制备包含葡糖转移酶的葡糖转移甜菊醇糖苷的组合物及用其制备葡糖转移甜菊醇糖苷的方法与流程

1.本公开涉及用于生产葡糖基化甜菊醇糖苷(steviol glycoside)的组合物，该组合物包括葡糖基转移酶；以及使用该组合物生产葡糖基化甜菊醇糖苷的方法。


背景技术：

2.随着世界卫生组织(who)出于对糖消耗引起疾病(肥胖症)的担忧，建议降低每日糖摄入量，发达国家政府正在积极讨论旨在减少糖摄入量的各种政策。因此，随着市场上开发各种替代增甜剂的需求不断增加，替代增甜剂正在不断被开发和商业化。作为替代增甜剂，这些是以合成高强度增甜剂(例如，糖精、阿斯巴甜、三氯蔗糖(sucralose)等)、合成糖醇(例如，麦芽糖醇和木糖醇)、和高强度增甜剂(例如，新蛇菊苷a和甘草)的形式持续变化的。然而，由于对合成增甜剂的安全性的担忧，消费者对天然增甜剂的需求一直在稳定增加；然而，因为天然增甜剂特有的风味特性(即，嗅觉上的异味和味觉上的异味)的限制，所以天然增甜剂不能完全取代现有的以合成增甜剂为基础的低卡路里和零卡路里产品。
3.近年来备受关注的天然高强度增甜剂是从甜叶菊(stevia rebaudiana bertoni)的叶中提取的甜菊糖(stevia)。甜菊糖是天然材料，其甜度是糖的200至300倍，且由蛇菊苷、新蛇菊苷a、新蛇菊苷b、新蛇菊苷c、新蛇菊苷d、新蛇菊苷e、新蛇菊苷m等组成。此外，甜菊糖不具有卡路里，且对血糖和胰岛素水平有积极作用，并且已有报道在人体中无不良作用。然而，甜菊糖虽然具有用作替代增甜剂的潜力，但由于其表达强烈苦味的缺点，在应用中存在局限性。
4.改善甜菊糖的甜度的方法包括使用酶转移糖类的方法。作为该方法，本领域广泛使用cgtase将1至12个葡萄糖分子转移到甜菊醇糖苷的方法(韩国专利申请号10-1991-0020769)。然而，该方法的缺点是转移到甜菊醇糖苷的葡萄糖结构为α-(1,4)，并且全部被肠道微生物降解，从而增加卡路里。


技术实现要素：

5.[技术问题]
[0006]
在这种情况下，本发明人通过确认来源于苹果乳杆菌(lactobacillus mali)的酶经由α-(1,6)键将葡萄糖转移到甜菊醇糖苷,以产生难以消化的葡糖基化甜菊醇糖苷而完成了本公开。
[0007]
[技术方案]
[0008]
本公开的目的是提供用于生产葡糖基化甜菊醇糖苷的组合物，该组合物包括包含seq id no:1的氨基酸序列的葡糖基转移酶、表达该葡糖基转移酶的微生物、或该微生物的培养物。
[0009]
本公开的另一个目的是提供生产葡糖基化甜菊醇糖苷的方法，该方法包括使甜菊
醇糖苷与包含seq id no:1的氨基酸序列的葡糖基转移酶、表达该葡糖基转移酶的微生物、或该微生物的培养物接触的步骤。
[0010]
本公开的又一个目的是提供通过上述生产方法生产的葡糖基化甜菊醇糖苷。
[0011]
本公开的又一个目的是提供增甜剂组合物，其包括葡糖基化甜菊醇糖苷。
[0012]
本公开的又一个目的是提供用于改善甜度的组合物，该组合物包括包含seq id no:1的氨基酸序列的葡糖基转移酶、表达该葡糖基转移酶的微生物、或该微生物的培养物。
[0013]
本公开的又一个目的是提供改善甜菊醇糖苷的甜度的方法，该方法包括使用包含seq id no:1氨基酸序列的葡糖基转移酶、表达该葡糖基转移酶的微生物、或该微生物的培养物将甜菊醇糖苷转变为葡糖基化甜菊醇糖苷的步骤。
[0014]
[技术效果]
[0015]
用于生产葡糖基化甜菊醇糖苷的本公开的组合物和用于生产葡糖基化甜菊醇糖苷的本公开的方法利用包含seq id no:1的氨基酸序列的葡糖基转移酶，从而特异性地生产葡糖基化甜菊醇糖苷。
[0016]
此外，由于葡糖基转移酶具有从甜菊醇糖苷到葡糖基化甜菊醇糖苷的高转变率，因此有可能非常有效地生产葡糖基化甜菊醇糖苷。
附图说明
[0017]
