敲除PEP4、BAR1、PRB1和YPS7基因在降低马克斯克鲁维酵母对乳铁蛋白降解中的应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及敲除pep4、bar1、prb1和yps7基因在降低马克斯克鲁维酵母对乳铁蛋白降解中的应用。

背景技术：

1、乳铁蛋白，作为一种多功能性糖蛋白，在多个领域展现出其独特的应用潜力。它在哺乳动物的乳汁中普遍存在，以其免疫调节和抗菌特性而著称。特别是在婴幼儿配方食品中，乳铁蛋白的添加已被证实能够促进免疫机能的发展和肠道健康。参照《食品营养强化剂乳铁蛋白》(gb1903.17—2016)的有关规定，乳铁蛋白作为食品营养强化剂，能够应用到包括婴儿配方奶粉、发酵乳等多种乳制品中。

2、目前，乳铁蛋白主要依赖于从乳汁中提取，然而这种方法受到乳源的限制，导致我国乳铁蛋白主要依赖于进口。为了克服这一限制，科研人员探索了利用酵母作为宿主细胞来表达乳铁蛋白的策略。酵母表达系统的优势在于其真核特性，能够进行复杂的蛋白质后修饰，同时具备遗传操作的便利性和高密度培养的潜力。

3、然而，异源蛋白在酵母中的表达并非没有挑战。由内源蛋白酶引起的降解问题在酵母中普遍存在，并且容易被环境胁迫诱导。由驻留蛋白酶引起的蛋白质水解发生在重组蛋白的囊泡运输过程中，而由分泌型蛋白酶、细胞壁锚定型蛋白酶或在高密度发酵期间由细胞破裂而释放到培养基中蛋白酶引起的蛋白水解往往发生在胞外。异源蛋白的降解这不仅影响了目标蛋白的产量，也给下游纯化过程带来了诸多的不便。

4、为了应对异源蛋白质在酵母中的水解问题，研究人员已经探索了多种策略，这些策略涉及对培养条件的精细调控和培养基成分的优化。例如，通过调整ph值、温度以及控制细胞的生长速率，可以降低蛋白酶的活性。此外，通过在培养基中添加特定的氨基酸如酪氨酸，或者使用蛋白胨作为替代底物，可以与蛋白酶的底物竞争，从而减少异源蛋白的水解。同时，降低培养基中的盐浓度也是一种有效的策略，因为它可以减少蛋白酶的活性。

5、尽管上述方法在一定程度上可以减缓蛋白质的水解，但它们并没有从根本上解决问题，并且可能给后续的蛋白质分离和纯化过程带来额外的挑战。为了根本性地解决蛋白酶引起的水解问题，需要采取更为深入的策略，如通过基因工程手段改造酵母，构建蛋白酶缺陷型的表达宿主。这种改造可以通过敲除或抑制特定蛋白酶基因的表达来实现，从而在分子水平上减少异源蛋白的水解，提高其在酵母中的稳定性和表达量。通过这种方法，可以为生产高质量的异源蛋白提供更为稳定和高效的平台。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，缓解乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中的降解问题，本发明提供了一种通过敲除pep4、bar1、prb1和yps7基因的方法，从而达到降低马克斯克鲁维酵母对乳铁蛋白降解的目的。

2、第一方面，本发明要求保护抑制pep4蛋白、bar1蛋白、prb1蛋白和yps7蛋白表达在如下任一中的应用：

3、(a1)降低马克斯克鲁维酵母对乳铁蛋白的降解；

4、(a2)降低马克斯克鲁维酵母的发酵上清液对乳铁蛋白的降解。

5、第二方面，本发明要求保护能够使马克斯克鲁维酵母中pep4蛋白、bar1蛋白、prb1蛋白和yps7蛋白的表达量降低的物质在如下任一中的应用：

6、(a1)降低马克斯克鲁维酵母对乳铁蛋白的降解；

7、(a2)降低马克斯克鲁维酵母的发酵上清液对乳铁蛋白的降解。

8、其中，所述物质可为靶向所述pep4蛋白、所述bar1蛋白、所述prb1蛋白和所述yps7蛋白的编码基因的shrna或所述shrna的化学修饰物、靶向所述pep4蛋白、所述bar1蛋白、所述prb1蛋白和所述yps7蛋白的编码基因的sirna或所述sirna的化学修饰物、能够表达所述shrna或所述sirna的表达载体或重组微生物、靶向所述pep4蛋白、所述bar1蛋白、所述prb1蛋白和所述yps7蛋白的编码基因的基因编辑工具(如crispr/cas技术、talen技术等)等。

