一种多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞系GAS6-RASA3融合基因及其检测试剂盒、检测方法和应用

本发明涉及生物医学，具体地说，是一种多发性骨髓瘤rpmi-8226细胞系

gas6-rasa3融合基因及其检测试剂盒、检测方法和应用。

背景技术：

0、技术背景

1、多发性骨髓瘤（multiple myeloma，mm）是一种以骨髓中克隆性浆细胞异常增生为特征的恶性肿瘤，占血液系统肿瘤的10%-15%，是一种发病率较高的老年性血液系统恶性肿瘤。应用骨髓瘤细胞系构建多发性骨髓瘤动物模型对于发病机制的探究和药物的研发具有重要的意义。rpmi-8226细胞是一种人源多发性骨髓瘤细胞系，被广泛应用于多发性骨髓瘤小鼠模型的构建。

2、目前，小鼠体内骨髓瘤细胞含量的检测主要依赖流式细胞仪检测等技术。然而，这些方法的检测灵敏度较低，通常只能达到万分之一（10-4）的数量级水平。这种灵敏度的限制使得现有技术难以有效捕捉骨髓瘤的早期病变或微小残留病变（mrd）的动态变化。因此，开发一种高灵敏度的检测技术，以精准监测骨髓瘤的发病进程和微小残留病变，已成为该领域亟待解决的关键问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种多发性骨髓瘤rpmi-8226细胞系

gas6-rasa3融合基因及其检测试剂盒、检测方法和应用，该融合基因可以作为多发性骨髓瘤细胞的特异性分子标志物，用以制备监测动物模型中多发性骨髓瘤疾病进程及骨髓瘤细胞微小残留病变的产品。

2、所述

gas6-rasa3融合基因的序列如seq id no:1所示。该融合基因由

gas6及

rasa3融合形成，存在于多发性骨髓瘤rpmi-8226细胞株中。

3、本发明还提供了一种检测多发性骨髓瘤rpmi-8226细胞株的试剂盒，所述的试剂盒包括带有

gas6-rasa3融合基因的质粒标准品的阳性对照。

4、进一步地，所述的试剂盒还包括：上游引物、下游引物、taqman探针、鼠源内参上游引物、鼠源内参下游引物、鼠源内参探针、pcr反应缓冲液、阴性对照；所述上游引物的核苷酸序列如seq id no:2所示；所述下游引物的核苷酸序列如seq id no:3所示；所述taqman探针的核苷酸序列如seq id no:4所示；所述鼠源内参上游引物的核苷酸序列如seq idno:5所示；所述鼠源内参下游引物的核苷酸序列如seq id no:6所示；所述鼠源内参探针的核苷酸序列如seq id no:7所示。

5、进一步地，所述的taqman探针的5’端标记有fam基团，所述taqman探针的3’端标记有bhq基团。所述阳性对照包含有带有

gas6-rasa3融合基因的质粒标准品和带有小鼠来源

actb（

mactb）基因的质粒。所述阴性对照包含3株其他多发性骨髓瘤细胞的cdna。

6、所述的试剂盒用于检测rpmi-8226细胞株中的

gas6-rasa3融合基因，检测方法包括以下步骤：

7、（1）提取rpmi-8226细胞的总rna，将rna 反转录为cdna作为待测样品；

8、（2）配置pcr反应液，再分别加入待测样品、阳性对照和阴性对照；

9、（3）实时荧光pcr仪上检测，反应条件：95℃预变性1 min；95℃，15 s，58℃，35 s，反应40个循环，荧光信号于56℃，35 s时采集；其中所述pcr反应液包括上游引物、下游引物、taqman探针、鼠源内参上游引物、鼠源内参下游引物、鼠源内参探针、pcr反应缓冲液。

10、进一步地，所述的rpmi-8226细胞株取自多发性骨髓瘤小鼠模型。

11、内参基因

mactb的探针5’端标记有fam基团，探针的3’端标记有tamra基团，fam基团为报告基团，tamra为淬灭基团。

12、当待测样品中不存在目标dna分子时fam的荧光被bhq淬灭，不发出荧光；当待测样品中存在目标dna分子时，探针与目标dna分子结合，随后靠taq酶的5’→3’双链外切酶活性降解探针而释放荧光基团 fam，发出荧光。

13、pcr反应缓冲液为本领域常用缓冲液，一般包括cdna第一链合成试剂（hiscript®iii rt supermix for qpcr (+gdna wiper)试剂盒，诺唯赞生物公司，r323-01）和实时荧光pcr混合液（pro taq hs premix probe qpcr kit，accurate biotechnology公司，ag11704），其主要成分包含dna聚合酶、mg2+、dntp、逆转录酶、dtt。

14、检测实验结果成立的条件为：若无目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阴性；若有目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阳性。若内参、阳性对照以及阴性对照出现异常，则需查明原因，做出调整后重新检测。

15、本发明鉴定并验证了多发性骨髓瘤细胞rpmi-8226携带一种新融合基因

gas6-

rasa3，继而开发了一款实时荧光定量pcr和taqman探针技术相结合的融合基因检测和定量试剂盒。实时荧光pcr的结果用ct值表示，具有特异度好，灵敏度高，操作简单，结果更直观等优点，是目前微量融合基因检测的首选方法。本发明试剂盒采用taqman探针实时荧光pcr检测

gas6-rasa3融合基因，对小鼠mrd进行监测。

16、本发明的有益效果在于：

17、（1）应用生物信息学技术筛选鉴定到多发性骨髓瘤细胞rpmi-8226携带的融合基因

gas6-rasa3，是至今未见报道的新融合基因，其可以作为特异分子标志物应用于监测动物模型中多发性骨髓瘤发病进程及骨髓瘤细胞微小残留病变的产品的制备。

18、（2）本发明涉及的

gas6-rasa3融合基因检测试剂盒具有如下优势：①准确性高：同时使用探针和引物双重控制，特异性好、假阳性低。②特异性强：使用特异性探针识别融合基因序列。③全程监控：实时监测全程扩增信号。④安全简便：操作简单安全，自动化程度高而且防止污染。⑤快速：完成检测时间为100 min。

19、（3）本发明采用实时荧光pcr技术结合taqman探针，检测小鼠体内

gas6-rasa3融合基因和鼠源内参基因

mactb的表达情况，能把低丰度的基因信号从复杂背景中分辨出来的，其灵敏度可以达到百万分之一（10-6）的灵敏度水平，对于多发性骨髓瘤动物模型构建、评价药物疗效具有非常大的应用潜力。