图1显示了从苹果乳杆菌的培养物纯化的四种组分(fraction)中的蛋白质的sds-page结果。
[0018]
图2显示了在新蛇菊苷a和糖与苹果乳杆菌的粗酶液反应前的hplc结果。
[0019]
图3显示了在新蛇菊苷a和糖与苹果乳杆菌的粗酶液反应后的hplc结果。
[0020]
图4显示了在蛇菊苷和糖与苹果乳杆菌的粗酶液反应前的hplc结果。
[0021]
图5显示了在蛇菊苷和糖与苹果乳杆菌的粗酶液反应后的hplc结果。
[0022]
图6显示了在新蛇菊苷a和糖与包含seq id no:1的氨基酸序列的酶反应前的hplc结果。
[0023]
图7显示了在新蛇菊苷a和糖与包含seq id no:1的氨基酸序列的酶反应后的hplc结果。
具体实施方式
[0024]
在下文，将详细描述本公开。同时，本文公开的每个解释和示例性实施方式可应用于其它解释和示例性实施方式。即，本文公开的各种要素的所有组合都属于本公开的范围。此外，本公开的范围不应受下文提供的具体公开的限制。
[0025]
为了实现上述目的，本公开的一个方面提供用于生产葡糖基化甜菊醇糖苷的组合物，该组合物包括包含seq id no:1氨基酸序列的葡糖基转移酶、表达该葡糖基转移酶的微生物、或该微生物的培养物。
[0026]
如本文所用，“葡糖基转移酶”是指将葡萄糖从葡萄糖供体转移到葡萄糖受体的酶。
[0027]
葡糖基转移酶可具有用于通过将葡萄糖从葡萄糖供体转移到甜菊醇糖苷来生产葡糖基化甜菊醇糖苷的用途。
[0028]
葡糖基转移酶可以是包含seq id no:1的氨基酸序列的酶。包含seq id no:1的氨基酸序列的酶可以与具有seq id no:1的氨基酸序列的酶、基本上由seq id no:1的氨基酸序列组成的酶、或由seq id no:1的氨基酸序列组成的酶互换使用。
[0029]
进一步，尽管本公开中的葡糖基转移酶被定义为包含seq id no:1的氨基酸序列，其不排除通过在seq id no:1的氨基酸序列的上游或下游添加无意义的序列、自然发生的突变或沉默突变，且对于本领域技术人员来说明显的是，只要蛋白质具有与包含seq id no:1的氨基酸序列的、基本上由seq id no:1的氨基酸序列组成的、或由seq id no:1的氨基酸序列组成的酶的活性相同或相应的活性，它就对应于本公开的葡糖基转移酶。举具体的实例，本公开的葡糖基转移酶可以是由seq id no:1的氨基酸序列组成的蛋白质，或者是由与seq id no:1的氨基酸序列具有80％、90％、95％或97％以上同源性或同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。另外，明显的是，只要氨基酸序列具有上述同源性或同一性，并且表现出与酶的效力相应的效力，具有部分序列缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白质也都可以被包括在本公开的葡糖基转移酶的范围内。
[0030]
即，尽管在本公开中描述为“具有特定seq id no的氨基酸序列的酶或蛋白质”或“由特定seq id no的氨基酸序列组成的酶或蛋白质”，但明显的是，只要该蛋白质可以具有与包含对应seq id no的氨基酸序列的多肽的活性相同或对应的活性，则具有部分序列缺失、修饰、替换或添加的氨基酸序列的任何蛋白质也都可用于本公开。例如，明显的是，任何“由seq id no:1的氨基酸序列组成的多肽”都可以属于“包含seq id no:1的氨基酸序列的多肽”，只要它具有与包含seq id no:1的氨基酸序列的多肽的活性相同或对应的活性。
[0031]
如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指与两个给定氨基酸序列或核苷酸序列的匹配程度，并且可以用百分比表示。术语“同源性”和“同一性”可以经常彼此互换使用。
