一种活性氧响应型两亲性共聚物及通过该共聚物包载神经保护剂的纳米胶束及其制备和应用的制作方法

本发明涉及两亲性共聚物和冰片纳米胶束领域，特别涉及一种活性氧响应型两亲性共聚物，以及通过该共聚物包载神经保护剂的纳米胶束及其制备方法以及该纳米胶束在治疗缺血性中风、特别是缺血/再灌注损伤药物中的应用。

背景技术：

1、缺血性中风是全球范围内致死和致残的主要原因之一。临床标准治疗是通过溶栓或机械取栓实现血管再通。然而，血流的恢复常会引发更严重的二次损伤，即缺血/再灌注损伤。据统计，约40%的中风幸存者会受此影响，导致长期的神经功能障碍。而缺血/再灌注损伤的核心机制之一是病灶区域大量活性氧的爆发，引发剧烈的氧化应激和炎症反应，导致神经元死亡。

2、目前，已被发现的银杏内酯b（ginkgolide b, gb）是一种极具潜力的天然产物，具有良好的抗炎、抗氧化和神经保护活性，特别是其神经保护活性的作用可以完美解决前述的问题，但其临床应用受到水溶性差、生物利用度低以及难以跨越血脑屏障（bbb）的限制，进一步研究发现，其他类似的神经保证剂也有相同的功能作用，同时业内研究者发现冰片（borneol, bo）是一种能够可逆、暂时开放bbb的助剂，但单独使用可能带来副作用。另外，目前该领域传统的给药方式往往缺乏靶向性，无法在病变部位精准释放药物，整体疗效有限且系统性副作用风险高。

3、因此，亟需一种能够同时发挥银杏内酯b等神经保护剂与冰片优势，能够高效清除活性氧并发挥神经保护作用的药物。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种活性氧响应型两亲性共聚物及通过该共聚物包载神经保护剂的纳米胶束，其能够同时发挥神经保护剂与bbb开启剂的优势作用，使药物能够跨越血脑屏障，从而实现脑靶向递送、并在缺血/再灌注损伤区域智能释放药物，高效清除活性氧并发挥神经保护作用，同时还提供了该纳米胶束的制备方法及其具体应用。

2、为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为一种活性氧响应型两亲性共聚物，其为由ros响应基团分别桥接亲水链段和疏水链段形成的共聚物，所述共聚物中亲水链段的端基通过bbb开启剂功能化修饰。

3、优选地，所述ros响应基团为二硒键或二硫键中至少一种；

4、优选地，所述bbb开启剂为单萜类bbb开启剂，进一步优选地，所述bbb开启剂选自冰片、异冰片、龙脑、异龙脑、薄荷醇中至少一种，其中冰片为冰片或其异构体、衍生物中的一种；

5、所述亲水链段为聚乙二醇链，分子量为500~5000 da；

6、所述疏水功能性端基由具有抗氧化活性的酚类小分子构成，进一步优选地，所述酚类小分子选自对羟基苯甲醇基团、对羟基苯甲酸基团、对羟基苯乙醇基团、香草醇基团中的一种；

7、优选地，活性氧响应型两亲性共聚物的结构通式为：bo-peg2k-se-se-hba，其中ros响应基团为二硒键，bbb开启剂为冰片，亲水链段为聚乙二醇链，分子量2000 da，疏水功能性端基的前体为对羟基苯甲醇。

8、一种活性氧响应的冰片-神经保护剂纳米胶束，其由活性氧响应型两亲性共聚物在水溶液自发自组装形成核-壳结构并包载神经保护剂而得。

9、优选地，所述神经保护剂为疏水性神经保护剂，进一步优选地，所述疏水性神经保护剂选自银杏内酯b、依达拉奉、姜黄素、白藜芦醇中的一种。

10、一种活性氧响应的冰片-神经保护剂纳米胶束的制备方法为：

11、s1、hba-cooh的合成：对羟基苯甲醇hba中加入丁二酸酐进行反应，实现对羟基苯甲醇hba的端基羧基化；

12、s2、bo-cooh的合成：冰片中加入丁二酸酐，冰片经丁二酸酐羧基功能化生成冰片丁二酸单酯；

13、s3、bo-peg2k-boc的合成：boc-peg2k-nh2（叔丁氧羰基-亚氨基-聚乙二醇-氨基）与bo-cooh在催化剂的edc和dmap的作用下进行反应，通过端基修饰策略分别引入冰片（bo）和叔丁氧羰基（boc）：一端经冰片丁二酸单酯（bo-cooh）与peg羟基酯化/酰胺化偶联，另一端引入boc保护的氨基，制备得到双端功能化聚乙二醇；

14、s4、bo-peg2k-nh2·tfa的合成：将bo-peg2k-boc在酸性条件下进行boc的脱除，即得bo-peg2k-nh2·tfa盐；

15、s5、bo-peg2k-se-se-nh2的合成：将bo-peg2k-nh2·tfa、丁二酸酐、硒代胱胺二盐酸盐在催化剂edc和dmap的作用下进行反应，生成bo-peg2k-se-se-nh2；

16、s6、bo-peg2k-se-se-hba的合成：将bo-peg2k-se-se-nh2与hba-cooh在在催化剂edc/dmap的作用下进行反应，生成bo-peg2k-se-se-hba；

17、s7、将bo-peg2k-se-se-hba与神经保护剂共溶于二甲基亚砜溶液中，注入水后进行透析处理，获得活性氧响应的冰片-神经保护剂纳米胶束。

18、优选地，步骤s1的具体操作方法为：

19、将对羟基苯甲醇溶于无水吡啶中，加入丁二酸酐，50℃条件下搅拌反应，反应结束后，减压旋转蒸发除去吡啶，得到黄色油状粗产物。向残留物中加入80 ml去离子水，搅拌下用hcl调ph至2~3，析出白色固体。抽滤，固体用冷水洗涤3次（每次20 ml），在40℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到白色粉末状hba-cooh。

