嵌合质粒文库的构建方法与流程

1.本发明涉及新的嵌合质粒文库的构建方法。


背景技术：

2.随着合成生物学的发展，连接多个基因而成的长链dna的需求逐渐增加。在长链dna的序列设计中，必然需要研究所使用的基因的种类的选项、该基因的表达强度的选项等大量的表达参数，因此，通过单次序列设计就能实现目标结果的可能性较低。于是，在多数情况下，实施dbtl循环(设计、构建、测试和学习的循环，design
‑
build
‑
test
‑
learn cycle)成为了前提，所述dbtl循环是首先进行设计(design)，对构建(build)而得的长链dna进行评价(test)，针对其内容进行研究(learn)，并基于其发现而构建新的dna。为了在该dbtl循环中同时研究大量的表达参数，从各表达参数存在的多个选项中选择1个并将其分别连接而构建多种长链dna的组合文库技术从效率性的观点考虑是理想的。即，较之仅构建并评价单一的长链dna，同时并行地构建并比较各表达参数中具有多样性的多种长链dna的方式更容易以较短的循环得出针对各表达参数的dna设计的方向性。
3.然而，长链dna的合成通常耗费金钱成本、时间成本，往往难以构建多条长链dna。在长链dna构建中，出于通过化学合成能够供应的dna的长度较短(200个碱基左右)等理由，使用的是通过大量准备以基因的功能单位等为指标的短dna片段，并将它们连接(组装)进行构建的多基因片段组装技术。作为这样的dna片段的组装方法，研发了ogab法(专利文献1：日本特开2004
‑
129654号公报，非专利文献1：tsuge,k.等，nucleic acids res.31，e133(2003))、slic法(非专利文献2：li mz,elledge sj(2007)nature methods 4：251
‑
256)、golden gate法(非专利文献3：engler,c.等，plos one(2008))、gibson assembly法(非专利文献4：gibson,d.g.等，nat.methods，6，343
‑
345.(2009))、lcr法(非专利文献5：de kok,s.等，acs synth.biol.(2014))、出芽酵母(budding yeast)的基因组装方法(非专利文献6：gibson,d.g.，等，proc.nat.acad.sci.usa6,105,20404
‑
20409,2008)等各种各样的方法。
4.为了以低成本简单地供应多种长链dna，可以考虑同时准备表达参数不同的多个短dna片段以用于上述基因组装，制作将其组合地连接的组合文库。在上述基因组装方法中，也研发了构建组合文库的方法。
5.此外，在评价(test)通过上述方法供应的长链dna的组合文库，并研究(learn)表达参数的设计方向性时，需要将长链dna的基因型与其表型对应。以往的组合文库的构建中大致存在2种方法。第1种是在1个基因组装中构建1种长链dna的方法。在此情况下，按对应于组合文库的规模的数量个别实施材料各自不同的基因组装。其优点在于，由于可以提前掌握哪种基因组装会成为哪种基因型，因而即使在test中不重新确认基因型也能迅速取得与表型的对应，但缺点在于难以大规模化。第2种是将组合文库中所用的所有材料混合，通过1次基因组装来构建文库的方法。该方法具有易于获得大规模的组合文库的优点。然而，其问题在于，对于通过该文库选出的克隆具有哪一种基因型，需要通过个别地测序来确认
碱基序列，长链dna越长则碱基序列的确认越耗费时间，因此test成为了限速步骤。
6.现有技术文献
7.专利文献
8.专利文献1：日本特开2004
‑
129654号公报(专利第4479199号)
9.非专利文献
10.非专利文献1：tsuge,k.等，nucleic acids res.31，e133，2003
11.非专利文献2:li mz,elledge sj,nature methods 4：251
‑
256,2007
12.非专利文献3:engler,c.等，plos one,2008
13.非专利文献4:gibson,d.g.等，nat.methods,6,343
‑
345.,2009
14.非专利文献5:de kok,s.等，acs synth.biol.,2014
15.非专利文献6:gibson,d.g.等，proc.nat.acad.sci.usa 6,105,20404
‑
20409,2008