[0032]
保守的多核苷酸或多肽序列的同源性或同一性可以通过标准比对算法来确定，并且可以与由所使用的程序建立的默认空位罚值一起使用。基本上，同源性或同一性序列可以沿着序列的整个长度或整个长度的至少约50％、约60％、约70％、约80％、或约90％在中等或高度严格的条件下进行杂交。在杂交的多核苷酸中，也可以考虑含有代替密码子的简并密码子的多核苷酸。
[0033]
任意两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性、或同一性，可利用已知的计算机算法(如“fasta”程序)(例如，pearson等人(1988)[proc.natl.acad.sci.usa 85]:2444)应用默认参数来确定。可替代地，其可利用emboss包的needleman程序(emboss:the european molecular biology open software suite,rice等人,2000,trends genet.16:276-277)(5.0.0或更高版本)中执行的needleman
–
wunsch算法(needleman and wunsch,1970,j.mol.biol.48:443-453)来确定(gcg程序包(devereux,j.等人,nucleic acids research 12:387(1984))、blastp、blastn、fasta(atschul,[s.][f.][et al,j molec biol 215]:403(1990)；guide to huge computers,martin j.bishop,[ed.,]academic press,san diego,1994,和[carillo eta/.](1988)siam j applied math 48:1073)。例如，同源性、相似性、或同一性可利用美国国家生物技术信息中心的blast或clustalw来确定。
[0034]
多核苷酸或多肽序列之间的同源性、相似性、或同一性可通过利用，例如，如smith and waterman,adv.appl.math(1981)2:482中发表的gap计算机程序(例如，needleman等
人,(1970),j mol biol.48:443)比较序列信息来确定。总之，gap程序将同源性、相似性、或同一性定义为相似的比对符号(即，核苷酸或氨基酸)的数量除以两序列中较短者的符号总数而获得的值。gap程序的默认参数可包括：(1)一元比较矩阵(含有同一性值为1和非同一性值为0)和如schwartz and dayhoff,eds.,atlas of protein sequence and structure,national biomedical research foundation,pp.353-358(1979)中公开的gribskov等人,(1986)nucl.acids res.14:6745的加权比较矩阵(或ednafull(ncbi nuc4.4的emboss版本)取代矩阵)；(2)每个空位的罚值为3.0，且每个空位中的每个符号为附加罚值0.10(或空位开放罚值为10和空位延伸罚值为0.5)；和(3)末端空位无罚值。
[0035]
进一步，任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以通过在定义的严格条件下通过southern杂交实验比较序列来确定，并且定义的适当杂交条件可以在本领域的范围内，并且可以通过本领域技术人员熟知的方法来确定(例如，j.sambrook等人,molecular cloning,a laboratory manual,2nd edition,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,new york,1989；f.m.ausubel等人.,current protocols in molecular biology,john wiley&sons,inc.,new york)。
