一种产单核细胞李氏杆菌噬菌体裂解酶LysP70及应用

本发明涉及生物，具体涉及一种产单核细胞李氏杆菌噬菌体裂解酶lysp70及应用。

背景技术：

1、产单核细胞李氏杆菌是一种人畜共患病原菌，属于革兰阳性短杆菌，无芽孢，兼性厌氧，能产生鞭毛，耐低温(4℃下可生长)、耐盐(10％ nacl)、耐胆汁，可导致李氏杆菌病，对于孕妇、新生儿以及成人均具有严重的危害。目前，常用的治疗方法是抗生素治疗，但是，该菌具有极强的环境适应性并能产生生物被膜，对环境消毒剂及抗生素均有一定的耐受能力，据统计孕妇在患病后及时治疗可降低胎儿风险，但新生儿死亡率仍达20-30％。脑膜炎/败血症患者的死亡率约20-30％，幸存者可能遗留神经系统后遗症。

2、为了有效杀灭该菌，首先需要破坏产单核细胞李氏杆菌生物被膜，进一步破坏其细胞壁。裂解酶是噬菌体感染细菌过程中的一类很重要的酶，其结合结构域和催化结构域能够结合并降解细菌细胞壁。噬菌体裂解酶在结构和功能上与细菌自溶素相似，与哺乳动物肽聚糖识别蛋白家族密切相关。对于革兰阳性菌噬菌体，大多数裂解酶由两个结构域组成，即n端催化结构域(enzymatically active domains，ead)和c端细胞壁结合结构域(cell wall binding domain，cbd)，二者由一个短的肽链连接。ead有助于肽聚糖中不同键的切割，而cbd识别并特异性结合细菌细胞壁受体蛋白。尽管李氏杆菌对裂解酶有一定抗性，但改造裂解酶或联合其他抗菌手段可增强杀菌效果，在其他细菌研究中，已基于裂解酶开发出抗菌制剂，广泛应用于细菌感染相关疾病的治疗，且尚未发现细菌耐药问题。同时，天然裂解酶很难从噬菌体中提取出来，因此借助原核表达系统对裂解酶进行可溶性表达，保证其具有裂解酶活性。

3、基于上述技术问题，发明人在研究过程中发现了一种存在于产单核细胞李氏杆菌噬菌体p70中的裂解酶lysp7，原核表达该裂解酶并系统研究其酶学性质和抗菌活性，包括对细菌生物被膜的影响，进一步探索裂解酶lysp70在食品(牛奶、生菜)中初步应用的效果。

技术实现思路

1、本发明的第一方面是提供一种产单核细胞李氏杆菌噬菌体裂解酶lysp70，所述的裂解酶lysp70的氨基酸序列如seq id no.1所示。

2、本发明的第二方面是提供一种所述的裂解酶lysp70的编码基因，所述的编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3、本发明的第三方面是提供一种表达裂解酶lysp70的重组表达载体，所述的表达载体包括所述的裂解酶lysp70的核苷酸序列。

4、本发明的第四方面是提供一种表达裂解酶lysp70的重组工程菌，所述的重组工程菌是由所述的重组表达载体转化入宿主菌而成。

5、本发明的第五方面是提供所述的裂解酶lysp70或所述的重组表达载体或所述的重组工程菌在制备裂解产单核细胞李氏杆菌的试剂中的应用。

6、本发明的第六方面是提供一种裂解产单核细胞李氏杆菌的试剂，所述的试剂包括所述的裂解酶lysp70；所述的裂解酶lysp70的氨基酸序列如seq id no.1所示。

7、本发明的第七方面是提供一种抑菌剂，其主要活性成分为裂解酶lysp70，所述的裂解酶lysp70的氨基酸序列如seq id no.1所示。

8、本发明的第八方面是提供一种抑菌组合物，包括所述的抑菌剂和抗生素。

9、本发明的有益效果是：

10、(1)本发明提供了一种产单核细胞李氏杆菌噬菌体裂解酶lysp70，所述的裂解酶lysp70的氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.2所示。

11、(2)所述的裂解酶lysp70可以裂解产单核细胞李氏杆菌，具有良好的裂解活性，杀菌速度很快，对李氏杆菌属裂解范围很广，但对葡萄球菌和沙门菌没有裂解能力。该裂解酶活性在一定ph、温度、金属离子浓度、储存温度及时间范围内较为稳定。

12、(3)经裂解酶lysp70处理后的细菌对氨苄西林(amp)、强力霉素(do)和哌拉西林(pip)的敏感性有所增强，表现为抑菌圈直径的增大；但对头孢他啶(caz)和多粘菌素b(pb)仍具有强耐药性，无抑菌圈产生。

13、(4)所述的裂解酶lysp70对牛奶和生菜均具有裂解活性。裂解酶lysp70通过破坏生物被膜结构、减少生物被膜态细菌量和损害细菌形态来有效抑制生物被膜的形成，能够有效地破坏和清除预先形成的早期生物被膜和成熟生物被膜。对产单核细胞李氏杆菌生物被膜中细胞代谢活性具有显著的抑制作用，400μg/ml作用下抑制率最高为50％，随着浓度的降低，抑制作用减弱。

14、(5)裂解酶lysp70能够抑制产单核细胞李氏杆菌胞外多糖的产生，且随着浓度的不断增大，抑制作用增强；能够抑制产单核细胞李氏杆菌胞外蛋白的产生。

1.一种产单核细胞李氏杆菌噬菌体裂解酶lysp70，其特征在于，所述的裂解酶lysp70的氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.一种权利要求1所述的裂解酶lysp70的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.一种表达裂解酶lysp70的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体包括如权利要求2所述的裂解酶lysp70的核苷酸序列和载体。

4.一种表达裂解酶lysp70的重组工程菌，其特征在于，所述的重组工程菌是由权利要求3所述的重组表达载体转化入宿主菌而成。

5.如权利要求1所述的裂解酶lysp70或权利要求3所述的重组表达载体或权利要求4所述的重组工程菌在制备裂解产单核细胞李氏杆菌的试剂中的应用。

6.一种裂解产单核细胞李氏杆菌的试剂，其特征在于，所述的试剂包括权利要求1所述的裂解酶lysp70，所述的裂解酶lysp70的氨基酸序列如seq id no.1所示。

7.一种抑菌剂，其特征在于，其主要活性成分为裂解酶lysp70、含有裂解酶lysp70表达元件的重组表达载体、含有裂解酶lysp70表达元件的表达盒或含有裂解酶lysp70表达元件的重组工程菌中的至少一种，所述的裂解酶lysp70的氨基酸序列如seq id no.1所示。

8.一种抑菌组合物，其特征在于，包括权利要求7所述的抑菌剂和抗生素。