9、在本发明的一个实施案例中，所述物质包括(或为)靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中pep4蛋白的编码基因的crispr/cas9编辑工具1，靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中bar1蛋白的编码基因的crispr/cas9编辑工具2，靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中prb1蛋白的编码基因的crispr/cas9编辑工具3，和靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中yps7蛋白的编码基因的crispr/cas9编辑工具4。

10、进一步地，所述crispr/cas9编辑工具1的靶序列如seq id no.5所示；所述crispr/cas9编辑工具2的靶序列如seq id no.10所示；所述crispr/cas9编辑工具3的靶序列如seq idno.15所示；所述crispr/cas9编辑工具4的靶序列如seq id no.20所示。

11、更进一步地，所述crispr/cas9编辑工具1具体包括重组载体1和同源重组片段1；所述重组载体1能够表达cas9蛋白和靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中pep4蛋白的编码基因的grna；所述同源重组片段1自5’端到3’端依次由上游同源臂1和下游同源臂1组成。在所述重组载体1中，用于表达所述grna的间隔区(spacer)的编码序列为cccacaagaaacattctcca(seq id no.5)。所述上游同源臂1的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述下游同源臂1的核苷酸序列如seq id no.4所示。

12、更进一步地，所述crispr/cas9编辑工具2具体包括重组载体2和同源重组片段2；所述重组载体2能够表达cas9蛋白和靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中bar1蛋白的编码基因的grna；所述同源重组片段2自5’端到3’端依次由上游同源臂2和下游同源臂2组成。在所述重组载体2中，用于表达所述grna的间隔区(spacer)的编码序列为agtttgccacctctacgtca(seq id no.10)。所述上游同源臂2的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述下游同源臂2的核苷酸序列如seq id no.9所示。

13、更进一步地，所述crispr/cas9编辑工具3具体包括重组载体3和同源重组片段3；所述重组载体3能够表达cas9蛋白和靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中prb1蛋白的编码基因的grna；所述同源重组片段3自5’端到3’端依次由上游同源臂3和下游同源臂3组成。在所述重组载体3中，用于表达所述grna的间隔区(spacer)的编码序列为tacgacgacgatgccggtaa(seq id no.15)。所述上游同源臂3的核苷酸序列如seq id no.13所示；所述下游同源臂3的核苷酸序列如seq id no.14所示。

14、更进一步地，所述crispr/cas9编辑工具4具体包括重组载体4和同源重组片段4；所述重组载体4能够表达cas9蛋白和靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中yps7蛋白的编码基因的grna；所述同源重组片段4自5’端到3’端依次由上游同源臂4和下游同源臂4组成。在所述重组载体4中，用于表达所述grna的间隔区(spacer)的编码序列为attgttcacgatatcgaaag(seq id no.20)。所述上游同源臂4的核苷酸序列如seq id no.18所示；所述下游同源臂4的核苷酸序列如seq id no.19所示。

15、第三方面，本发明要求保护一种降低马克斯克鲁维酵母或其发酵上清液对乳铁蛋白降解能力的方法。

16、本发明要求保护的降低马克斯克鲁维酵母或其发酵上清液对乳铁蛋白降解能力的方法，可包括如下步骤：抑制马克斯克鲁维酵母受体菌中的pep4蛋白、bar1蛋白、prb1蛋白和yps7蛋白的编码基因的表达，从而实现降低马克斯克鲁维酵母或其发酵上清液对乳铁蛋白的降解能力。

17、在所述方法中，抑制所述马克斯克鲁维酵母受体菌中的所述pep4蛋白的编码基因的表达可通过crispr/cas9基因编辑技术实现。抑制所述马克斯克鲁维酵母受体菌中的所述bar1蛋白的编码基因的表达通过crispr/cas9基因编辑技术实现。抑制所述马克斯克鲁维酵母受体菌中的所述prb1蛋白的编码基因的表达通过crispr/cas9基因编辑技术实现。抑制所述马克斯克鲁维酵母受体菌中的所述yps7蛋白的编码基因的表达通过crispr/cas9基因编辑技术实现。

18、进一步地，抑制所述马克斯克鲁维酵母受体菌中的所述pep4蛋白的编码基因的表达通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入crispr/cas9编辑工具1实现。在本发明的一个实施案例中，所述crispr/cas9编辑工具1的靶序列如seq id no.5所示。具体地，所述crispr/cas9编辑工具1具体包括重组载体1和同源重组片段1；所述重组载体1能够表达cas9蛋白和靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中pep4蛋白的编码基因的grna；所述同源重组片段1自5’端到3’端依次由上游同源臂1和下游同源臂1组成。更进一步地，在所述重组载体1中，用于表达所述grna的间隔区(spacer)的编码序列为cccacaagaaacattctcca(seqid no.5)。更进一步地，所述上游同源臂1的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述下游同源臂1的核苷酸序列如seq id no.4所示。