[0036]
包含seq id no:1的氨基酸序列的葡糖基转移酶可以是源自乳酸杆菌(lactobacillus)属的酶，且具体地是源自苹果乳杆菌的酶，但不限于此。
[0037]
包含seq id no:1的氨基酸序列的葡糖基转移酶可以具有50％或更多、具体地60％或更多、更具体地70％或更多、更加具体地80％或更多、和甚至更加具体地90％或更多的从甜菊醇糖苷到萄糖基化甜菊醇糖苷的转变率，但不限于此。
[0038]
用于生产葡糖基化甜菊醇糖苷的本公开的组合物可以包括表达包含seq id no:1的氨基酸序列的葡糖基转移酶的微生物、或者该微生物的培养物。
[0039]
微生物可以具体地为乳酸杆菌属的微生物，且更具体地为苹果乳杆菌，但只要是可以包括或表达本公开的葡糖基转移酶的微生物，就不限于此。
[0040]
具体地，培养物可以是包括表达包含seq id no:1的氨基酸序列的葡糖基转移酶的微生物的培养物、或者是从中排除该微生物的培养物。
[0041]
本公开的用于生产葡糖基化甜菊醇糖苷的组合物可进一步包括甜菊醇糖苷和葡萄糖供体。
[0042]“甜菊醇糖苷”，其是天然增甜剂中的一种，可以由下面的化学式1表示。
[0043]
[化学式1]
[0044][0045]
在化学式1中，氢(h)可以与r1结合，或者1至3个葡萄糖分子可以经由β-键与r1结合；且葡萄糖、木糖或鼠李糖中的一个分子可以经由β-键与r2结合，且0至2个葡萄糖分子可以经由β-键与r2结合，但不限于此。
[0046]
甜菊醇糖苷可以是选自蛇菊苷、甜茶苷卫矛醇苷a(dulcoside a)、新蛇菊苷a、新蛇菊苷c、新蛇菊苷d、新蛇菊苷e、新蛇菊苷f、和新蛇菊苷m中的一种或多种，但不限于此。
[0047]
葡萄糖供体可以是葡萄糖的低聚物、葡萄糖的聚合物或其环状形式中的任何一种(其可以在葡糖基转移酶的存在下反应，使得一个或多个葡萄糖分子可以被转移到甜菊醇糖苷)，且具体地，可以是糖，但不限于此。
[0048]“葡糖基化甜菊醇糖苷”可以是其中葡萄糖被连接到甜菊醇糖苷的形式。
[0049]
具体地，葡糖基化甜菊醇糖苷可以是其中葡萄糖经由α-(1,6)键被连接到甜菊醇糖苷的形式。
[0050]
具体地，葡糖基化甜菊醇糖苷可以是其中葡萄糖经由α-(1,6)键被连接到在甜菊醇糖苷的19-oh位置上连接的葡萄糖的形式。
[0051]
具体地，葡糖基化甜菊醇糖苷可以是其中1至3个葡萄糖分子被连接到甜菊醇糖苷的形式。
[0052]
本公开的用于生产葡糖基化甜菊醇糖苷的组合物可以进一步包括能够有利地将葡萄糖转移到甜菊醇糖苷或能够增强组合物的稳定性的辅因子，但不限于此。辅因子的实例可以包括金属离子、金属盐、赋形剂、防腐剂等，但不限于此。
[0053]
为了实现上述目的，本公开的另一方面提供了生产葡糖基化甜菊醇糖苷的方法，该方法包括使甜菊醇糖苷与包含seq id no:1的氨基酸序列的葡糖基转移酶、表达该葡糖基转移酶的微生物、或该微生物的培养物接触的步骤。
[0054]“包括seq id no:1的氨基酸序列的葡糖基转移酶”、“微生物”、“培养物”、和“葡糖基化甜菊醇糖苷”与上述相同。
[0055]
本公开的用于生产葡糖基化甜菊醇糖苷的方法可以包括在包含seq id no:1的氨基酸序列的葡糖基转移酶、表达该葡糖基转移酶的微生物、或该微生物的培养物存在下，使
葡萄糖供体(例如，糖)和甜菊醇糖苷反应的步骤。在这方面，“葡萄糖供体”和“甜菊醇糖苷”与上述相同。
[0056]