20、优选地，步骤s2的具体操作方法为：

21、将冰片溶于无水吡啶中，加入丁二酸酐，50℃条件下搅拌反应，反应结束后，减压旋蒸除去吡啶，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用hcl、饱和食盐水洗涤。有机相用无水na2so4干燥，过滤，减压浓缩，得到白色蜡状固体bo-cooh。

22、优选地，步骤s3的具体操作方法为：

23、将boc-peg2k-nh2溶于n,n-二甲基甲酰胺，依次加入edc·hcl和dmap，室温下进行活化，得到反应液。将bo-cooh溶于无水dmf，缓慢滴入上述反应液中进行反应。反应结束后，加入饱和食盐水，用二氯甲烷萃取，通过用无水mgso4干燥，过滤，减压浓缩形成浓缩液，浓缩液经冰乙醚析出白色沉淀，并多次抽滤、洗、真空干燥，得到bo-peg2k-boc。

24、优选地，步骤s4的具体操作方法为：

25、将bo-peg2k-boc在冰浴下与三氟乙酸和二氯甲烷反应，反应结束后，减压旋蒸除去tfa和二氯甲烷，得到粘稠油状物。向残留物中加入乙醚，搅拌打浆，倾出上清液，重复多次，真空干燥后得到bo-peg2k-nh2·tfa盐。

26、优选地，步骤s5的具体操作方法为：

27、将bo-peg2k-nh2·tfa盐溶于dmf中，加入三乙胺，调节ph至弱碱性，加入丁二酸酐，室温搅拌30 min，后加入硒代胱胺二盐酸盐的甲醇溶液，接着加入edc·hcl和dmap。室温搅拌反应2 h。反应结束后，减压旋蒸除去大部分溶剂，残留物用少量dmf溶解，转移至1000 da透析袋中，在去离子水中透析24 h，收集透析袋内液体，冷冻干燥，得到淡黄色固体bo-peg2k-se-se-nh2。

28、优选地，步骤s6的具体操作方法为：

29、将bo-peg2k-se-se-nh2和hba-cooh溶于无水dmf，后加入edc·hcl和dmap进行反应，反应后的反应液经盐水稀释后，用二氯甲烷进行萃取，萃取后的有机相经干燥、过滤、减压浓缩形成浓缩液。浓缩液经冰乙醚析出沉淀，再经过抽滤和乙醚洗涤后，真空干燥，得到白色至淡黄色蜡状固体终产物bo-peg2k-se-se-hba。

30、优选地，步骤s7的具体操作方法为：

31、将bo-peg2k-se-se-hba共聚物和神经保护剂共同溶解于二甲基亚砜中，形成澄清的有机相，在超声波作用下将有机相加入去离子水中，所得的分散液转移至透析袋进行透析处理，以彻底除去dmso及未包封的神经保护剂，透析结束后，收集袋内液体，即得活性氧响应的冰片-神经保护剂纳米胶束溶液。

32、一种活性氧响应的冰片-神经保护剂纳米胶束在治疗缺血性中风、特别是缺血/再灌注损伤药物中的应用；以及在制备其他高ros相关中枢神经系统疾病（如创伤性脑损伤、阿尔茨海默病、帕金森病）药物中的应用。

33、采用上述技术方案，由于活性氧响应型两亲性共聚物在水溶液自发自组装形成核-壳结构并包载神经保护剂，所述两亲性共聚物中亲水链段的端基通过bbb开启剂进行功能化修饰，使其能够同时发挥bbb开启剂以及神经保护剂的功能特性，具体如下：

34、1、亲水链段的端基通过bbb开启剂进行功能化修饰，而亲水链段和疏水链段通过ros响应基团桥接下保持稳定，经采用银杏内酯b（gb）进行试验，包封率不低于81.7%，载药量约 10.7% ；

35、2、本发明的纳米胶束的平均水合粒径为 301.8±3.7 nm，zeta电位为-19.4±0.5mv，透射电镜下呈均匀球形，具有良好的胶体稳定性；

36、3、纳米胶束表面的bbb开启剂可暂时、可逆地开放血脑屏障，使纳米胶束高效进入脑组织，体外bbb模型显示，bseh@cy5.5穿透率是未修饰胶束的2.9倍；体内实时成像显示，游离cy5.5及seh@cy5.5 nps组小鼠脑部在各时间点荧光均极微弱；而bseh@cy5.5 nps组可快速靶向至mcao小鼠脑部，注射后2 h即达脑蓄积峰值（分别为前者的13.3倍和5.0倍），且直至12 h仍维持较高水平。离体荧光定量进一步证实，12 h时bseh@cy5.5 nps组脑荧光强度仍分别是游离cy5.5和seh@cy5.5 nps组的3.1倍和1.7倍。

37、4、纳米胶束中活性氧响应基团由于对缺血再灌注区域高浓度的活性氧敏感，在活性氧高深度区域，活性氧响应基团快速断裂，胶束崩解，12 h内gb释放率 > 80%；而正常生理条件下24 h释放率 < 20%，通过本发明的纳米胶束可以实现病灶精准释药。

38、5、本发明的纳米胶束可以实现多链段协同治疗的作用，其中神经保护剂具有抗炎、抗氧化、神经保护的作用，而疏水链段自身具有抗氧化、抗炎活性，释放后与神经保护剂协同清除自由基，减轻氧化应激损伤，同时神经保护剂除了开放血脑屏障外，其本身还具有改善微循环、抗炎等药理作用，本发明通过多功能链段在同一纳米平台实现了“1+1+1 > 3”的协同治疗效果。