19、进一步地，抑制所述马克斯克鲁维酵母受体菌中的所述bar1蛋白的编码基因的表达通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入crispr/cas9编辑工具2实现。在本发明的一个实施案例中，所述crispr/cas9编辑工具2的靶序列如seq id no.10所示。具体地，所述crispr/cas9编辑工具2具体包括重组载体2和同源重组片段2；所述重组载体2能够表达cas9蛋白和靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中bar1蛋白的编码基因的grna；所述同源重组片段2自5’端到3’端依次由上游同源臂2和下游同源臂2组成。更进一步地，在所述重组载体2中，用于表达所述grna的间隔区(spacer)的编码序列为agtttgccacctctacgtca(seqid no.10)。更进一步地，所述上游同源臂2的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述下游同源臂2的核苷酸序列如seq id no.9所示。

20、进一步地，抑制所述马克斯克鲁维酵母受体菌中的所述prb1蛋白的编码基因的表达通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入crispr/cas9编辑工具3实现。在本发明的一个实施案例中，所述crispr/cas9编辑工具3的靶序列如seq id no.15所示。具体地，所述crispr/cas9编辑工具3具体包括重组载体3和同源重组片段3；所述重组载体3能够表达cas9蛋白和靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中prb1蛋白的编码基因的grna；所述同源重组片段3自5’端到3’端依次由上游同源臂3和下游同源臂3组成。更进一步地，在所述重组载体3中，用于表达所述grna的间隔区(spacer)的编码序列为tacgacgacgatgccggtaa(seqid no.15)。更进一步地，所述上游同源臂3的核苷酸序列如seq id no.13所示；所述下游同源臂3的核苷酸序列如seq id no.14所示。

21、进一步地，抑制所述马克斯克鲁维酵母受体菌中的所述yps7蛋白的编码基因的表达通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入crispr/cas9编辑工具4实现。在本发明的一个实施案例中，所述crispr/cas9编辑工具4的靶序列如seq id no.20所示。具体地，所述crispr/cas9编辑工具4具体包括重组载体4和同源重组片段4；所述重组载体4能够表达cas9蛋白和靶向马克斯克鲁维酵母受体菌基因组中yps7蛋白的编码基因的grna；所述同源重组片段4自5’端到3’端依次由上游同源臂4和下游同源臂4组成。更进一步地，在所述重组载体4中，用于表达所述grna的间隔区(spacer)的编码序列为attgttcacgatatcgaaag(seqid no.20)。更进一步地，所述上游同源臂4的核苷酸序列如seq id no.18所示；所述下游同源臂4的核苷酸序列如seq id no.19所示。

22、第四方面，本发明要求保护前文第三方面中所述的方法在提高马克斯克鲁维酵母分泌表达乳铁蛋白的产量中的应用；

23、进一步地，在所述应用中，包括向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入乳铁蛋白的编码基因，使其在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的步骤。

24、第五方面，本发明要求保护一种构建对乳铁蛋白降解能力降低的马克斯克鲁维酵母重组菌的方法。

25、本发明要求保护的构建对乳铁蛋白降解能力降低的马克斯克鲁维酵母重组菌的方法，可包括前文第三方面中所述的步骤。

26、第六方面，本发明要求保护一种对乳铁蛋白降解能力降低的马克斯克鲁维酵母重组菌。

27、本发明要求保护的对乳铁蛋白降解能力降低的马克斯克鲁维酵母重组菌是采用前文第五方面中所述方法构建得到的。

28、第七方面，本发明要求保护如下任一应用：

29、(c1)前文第六方面中所述的马克斯克鲁维酵母重组菌在制备复配制剂中的应用；所述复配制剂中含有：a1)所述马克斯克鲁维酵母重组菌和/或其发酵产物(发酵上清液)；和，a2)乳铁蛋白；

30、(c2)前文第六方面中所述的马克斯克鲁维酵母重组菌和乳铁蛋白在制备复配制剂中的应用；所述复配制剂中含有：a1)所述马克斯克鲁维酵母重组菌和/或其发酵产物(发酵上清液)；和，a2)乳铁蛋白。

31、第八方面，本发明要求保护一种复配制剂。

32、本发明要求保护的复配制剂含有：a1)前文第五方面中所述的马克斯克鲁维酵母重组菌和/或其发酵产物(发酵上清液)；和，a2)乳铁蛋白。

33、在上述各相关方面中，所述pep4蛋白可为如下任一所示蛋白质：

34、(d1)氨基酸序列为seq id no.1的蛋白质；

35、(d2)将seq id no.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的且来源于马克斯克鲁维酵母的蛋白质；