葡萄糖供体和甜菊醇糖苷的反应步骤可以在ph 1至ph 10下、具体地在ph 2至ph 9下、更具体地在ph 3至ph 8下、且更加具体地在ph 5至ph 6下进行，但不限于此。
[0057]
使葡萄糖供体与甜菊醇糖苷反应的步骤可在1℃至80℃下、具体地在5℃至70℃下、更具体地在25℃至50℃下，且更加具体地在35℃至45℃下进行，但不限于此。
[0058]
进一步，使葡萄糖供体与甜菊醇糖苷反应的步骤可以在ph 1至ph 10下、在ph 2至ph 9下、在ph 3至ph 8下、或在ph 5至ph 6下，以及在1℃至80℃下、在5℃至70℃下、在25℃至50℃下、或在35℃至45℃下进行，但不限于此。
[0059]
本公开的用于生产葡糖基化甜菊醇糖苷的方法可进一步包括回收葡糖基化甜菊醇糖苷的步骤。回收可以采用本领域已知的各种方法，例如过滤、尺寸排阻层析、离子交换层析、结晶、hplc等，但不限于此。进一步，回收步骤可包括纯化过程。
[0060]
为了实现上述目的，本公开的又一个方面提供了通过本公开的用于生产葡糖基化甜菊醇糖苷的方法生产的葡糖基化甜菊醇糖苷。
[0061]“葡糖基化甜菊醇糖苷”与上述相同。
[0062]
具体地，葡糖基化甜菊醇糖苷可以是选自葡糖基化蛇菊苷、葡糖基化甜茶苷、葡糖基化卫矛醇苷a、葡糖基化新蛇菊苷a、葡糖基化新蛇菊苷c、葡糖基化新蛇菊苷d、葡糖基化新蛇菊苷e、葡糖基化新蛇菊苷f和葡糖基化新蛇菊苷m中的一种或多种，但不限于此。
[0063]
为了实现上述目的，本公开的又一方面提供了增甜剂组合物，其包括本公开的葡糖基化甜菊醇糖苷。
[0064]
与包括甜菊醇糖苷的增甜剂组合物相比，本公开的增甜剂组合物可以具有改善的苦味和改善的溶解度。
[0065]
改善的苦味可能是减少的苦味。
[0066]
改善的溶解度可能是增加的溶解度。
[0067]
为了实现上述目的，本公开的又一方面提供了用于改善甜菊醇糖苷的甜度的组合物，组合物包括包含seq id no:1的氨基酸序列的葡糖基转移酶、表达该葡糖基转移酶的微生物、或该微生物的培养物。
[0068]“包含seq id no:1的氨基酸序列的葡糖基转移酶”、“微生物”、“培养物”、和“甜菊醇糖苷”与上述相同。
[0069]
甜度改善可能是由于苦味减少而导致的苦味改善。
[0070]
为了实现上述目的，本公开的又一方面提供了改善甜菊醇糖苷的甜度的方法，该方法包括利用包含seq id no:1的氨基酸序列的葡糖基转移酶、表达该葡糖基转移酶的微生物、或该微生物的培养物将甜菊醇糖苷转变为葡糖基化甜菊醇糖苷的步骤。
[0071]“包含seq id no:1的氨基酸序列的葡糖基转移酶”、“微生物”、“培养物”、“甜菊醇糖苷”、和“葡糖基化甜菊醇糖苷”与上述相同。
[0072]
转变步骤可以在ph 1至ph 10下，具体地在ph 2至ph 9下，更具体地在ph 3至ph 8下，以及更加具体地在ph 5至ph 6下进行，但不限于此。
[0073]
转变步骤可以在1℃至80℃下、具体地在5℃至70℃下、更具体地在25℃至50℃下，且更加具体地在35℃至45℃下进行，但不限于此。
[0074]
进一步，转变步骤可以在ph 1至ph 10下、在ph 2至ph 9下、在ph 3至ph 8下、或在ph 5至ph 6下，以及在1℃至80℃下、在5℃至70℃下、在25℃至50℃下、或在35℃至45℃下进行，但不限于此。
[0075]
甜度改善可能是由于苦味减少而导致的苦味改善。
[0076]
实施例
[0077]
下文，将参考实施例和实验实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例和实验实施例仅用于示例本公开，并且本公开的范围不旨在受这些实施例和实验实施例的限制。
[0078]
实施例1：酶的纯化
[0079]
