传染性造血器官坏死病毒全预混实时荧光检测试剂盒

本发明属于农业和水产生物检测，具体涉及传染性造血器官坏死病毒全预混实时荧光检测试剂盒。

背景技术：

1、传染性造血器官坏死（infectious hematopoietic necrosis, ihn）是由传染性造血器官坏死病毒（infectious hematopoietic necrosis virus, ihnv）引起的一种病毒性疾病，主要危害鲑科鱼类中的大西洋鲑（salmo salar）和虹鳟（oncorhynchus mykiss），死亡率可高达90%，对野生及养殖鱼类种群造成显著影响。以往研究表明，传染性造血器官坏死病毒（ihnv）可在虹鳟血液中长期持续存在（约一年），成年鱼感染ihnv后可能不表现临床症状，但能作为传播媒介。此外，急性ihnv感染可在短时间内导致高死亡率。这些发现凸显了在急性和潜伏性ihnv感染阶段均需早期检测的重要性。目前已开发出多种ihnv诊断方法，包括酶联免疫吸附试验（elisa）、荧光抗体试验、免疫组化方法及分子方法。其中，世界动物卫生组织（woah）推荐采用细胞培养病毒分离或实时荧光定量rt-qpcr对临床患病鱼进行诊断。

2、针对传染性造血坏死病毒（ihnv）的检测，rt-qpcr技术从分子层面实现了高精准度检测，通过针对病毒保守基因序列设计特异性引物与探针，其检测灵敏度可达到10copies/μl以下，与需要7–14天的传统病毒分离培养法以及免疫荧光检测相比，检测效率提升百倍以上，能够在病毒感染的潜伏期实现早期判定，有效解决了ihnv在实际检测中难以早期发现、诊断滞后的问题。尽管rt-qpcr优势显著，但传统检测体系在操作上仍较为复杂，实验人员需要对引物、探针、酶、缓冲液等多种试剂分别进行解冻、混匀、分装与稀释等步骤，不仅流程冗长、耗时较多，还容易在操作过程中引入污染，而全预混反应体系将扩增所需的全部试剂预先配制完成，通常仅需加入模板rna即可直接进行荧光扩增，不仅大幅简化了样本前处理流程、降低了漏加、错加等操作误差，还能更好地适配高通量检测需求，显著提升检测通量。

3、然而，全预混体系在长期储存过程中的稳定性仍存在关键技术难题，在4℃或室温保存条件下，引物之间以及引物与探针之间易自发形成非特异性的二聚体或二级结构，进而引发非特异性扩增，不仅会干扰靶标扩增反应、消耗有效反应组分，还会导致荧光信号降低、ct值出现滞后或异常提前，显著提高假阳性结果的发生率，当引物二聚体的扩增效率超过目标核酸时，甚至会造成目标扩增完全被抑制、无扩增曲线出现，最终导致检测灵敏度急剧下降。因此，开发兼具快速、灵敏、特异、抗污染且长期均一稳定的ihnv全预混荧光定量检测试剂盒，具有重要的研究价值与实际应用意义。

技术实现思路

1、本发明提供传染性造血器官坏死病毒全预混实时荧光检测试剂盒，该试剂盒均一稳定，能够快速、高灵敏度、高特异性地检测传染性造血器官坏死病毒，污染易控。

2、本发明的目的采用如下技术方案实现：

3、传染性造血器官坏死病毒全预混实时荧光检测试剂盒，包括rt-qpcr全预混检测混合液，所述rt-qpcr全预混检测混合液包括上游茎环引物、下游茎环引物、检测探针和用于扩增检测的酶；所述上游茎环引物包含茎部和环部；上游茎环引物的茎部由其自身功能域1与功能域3互补配对而成，环部为其自身功能域2，上游茎环引物的功能域3的3’端连接其自身功能域4；上游茎环引物的功能域1～4依次对应seq id no:2的第1～6、7～12、13～18、19～32位碱基；所述下游茎环引物包含茎部和环部；下游茎环引物的茎部由其自身功能域1与功能域3互补配对而成，环部为其自身功能域2，下游茎环引物的功能域3的3’端连接其自身功能域4；下游茎环引物的功能域1～4依次对应seq id no:3的第1～6、7～12、13～18、19～32位碱基；所述检测探针的5’端标记荧光基团fam，3’端标记淬灭基团bhq1，核苷酸序列如seq id no:4所示。