36、(d3)与(d1)-(d2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于马克斯克鲁维酵母的具有相同功能的蛋白质；

37、(d4)在(d1)-(d3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

38、在上述各相关方面中，所述bar1蛋白可为如下任一所示蛋白质：

39、(e1)氨基酸序列为seq id no.6的蛋白质；

40、(e2)将seq id no.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的且来源于马克斯克鲁维酵母的蛋白质；

41、(e3)与(e1)-(e2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于马克斯克鲁维酵母的具有相同功能的蛋白质；

42、(e4)在(e1)-(e3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

43、在上述各相关方面中，所述prb1蛋白可为如下任一所示蛋白质：

44、(f1)氨基酸序列为seq id no.11的蛋白质；

45、(f2)将seq id no.11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的且来源于马克斯克鲁维酵母的蛋白质；

46、(f3)与(f1)-(f2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于马克斯克鲁维酵母的具有相同功能的蛋白质；

47、(f4)在(f1)-(f3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

48、在上述各相关方面中，所述yps7蛋白可为如下任一所示蛋白质：

49、(g1)氨基酸序列为seq id no.16的蛋白质；

50、(g2)将seq id no.16所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的且来源于马克斯克鲁维酵母的蛋白质；

51、(g3)与(g1)-(g2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于马克斯克鲁维酵母的具有相同功能的蛋白质；

52、(g4)在(g1)-(g3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

53、上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同一性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

54、所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述85％以上的同一性可为至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述95％以上的同一性可为至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

55、在上述各相关方面中，所述pep4蛋白的编码基因可为如下任一所示dna分子

56、(h1)seq id no.2所示的dna分子；

57、(h2)在严格条件下与(h1)限定的dna分子杂交且编码所述pep4蛋白的dna分子；

58、(h3)与(h1)-(h2)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述pep4蛋白的dna分子。

59、在上述各相关方面中，所述bar1蛋白的编码基因为如下任一所示dna分子：

60、(i1)seq id no.7所示的dna分子；

61、(i2)在严格条件下与(i1)限定的dna分子杂交且编码所述bar1蛋白的dna分子；

62、(i3)与(i1)-(i2)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述bar1蛋白的dna分子。

63、在上述各相关方面中，所述prb1蛋白的编码基因可为如下任一所示dna分子：

64、(j1)seq id no.12所示的dna分子；

65、(j2)在严格条件下与(j1)限定的dna分子杂交且编码所述prb1蛋白的dna分子；

66、(j3)与(j1)-(j2)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述prb1蛋白的dna分子。

67、在上述各相关方面中，所述yps7蛋白的编码基因可为如下任一所示dna分子：

68、(k1)seq id no.17所示的dna分子；

69、(k2)在严格条件下与(k1)限定的dna分子杂交且编码所述yps7蛋白的dna分子；

70、(k3)与(k1)-(k2)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述yps7蛋白的dna分子。

71、上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mna3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％ sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％ sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％ sds和1×ssc，0.1％ sds各洗膜一次。

72、上述基因中，可使用国际互联网上的同一性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastn作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existencecost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

73、上述基因中，所述95％以上的同一性可为至少96％、97％、98％或99％的同一性。所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述85％以上的同一性可为至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

74、在上述各相关方面中，所述马克斯克鲁维酵母受体菌为ura3基因缺失的马克斯克鲁维酵母。因生产要求不得引入抗性筛选标记，故敲除基因组ura3基因。

75、在本发明的一个实施案例中，所述马克斯克鲁维酵母受体菌为敲除了马克斯克鲁维酵母cs-01基因组中ura3基因后所得；所述马克斯克鲁维酵母cs-01在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为cgmcc no.30573。

76、实验证明，pep4蛋白、bar1蛋白、prb1蛋白和yps7蛋白的编码基因在酵母细胞中被敲除后可导致乳铁蛋白降解量下降，完整蛋白量显著提高。通过摇瓶发酵菌株，获取上清，发现敲除pep4蛋白、bar1蛋白、prb1蛋白和yps7蛋白的编码基因后明显缓解了乳铁蛋白的降解情况。本发明对于提高乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中分泌表达产量具有重要意义。

77、保藏说明

78、分类命名：马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)；

79、参椐的生物材料：cs-01；

80、保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

81、保藏机构简称：cgmcc；

82、地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

83、保藏日期：2024年5月9日；

84、保藏中心登记入册编号：cgmcc no.30573。