在试管中装5ml的mrs培养液(mrs broth)(bd difco)，然后将苹果乳杆菌接种至试管，然后在30℃和180rpm下培养15小时。
[0080]
此后，在250ml烧瓶中装100ml的mrs培养液，然后在5％(v/v)的浓度下将培养液接种至试管，然后在30℃和180rpm下培养15小时。
[0081]
此后，在3l发酵罐中装1l的改良mrs培养液(modified mrs broth)，然后在5％(v/v)的浓度下将培养液接种至发酵罐，然后在30℃和300rpm下培养24h。此时，改良mrs培养液的组成与下表1中相同。
[0082]
[表1]
[0083]
组合物单位(g/l)含量制造商蔗糖g20sigma聚胨g10daejung酵母提取物g5bd difco牛肉提取物g10bd difco柠檬酸铵g2daejung醋酸钠g5daejungk2hpo4g2daejungmgso
4-7h2og0.1junseimnso
4-h2og0.05junsei吐温80g1daejung
[0084]
培养液以13,000rpm离心15分钟以回收上清液。使用20mm tris-hcl缓冲液(ph 7.4)对上清液进行透析，以进行蛋白质纯化。
[0085]
在初次纯化中，利用阴离子交换层析，且使用了hitrap
tm deae ff(ge healthcare)柱。样品以1ml/min的流速加载到柱上，然后用20mm含有1m nacl的tris-hcl(ph 7.4)缓冲液洗脱。
[0086]
在二次纯化中，利用凝胶过滤层析，且使用了hiload
tm 16/60superdex 200pg(ge healthcare)柱。使用20mm含有150mm nacl的tris-hcl缓冲液进行纯化。
[0087]
从上述纯化中获得了四种组分，且各组分的sds-page结果如图1中所示。
[0088]
实施例2：酶活性的检验
[0089]
为确认期望的酶的存在，通过还原糖测定法(dns法)检查了各组分的糖水解活性。
[0090]
在50mm醋酸钠缓冲液中以1:1的比例混合了200mm糖溶液和各组分，并允许在40℃下在水浴中反应10分钟，然后在100℃下灭活。将dns试剂以1:3的比例添加至其中，然后混
合并允许在100℃下反应5分钟，然后立即在冰上终止dns反应。此后，在575nm处测量了dns试剂的光密度(od)，并根据构建的果糖标准曲线确认活性。此时，1单位是由每1分钟产生1μmol果糖的酶的量(ml)来定义的。
[0091]
结果，确认了2号组分的75kda蛋白质具有糖水解活性。
[0092]
实施例3：酶的鉴定
[0093]
通过lc-ms对75kda蛋白进行了鉴定。
[0094]
实施例3-1：样品的预处理(在凝胶胰蛋白酶消化中)
[0095]
为了利用质谱法进行蛋白质鉴定，需要将待分析的蛋白质片段化成肽。
[0096]
因此，切割对应于图1的2号组分的75kda，然后将50％ch3cn(h2o)溶剂添加到在凝胶内片样品(in-gel piece sample)，且通过反应15分钟进行脱色。此后，添加了2μl溶解在50mm碳酸氢铵(abc，sigma)缓冲液中的1m二硫苏糖醇(dtt，ge)，且在室温下保存1小时。然后，添加了4μl溶解在50mm碳酸氢铵(abc，sigma)缓冲液中的1m碘乙酰胺(iaa，sigma)，且在室温下黑暗中保存1小时。将1μg的胰蛋白酶溶液(测序级修饰的猪胰蛋白酶，thermfisher，madison，wi，usa)添加到脱色的在凝胶内片样品中，并允许在37℃下反应16小时。添加200μl的50％ch3cn(h2o)溶剂以通过凝胶脱水回收水解肽，其然后用speeddry真空浓缩器干燥。为了去除盐类和其他杂质，用c18 ziptip(millipore)进行了脱盐。
[0097]
实施例3-2：液相层析-质谱法(lc-ms)
[0098]
