检测路线主要包括两类。第一类为传统分子检测平台，第二类为crispr核酸检测技术。

3、为突破传统平台在时效性与可及性方面的限制，crispr核酸检测技术被广泛开发。其中，cas13体系因其可直接识别rna并触发旁路切割信号，具备实现快速分子诊断的潜力。然而，针对snv高分辨鉴别这一特定需求，现有策略仍存在核心技术瓶颈，例如，单碱基判别中的特异性与灵敏度的平衡问题、反应动力学迟滞与时间成本增加、对前端扩增的高度依赖及其副作用以及位点可设计性受侧翼序列约束或偏好影响等。

4、因此，本领域亟需开发一种新的检测方法用于提升crispr体系在致癌单碱基突变判别中存在的灵敏度并克服扩增依赖与位点可设计性受限等技术问题。

技术实现思路

1、本发明提供了一种检测致癌突变的crrna、crispr/cas13d检测试剂盒及其应用。

2、在本发明的第一方面，提供了一种用于单碱基突变rna检测的crrna，所述crrna用于识别所述单碱基突变的位点位于所述crrna间隔区5’端第1-23位中任一位点，且所述crrna间隔区的长度为23nt；

3、所述crrna还具有如下设计：

4、(a) 在所述crrna间隔区5’端的以下位点区间包括0-3个错配：

5、第2-7位、第18-22位、或其组合。

6、在另一优选例中，所述crrna包括重复区（handle）和间隔区(guide)。

7、在另一优选例中，所述crrna用于识别所述单碱基突变的位点位于所述crrna间隔区5’端第2-13位中任一位点。

8、在另一优选例中，所述单碱基突变为致癌突变或致癌单核苷酸的变异(snv)。

9、在另一优选例中，所述致癌突变选自下组：kras g12d、idh1 r132c、braf v600e、或其组合。

10、在另一优选例中，当所述单碱基突变为kras g12d时，所述crrna选自下组：

11、(a) 未引入错配：

12、(a1) m0，所述m0包括如seq id no: 160所示的核苷酸；

13、(b) 引入一个错配（分别在第2-7位、第18-22位引入一个错配）：

14、(b1) m2，所述m2包括如seq id no: 221所示的核苷酸；

15、(b2) m3，所述m3包括如seq id no: 222所示的核苷酸；

16、(b3) m4，所述m4包括如seq id no: 223所示的核苷酸；

17、(b4) m5，所述m5包括如seq id no: 224所示的核苷酸；

18、(b5) m6，所述m6包括如seq id no: 225所示的核苷酸；

19、(b6) m17，所述m17包括如seq id no: 236所示的核苷酸；

20、(b7) m18，所述m18包括如seq id no: 237所示的核苷酸；

21、(b8) m19，所述m19包括如seq id no: 238所示的核苷酸；

22、(b9) m20，所述m20包括如seq id no: 239所示的核苷酸；

23、(b10) m21，所述m21包括如seq id no: 240所示的核苷酸；

24、(b11) m22，所述m22包括如seq id no: 241所示的核苷酸；

25、(c) 引入两个错配：

26、(c1) dm1，所述dm1包括如seq id no: 398所示的核苷酸；

27、(c2) dm2，所述dm2包括如seq id no: 399所示的核苷酸；

28、(c3) dm3，所述dm3包括如seq id no: 400所示的核苷酸；

29、(c4) dm4，所述dm4包括如seq id no: 401所示的核苷酸；

30、(c5) dm5，所述dm5包括如seq id no: 402所示的核苷酸；

31、(c6) dm6，所述dm6包括如seq id no: 403所示的核苷酸；

32、(c7) dm7，所述dm7包括如seq id no: 404所示的核苷酸；

33、(c8) dm8，所述dm8包括如seq id no: 405所示的核苷酸；

34、(c9) dm9，所述dm9包括如seq id no: 406所示的核苷酸；

35、(c10) dm10，所述dm10包括如seq id no: 407所示的核苷酸；

36、(c11) dm11，所述dm11包括如seq id no: 408所示的核苷酸；

37、(c12) dm12，所述dm12包括如seq id no: 409所示的核苷酸。

38、在另一优选例中，当所述单碱基突变为idh1 r132c时，所述crrna选自下组：

39、(a) 未引入错配：

40、(a1) m0，所述m0包括如seq id no: 163所示的核苷酸；

41、(b) 引入一个错配（分别在第2-7位、第18-22位引入一个错配）：

42、(b1) m2，所述m2包括如seq id no: 269所示的核苷酸；

43、(b2) m3，所述m3包括如seq id no: 270所示的核苷酸；

44、(b3) m4，所述m4包括如seq id no: 271所示的核苷酸；

45、(b4) m5，所述m5包括如seq id no: 272所示的核苷酸；

46、(b5) m6，所述m6包括如seq id no: 273所示的核苷酸；

47、(b6) m17，所述m17包括如seq id no: 284所示的核苷酸；