4、在本发明中，所述用于扩增检测的酶包括m-mlv反转录酶、taq dna聚合酶和热敏ung酶。

5、在本发明中，所述试剂盒还包括阳性质控品，所述阳性质控品是携带传染性造血器官坏死病毒基因保守区靶序列的假病毒颗粒。

6、在本发明中，所述传染性造血器官坏死病毒基因保守区靶序列的核苷酸序列如seq id no.1所示。

7、本发明还提供以非诊断为目的采用所述试剂盒检测传染性造血器官坏死病毒的方法，包括如下步骤：

8、（1）提取样本rna，作为模板rna；取rt-qpcr全预混检测混合液10 μl，模板rna 10μl，混合，得到反应体系；

9、（2）将步骤（1）所得反应体系置于实时荧光定量pcr仪中，反应程序如下：50℃ 10min；95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，45个循环；采集fam通道荧光信号，获得ct值；

10、（3）结果判读标准：当ct值≤38时，判定样本检测结果为阳性；当ct值≥40或无ct值时，判定样本检测结果为阴性；当38

11、本发明相比现有技术具有以下优点：

12、（1）本发明提供传染性造血器官坏死病毒全预混实时荧光检测试剂盒，基于rt-qpcr技术，灵敏度高，特异性高。该试剂盒简化操作流程，减少误差，提升检测准确性、均一性和重复性。封闭式反应体系降低污染风险，提高检测稳定性。通过优化流程降低成本，提升效能，增强市场竞争力。试剂盒为水生动物疫病分子检测提供关键技术支撑。

13、（2）本发明传染性造血器官坏死病毒全预混实时荧光检测试剂盒，依托茎环结构介导的引物设计创新，在引物、探针和酶全预混体系中构建分子自锁体系，从分子层面提升反应稳定性与检测特异性。自锁状态下，引物分子有序排布，降低反应体系熵值，抑制分子间非特异性结合，阻断非特异性退火与延伸。该策略可消除全预混试剂因非特异性扩增引发的假阳性，改善荧光信号增量不足等关键技术瓶颈。本发明通过构象调控实现动态平衡，为全预混核酸检测体系的稳定储存与精准检测提供核心分子基础与技术保障；

14、（3）本发明传染性造血器官坏死病毒全预混实时荧光检测试剂盒，通过茎环引物结构的创新性设计，解决了传统全预混试剂盒对酶原料高度依赖及引物探针二聚体无序扩增的问题。该茎环引物可形成发夹结构或同源二聚物，能有效抑制引物间非特异性结合，显著降低对taq dna聚合酶及抗体封闭效率的要求。该设计可避免taq dna聚合酶的酶活泄漏时引发的非特异性扩增，从根本上解决传统方法中酶活性泄漏导致的假阳性问题，为高通量核酸检测提供经济高效的解决方案；

15、（4）本发明引物设计策略较传统分子信标发夹结构有显著热力学与动力学优势。传统分子信标靠5'与3'端互补配对形成封闭茎环结构，解旋需升温等被动方式，存在两大缺陷：热力学上无法自发启动链置换反应，茎部难解锁致引物失效，表现为扩增曲线异常、ct值延迟、荧光信号增幅不足；动力学上，低浓度靶核酸时倾向维持自身构象，难结合靶标，降低检测灵敏度。而本发明创新茎环引物结构，将功能域2~4设为靶核酸特异性结合序列，功能域2构成环部、功能域4为游离序列、功能域1和3形成自锁茎部，可动态自适应调控。靶核酸存在时，茎环引物的功能域4触发链置换反应，热力学上优先形成茎环-靶标复合物解锁，动力学上提升链置换速率，突破低丰度核酸检测灵敏度瓶颈。将该茎环引物用于ihnv全预混核酸检测试剂盒，可解决传统全预混体系对酶原料依赖及引物探针非特异性二聚体扩增问题，其发夹结构抑制引物非特异性结合，降低对taq dna聚合酶活性及抗体封闭效率要求，消除酶活泄漏致假阳性现象，为高通量核酸检测提供经济、高效、稳定方案；

16、（5）本发明创新设计茎环引物结构，实现与传染性造血器官坏死病毒一步法逆转录rna扩增体系高效兼容。与传统刚性发夹引物不同，本发明在茎环引物3'端保留未封闭功能域（功能域4），该功能域在逆转录温度（42℃–55℃）下动态解链，与ihnv rna模板高效结合。逆转录酶延伸时，茎环引物通过链置换反应解除发夹结构，维持引物活性位点，优先形成茎环-靶标复合物，借助游离柔性茎部结构提升解链速率，保证逆转录效率。核心优势在于：一是未封闭茎部在逆转录温度（如50℃）下热稳定性好，抑制引物自身解链和非特异性二聚体形成，保障检测特异性；二是提升引物与模板结合效率，扩增产物特异性和灵敏度优于传统发夹引物。该构象动态调控策略使引物兼具dna扩增引物与逆转录引导引物双重功能，为ihnv检测rt-qpcr全预混试剂开发提供创新方案。