利用ultimate 3000rs uhplc，q-exactive orbitrap(thermo scientific)质谱仪进行了液相层析-质谱法，且分析条件如下：
[0099]
(1)层析：thermo(dionex)uhplc ultimate 3000
[0100]
(2)柱：acclaim prepmap
tm rslc 50μm x 15cm，nanoviper c18，2μm，100a
[0101]
(3)溶剂：a＝蒸馏水(含0.1％甲酸)，b＝乙腈(含0.1％甲酸)
[0102]
(4)洗脱条件
[0103]
[表2]
[0104][0105][0106]
(5)流速：0.2μl/min
[0107]
(6)注射试样：1μl
[0108]
此后，氨基酸序列通过de novo肽测序进行了检验，且此时使用proteome discoverer 2.1(thermo)作为分析程序。
[0109]
由此确认的氨基酸序列为seq id no:1。
[0110]
实施例4：转移葡萄糖到甜菊醇糖苷的粗酶溶液活性的检验
[0111]
将6％新蛇菊苷a(purecircle)或6％蛇菊苷(carbosynth)和6％白糖(cj cheiljedang)溶解于50mm醋酸钠缓冲液(ph 5.0)中，然后将包括包含seq id no:1的氨基酸序列的酶的苹果乳杆菌粗酶溶液添加到其中，以及允许在40℃下反应24小时。然后，通过hplc确认了是否生产了葡糖基化新蛇菊苷a或葡糖基化蛇菊苷，以及在图2到5中显示了结果。同时，hplc分析条件如下：
[0112]
[表3]
[0113]
流动相乙腈(30％):蒸馏水(70％)柱250x 4.6mm capcell pak c18 mg ii(shiseido)流速0.6ml/min温度30℃注射量20μl检测器dad(210nm)
[0114]
图2和图4显示了酶反应前的hplc分析结果，且图3和图5显示酶反应后的hplc分析结果。
[0115]
图2和3的比较显示了，新蛇菊苷a通过酶反应被转变成葡糖基化新蛇菊苷a(新蛇菊苷a-g1)。此时，确认转变率为约90％。
[0116]
进一步，图4和图5的比较显示了蛇菊苷通过酶反应转变成葡糖基化蛇菊苷(stidoposide-g1)。此时，确认转变率为约90％。
[0117]
同时，通过nmr确认了葡糖基化蛇菊苷(蛇菊苷-g1)和葡糖基化新蛇菊苷a(新蛇菊苷a-g1)分别是通过经由α-(1,6)键将一个葡萄糖分子转移到连接在蛇菊苷和新蛇菊苷a的19-oh位置上的葡萄糖而产生的。
[0118]
实施例5：包含seq id no:1的氨基酸序列的酶将葡萄糖转移到甜菊醇糖苷的活性的检验
[0119]
检验了在实施例3中确认的包含seq id no:1的氨基酸序列的酶的活性。具体地，检验了该酶是否具有转移葡萄糖到甜菊醇糖苷的活性。
[0120]
实施例5-1：包括酶的微生物的制备和酶的纯化
[0121]
通过多核苷酸合成法(bioneer corp.)制备了编码seq id no:1的氨基酸序列的多核苷酸，并将获得的多核苷酸插入到pbt7-n-his载体中，然后将载体转化到大肠杆菌(e.coli)bl21(de3)中。将转化的大肠杆菌涂抹在含有氨苄青霉素的平板培养基上，以获得重组菌株(微生物)。
[0122]
同时，将上述微生物于2019年6月11日保藏在布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物保藏中心，登录号为kccm12561p。
[0123]
将重组大肠杆菌菌株接种在含有氨苄青霉素的5ml的lb培养基中，且在37℃下进行了种子培养(种菌培养，)，直到在600nm下的光密度达到了2.0。将培养种子的培养液添加到500ml的含有氨苄青霉素的lb培养基，并进行了主要培养此后，