48、(b7) m18，所述m18包括如seq id no: 285所示的核苷酸；

49、(b8) m19，所述m19包括如seq id no: 286所示的核苷酸；

50、(b9) m20，所述m20包括如seq id no: 287所示的核苷酸；

51、(b10) m21，所述m21包括如seq id no: 288所示的核苷酸；

52、(b11) m22，所述m22包括如seq id no: 289所示的核苷酸；

53、(c) 引入两个错配：

54、(c1) dm1，所述dm1包括如seq id no: 349所示的核苷酸；

55、(c2) dm2，所述dm2包括如seq id no: 350所示的核苷酸；

56、(c3) dm3，所述dm3包括如seq id no: 351所示的核苷酸；

57、(c4) dm4，所述dm4包括如seq id no: 352所示的核苷酸；

58、(c5) dm5，所述dm5包括如seq id no: 353所示的核苷酸；

59、(c6) dm6，所述dm6包括如seq id no: 354所示的核苷酸；

60、(c7) dm7，所述dm7包括如seq id no: 355所示的核苷酸；

61、(c8) dm8，所述dm8包括如seq id no: 356所示的核苷酸；

62、(c9) dm9，所述dm9包括如seq id no: 357所示的核苷酸；

63、(c10) dm10，所述dm10包括如seq id no: 358所示的核苷酸；

64、(c11) dm11，所述dm11包括如seq id no: 359所示的核苷酸；

65、(c12) dm12，所述dm12包括如seq id no: 360所示的核苷酸。

66、在另一优选例中，当所述单碱基突变为braf v600e时，所述crrna选自下组：

67、(a) 未引入错配：

68、(a1) m0，所述m0包括如seq id no: 162所示的核苷酸；

69、(b) 引入一个错配（分别在第2-7位、第18-22位引入一个错配）：

70、(b1) m2，所述m2包括如seq id no: 315所示的核苷酸；

71、(b2) m3，所述m3包括如seq id no: 316所示的核苷酸；

72、(b3) m4，所述m4包括如seq id no: 317所示的核苷酸；

73、(b4) m5，所述m5包括如seq id no: 318所示的核苷酸；

74、(b5) m6，所述m6包括如seq id no: 319所示的核苷酸；

75、(b6) m17，所述m17包括如seq id no: 330所示的核苷酸；

76、(b7) m18，所述m18包括如seq id no: 331所示的核苷酸；

77、(b8) m19，所述m19包括如seq id no: 332所示的核苷酸；

78、(b9) m20，所述m20包括如seq id no: 333所示的核苷酸；

79、(b10) m21，所述m21包括如seq id no: 334所示的核苷酸；

80、(b11) m22，所述m22包括如seq id no: 335所示的核苷酸；

81、(c) 引入两个错配：

82、(c1) dm1，所述dm1包括如seq id no: 373所示的核苷酸；

83、(c2) dm2，所述dm2包括如seq id no: 374所示的核苷酸；

84、(c3) dm3，所述dm3包括如seq id no: 375所示的核苷酸；

85、(c4) dm4，所述dm4包括如seq id no: 376所示的核苷酸；

86、(c5) dm5，所述dm5包括如seq id no: 377所示的核苷酸；

87、(c6) dm6，所述dm6包括如seq id no: 378所示的核苷酸；

88、(c7) dm7，所述dm7包括如seq id no: 379所示的核苷酸；

89、(c8) dm8，所述dm8包括如seq id no: 380所示的核苷酸；

90、(c9) dm9，所述dm9包括如seq id no: 381所示的核苷酸；

91、(c10) dm10，所述dm10包括如seq id no: 382所示的核苷酸；

92、(c11) dm11，所述dm11包括如seq id no: 383所示的核苷酸；

93、(c12) dm12，所述dm12包括如seq id no: 384所示的核苷酸。

94、在本发明的第二方面，提供了一种crispr-cas系统，包括：cas13d蛋白和本发明第一方面所述的crrna。

95、在另一优选例中，所述cas13d蛋白为野生型cas13d蛋白或融合了rna结构域的工程化cas13d蛋白。

96、在本发明的第三方面，提供了本发明第一方面所述的crrna在制备用于单碱基突变rna检测的crispr检测试剂盒中的用途。

97、在本发明的第四方面，提供了一种用于单碱基突变rna检测的crispr检测试剂盒，所述试剂盒中包括：

98、(a) 本发明第一方面所述的crrna；和

99、(b) cas13d蛋白。

100、在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：(c) 用于逆转录环介导等温扩增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，rt-lamp）的扩增组分。

