一种Kit基因点突变小鼠模型、构建方法及其应用

本发明涉及基因工程，具体而言，涉及一种kit基因点突变小鼠模型、构建方法及其应用。

背景技术：

1、胃肠道间质瘤是胃肠道最常见的间叶源性恶性肿瘤，其发病核心机制为kit或pdgfra基因发生功能获得性突变，其中kit基因突变占所有病例的75%-80%，而外显子11区域的突变又占kit突变病例的57%-87.9%，是gist发生的主导驱动因素。

2、目前gist的基础研究与药物评价多依赖细胞系皮下移植瘤模型，该类模型无法模拟肿瘤自发发生、原位生长以及肿瘤微环境形成的完整病理过程，与临床疾病的匹配度较低。已有的基因编辑动物模型普遍存在成瘤效率低、肿瘤发生部位不特异、病理特征与人类疾病差异大、品系遗传稳定性不足等缺陷，难以满足gist发病机制深度研究与靶向药物筛选评价的需求。

3、因此，构建一种可自发成瘤、病理特征高度模拟人类gist、遗传稳定的实验动物模型，具有重要的科研价值与应用前景。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种kit基因点突变小鼠模型、构建方法及其应用，以至少解决现有技术中胃肠道间质瘤动物模型难以实现原位自发成瘤、病理特征与人类疾病匹配度低且遗传稳定性不足，无法满足发病机制研究与靶向药物筛选评价的需求的问题。

2、为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种kit基因工程胃肠道间质瘤小鼠模型，所述小鼠的基因组中kit基因第11外显子存在v558del缺失突变，其中，所述v558del缺失突变对应kit-201转录本所编码蛋白的第558位缬氨酸残基缺失，所述小鼠可自发形成胃肠道间质瘤。

3、可选地，所述小鼠具有c57bl/6j遗传背景。

4、可选地，所述小鼠为kit基因v558del杂合突变小鼠。

5、本发明第二方面提供一种构建本发明所述小鼠模型的方法，包括如下步骤：

6、编辑靶点设计与供体核酸制备：以小鼠kit-201转录本为参考序列，设计靶向kit基因第11外显子v558编码位点的sgrna，同时合成携带v558del缺失突变的单链寡核苷酸供体dna；

7、编辑体系配制与受精卵显微注射：将cas9蛋白、所述sgrna与所述单链寡核苷酸供体dna混合配制编辑体系，通过显微注射导入小鼠受精卵；

8、胚胎移植与首建小鼠获得：将注射后存活的受精卵移植至假孕雌性小鼠的输卵管内，待产获得f0代首建小鼠；

9、基因型鉴定与稳定品系繁育：对f0代小鼠进行基因型鉴定，筛选携带目标突变的阳性嵌合小鼠，将阳性嵌合小鼠与野生型小鼠交配，获得可稳定遗传的杂合突变小鼠。

10、可选地，编辑靶点设计与供体核酸制备步骤中，所述sgrna的靶序列为seq idno.1。

11、可选地，编辑靶点设计与供体核酸制备步骤中，所述单链寡核苷酸供体dna的序列为seq id no.2。

12、可选地，所述基因型鉴定与稳定品系繁育步骤中，基因型鉴定采用pcr扩增结合测序的方式，其中pcr扩增所用的引物序列包括：

13、正向引物序列为seq id no.3；

14、反向引物序列为seq id no.4。

15、可选地，所述基因型鉴定的判定标准为：测序峰图在v558编码位点对应位置出现碱基缺失的杂合峰，序列比对确认存在对应缬氨酸密码子的缺失突变，即为阳性杂合突变小鼠。

16、可选地，对f0代首建小鼠进行基因型鉴定时，同步筛选生殖系携带目标突变的嵌合个体，选取生殖系嵌合阳性的小鼠与野生型小鼠进行交配。

17、本发明第三方面提供一种本发明所述的小鼠模型在胃肠道间质瘤病理机制研究、肿瘤免疫微环境分析、抗肿瘤药物筛选或抗肿瘤药物药效评价中的应用。

18、本发明技术方案的一种kit基因点突变小鼠模型、构建方法及其应用。所述小鼠的基因组中kit基因第11外显子存在v558del缺失突变，其中，所述v558del缺失突变对应kit-201转录本所编码蛋白的第558位缬氨酸残基缺失，所述小鼠可自发形成胃肠道间质瘤。本发明经系统筛选确定 kit-201 转录本为唯一编辑基准，保障突变可稳定激活 kit 激酶通路，成瘤表型高度贴合人类临床 gist；采用 crispr/cas9 结合单链寡核苷酸供体 dna 的定点敲入体系，配套全新专属的 sgrna、供体 dna 与基因型鉴定引物序列，大幅缩短模型构建周期，提升 f1 代阳性杂合小鼠获得效率；同时设置分层量化的多维度验证体系，经成瘤动力学观测、组织病理检测、致癌分子通路验证、肿瘤免疫微环境分析、靶向药物敏感性测试与生存期获益评价证实，该模型可在免疫健全背景下于盲肠原位自发形成间质瘤，其病理形态、激酶激活机制、免疫细胞浸润特征均高度模拟人类胃肠道间质瘤，可适配发病机制研究、肿瘤免疫分析、耐药机制研究、新型抗肿瘤药物筛选与药效评价等多种实验场景，应用范围更广，临床转化参考价值更高。

1.一种kit基因工程胃肠道间质瘤小鼠模型，其特征在于，所述小鼠的基因组中kit基因第11外显子存在v558del缺失突变，其中，所述v558del缺失突变对应kit-201转录本所编码蛋白的第558位缬氨酸残基缺失，所述小鼠可自发形成胃肠道间质瘤。

2.根据权利要求1所述的小鼠模型，其特征在于，所述小鼠具有c57bl/6j遗传背景。

3.根据权利要求1所述的小鼠模型，其特征在于，所述小鼠为kit基因v558del杂合突变小鼠。

4.一种构建权利要求1至3中任一项所述小鼠模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，编辑靶点设计与供体核酸制备步骤中，所述sgrna的靶序列为seq id no.1。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，编辑靶点设计与供体核酸制备步骤中，所述单链寡核苷酸供体dna的序列为seq id no.2。

7.根据权利要求4中所述的方法，其特征在于，所述基因型鉴定与稳定品系繁育步骤中，基因型鉴定采用pcr扩增结合测序的方式，其中pcr扩增所用的引物序列包括：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述基因型鉴定的判定标准为：测序峰图在v558编码位点对应位置出现碱基缺失的杂合峰，序列比对确认存在对应缬氨酸密码子的缺失突变，即为阳性杂合突变小鼠。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，对f0代首建小鼠进行基因型鉴定时，同步筛选生殖系携带目标突变的嵌合个体，选取生殖系嵌合阳性的小鼠与野生型小鼠进行交配。

10.权利要求1至3中任一项所述的小鼠模型在胃肠道间质瘤病理机制研究、肿瘤免疫微环境分析、抗肿瘤药物筛选或抗肿瘤药物药效评价中的应用。