当在600nm下的光密度达到了0.4时，添加0.1mm的异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(β-d-iptg)以诱导包含seq id no:1的氨基酸序列的酶的大量表达。在此过程中，搅拌速度为180rpm，且培养温度维持在37℃下。在iptg添加后，搅拌速度为120rpm，且培养温度维持在16℃下。
[0124]
以10,000
×
g在4℃下离心培养液20分钟以获得细胞团块(细胞沉淀，cell pellet)。将50mm tris-hcl缓冲溶液添加到团块，并作为细胞溶液重新悬浮。使用超声波仪对细胞溶液进行超声波处理。以13,000
×
g在4℃下离心细胞裂解液20分钟以仅收集上清液。此后，使用ni-nta超流(ni-nta superflow)柱纯化酶。
[0125]
实施例5-2：酶活性的检验
[0126]
将6％新蛇菊苷a(purecircle)和6％白糖(cj cheiljedang)溶解在了50mm醋酸钠缓冲液(ph 5.0)中，然后将实施例5-1中获得的包含seq id no:1的氨基酸序列的酶添加到其中，以及允许在40℃下反应24小时。此后，通过hplc确认了是否产生了葡糖基化新蛇菊苷a，且结果显示在图6和图7中。
[0127]
图6显示了酶反应前的hplc分析结果，且图7显示了酶反应后的hplc分析结果。
[0128]
图6和图7的比较显示了，新蛇菊苷a通过酶反应被转变成葡糖基化新蛇菊苷a(新蛇菊苷a-g1)。此时，确认转变率为约90％。
[0129]
同时，通过nmr确认了葡糖基化新蛇菊苷a(新蛇菊苷a-g1)是经由α-(1,6)键将一个葡萄糖分子转移到连接在新蛇菊苷a的19-oh位置上的葡萄糖而产生的。
[0130]
即，确认了包含seq id no:1的氨基酸序列的酶具有与实施例4的苹果乳杆菌的粗酶溶液的活性相同的活性。
[0131]
实施例6：葡糖基化甜菊醇糖苷的溶解度的评价
[0132]
测量了甜菊醇糖苷和葡糖基化甜菊醇糖苷的溶解度。
[0133]
具体地，分别测量了实施例4的新蛇菊苷a(ra)、蛇菊苷(stv)、葡糖基化新蛇菊苷a(ra-glu)，和实施例4的葡糖基化蛇菊苷(stv-glu)的溶解度。
[0134]
将新蛇菊苷a、蛇菊苷、葡糖基化新蛇菊苷a、和葡糖基化蛇菊苷各6克混合在10ml中，然后通过在50℃下超声处理60分钟来进行溶解。将反应物在5℃、15℃、25℃、35℃、45℃或55℃下的水浴中培育1周。此后，将所得溶液以12,000rpm离心了10分钟，并收集了1ml的上清液，并在105℃下的烘箱中干燥，以测量溶解度，其显示在表4中。
[0135]
[表4]
[0136][0137]
根据表4的结果，可以看出，与蛇菊苷和新蛇菊苷a相比，葡糖基化蛇菊苷和葡糖基化新蛇菊苷a显示出显著增加的溶解度。
[0138]
实施例7：α-(1,6)葡糖基化新蛇菊苷a的甜度和甜度质量的评价
[0139]
将已知物质(即，α-(1,4)葡糖基化新蛇菊苷a)和实施例4的α-(1,6)葡糖基化新蛇菊苷a分别溶解于水中，并提供面板以评价实际甜度和甜度质量。结果显示在下表5中。
[0140]
[表5]
[0141][0142]
如表5中所示，确认了与α-(1,4)葡糖基化新蛇菊苷a相比，α-(1,6)葡糖基化新蛇菊苷a显示了高甜度，且还具有更好的甜度质量。
[0143]
基于上述描述，本领域的技术人员将理解，在不改变本公开的技术精神或必要特征的情况下，可以以不同的具体形式来实施本公开。因此，应当理解，上述实施方式不是限制性的，而是在所有方面是示例性的。本公开的范围由所附的权利要求而不是由它们前面的描述来限定，且因此，旨在将落入权利要求的边界和界限内的所有改变和修改，或此类边界和界限的等效物由权利要求涵盖。
[0144]