101、在另一优选例中，所述试剂盒还包括(c)单链dna荧光报告分子。

102、在另一优选例中，所述cas13d蛋白为野生型cas13d蛋白或融合了rna结构域的工程化cas13d蛋白。

103、在另一优选例中，所述融合了rna结构域的工程化cas13d蛋白包括：

104、(a) 一个cas13d蛋白或其具有核酸酶活性的功能性片段；

105、(b) 至少一个异源的rna结合结构域(rbd)；

106、其中，所述至少一个异源的rna结合结构域插入在所述cas13d蛋白的选自下组的位点：n末端、c末端、对应于seq id no: 1的n47位点、对应于seq id no: 1的y119位点、或其组合；

107、并且，所述至少一个异源的rna结合结构域通过直接连接或连接肽插入至所述cas13d蛋白的相应位点；且当在多个位点插入至少一个异源的rna结合结构域时，每个位点的插入方式独立地选自直接连接或通过连接肽连接。

108、在另一优选例中，当所述cas13d蛋白或其具有核酸酶活性的功能性片段选自下组：全长cas13d蛋白、minicas13d蛋白、或其组合。

109、在另一优选例中，所述minicas13d蛋白的氨基酸序列如seq id no: 1所示。

110、在另一优选例中，所述对应于seq id no: 1的n47位点或y119位点是指：当所述cas13d蛋白与seq id no: 1所示的氨基酸序列进行比对时，与n47或y119具有对应位置的氨基酸残基位点。

111、在另一优选例中，所述工程化cas13d蛋白包含至少两个异源的rna结合结构域，所述至少两个异源的rna结合结构域插入在所述cas13d蛋白的至少两个不同的所述插入位点。

112、在另一优选例中，所述至少两个异源的rna结合结构域是不同的rna结合结构域。

113、在另一优选例中，所述rna结合结构域选自下组：rna识别基序（rrm）、kh结构域、c3h1型锌指、或其组合。

114、在另一优选例中，所述rna结合结构域的氨基酸序列选自下组：seq id no: 2-6所示的任一氨基酸序列、或其组合。

115、在另一优选的方面，本发明提供了一种融合rna结合结构域的工程化cas13d蛋白，具有式(i)或式(ii)所示的结构：

116、z - r 或 r - z (i)

117、z - (l1) - r - (l2) - z 或 z - (l1) - r1 - (l2) - z -(l3) - r2- (l4)- z (ii)

118、其中，z为cas13d蛋白或其具有核酸酶活性的功能性片段，或其组成部分；

119、r、r1和r2各自独立地为无或异源的rna结合结构域(rbd)；

120、l1、l2、l3和l4各自独立地为无或连接肽；

121、并且，所述r、r1和r2插入在所述cas13d蛋白或其具有核酸酶活性的功能性片段的选自下组的位点：n末端、c末端、对应于seq id no: 1的n47位点、对应于seq id no: 1的y119位点、或其组合。

122、在另一优选例中，所述工程化cas13d蛋白的氨基酸序列选自下组：

123、(1) n47-rbd7 + y119-rbd6，其氨基酸序列如seq id no: 23所示；

124、(2) y119-rbd7，其氨基酸序列如seq id no: 17所示；

125、(3) y119-rbd6，其氨基酸序列如seq id no: 15所示；

126、(4) n47-rbd7，其氨基酸序列如seq id no: 21所示；

127、(5) y119-rbd3，其氨基酸序列如seq id no: 13所示；

128、或其组合。

129、在本发明的第五方面，提供了一种检测待测样本中致癌突变的方法，包括步骤：

130、使用本发明第四方面所述的试剂盒对待测样本进行检测。

131、在另一优选例中，所述方法是体外方法。

132、在另一优选例中，所述方法是非诊断和非治疗性的。

133、在另一优选例中，所述方法还包括在检测前对所述待测样本进行环介导等温扩增(lamp)。

134、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。