技术实现要素：

16.发明所要解决的课题
17.在上述情况下，本发明以提供新型的微生物细胞转化用dna片段的制备方法为课题，所述方法能够高效地构建长链dna的组合文库，且即使不实施做为限速步骤的碱基序列确认也能迅速准备用于下一轮dbtl循环的长链dna的组合文库。
18.用于解决课题的手段
19.为了高效地实施长链dna的组合文库构建，如上所述使用多基因片段组装技术是优选的，但不论是何种基因组装技术，做为组装对象的基因片段不会过量或不足的状态、即各基因片段的摩尔浓度相等都是重要的。然而，由于难以将大量(特别是多于10个的)基因片段的摩尔浓度调整至相等的摩尔浓度，因此难以利用基因组装技术高效率地构建包含大量选项的组合文库。
20.通常，成为用于实施基因组装的材料的基因片段的准备需要按片段逐个实施，并且，将这些片段以等摩尔浓度进行合并时，虽然会测定dna的重量浓度，基于dna片段的长度进行计算以决定添加量，但由于dna浓度的测定误差、dna的移液误差等，准确地进行等摩尔合并是极其困难的。另一方面，将单次组装而成为质粒状态的组装体通过限制性内切酶切割后还原为原始材料的情况下，得到的材料成为理想的等摩尔状态。本技术的发明人发现，实际上，使用上述材料再次实施组装时，组装效率较之通过上述以人手合并dna片段进行组装的情况提高100倍以上(tsuge,nar,2003)。并且，以限制性内切酶切割后分解为选项片段的组装体的情况下，即使该选项片段的碱基序列未被鉴定，只要实物dna是存在的，就可以通过将其与同样地准备的来源于其它组装体的选项片段混合来构建组合文库。本技术的发明人得到上述结果的启发，完成了本发明的高效的长链dna组合文库构建方法。
21.即，本技术的发明人为了解决上述课题进行深入研究，结果在利用枯草芽孢杆菌的质粒转化系统的基因组装方法(ogab法)中，为了使用于组合文库的组装的所有dna片段的摩尔浓度的比率尽可能接近1，采用了上述方法。具体而言，构建了将成为组合化对象的选项基因片段连接在一起而得的种子质粒(seed plasmid)。然后，对于其它的选项基因片段，另外构建种子质粒，从而准备数量等于选项的最大数量的种子质粒。通过以限制性内切
酶切割各种子质粒，得到将基因片段等摩尔混合而成的溶液。该溶液即使与其它种子质粒混合，等摩尔性也得以维持。然后，通过将上述溶液所含的各种基因片段连接为直线状，得到质粒载体部分周期性出现的伪串联重复(pseudo
‑
tandem repeat)状态的高分子dna，用以转化枯草芽孢杆菌。通过在枯草芽孢杆菌体内利用质粒载体部分的同源性进行环化，效率良好地构建了组合文库。
22.根据该方法，其特征在于可以极其简单且可靠地准备构建组合文库所需的等摩尔浓度的基因片段，并可以使文库的构建规模实现前所未有的大规模。此外，根据该方法，即使不确认得到的质粒的基因型，也可以构建下一循环的长链dna的组合文库。即，本发明的主题如下所述。
23.[1]微生物细胞转化用dna片段的制备方法，其中，所述微生物细胞转化用dna片段具有
[0024]
至少1个插入dna单元，所述插入dna单元包含含有在宿主微生物中有效的复制起点的dna、和单位dna(unit dna)连接而成的插入dna，所述制备方法的特征在于包括下述步骤：
[0025]
步骤(a)，通过ogab方法，制备多种含有使能够以特定的连接顺序进行连接的多种单位dna连接而成的插入dna单元的质粒；
[0026]
步骤(b)，将通过步骤(a)制备的多种质粒用适合各质粒的限制性内切酶处理，分解为单位dna，制备多种单位dna混合液；和
[0027]
步骤(c)，使用通过步骤(b)得到的多种单位dna混合液，通过ogab法重新组装单位dna，制备长链dna片段。
[0028]
[2]如[1]所述的微生物细胞转化用dna片段的制备方法，其特征在于，通过步骤(b)得到的单位dna混合液中的、所有的dna片段的摩尔浓度的比率为0.8～1.2。
[0029]
[3]如[1]或[2]所述的微生物细胞转化用dna片段的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，1种插入dna单元所含的单位dna的种类为3～60种。
[0030]
[4]如[1]至[3]中任一者所述的微生物细胞转化用dna片段的制备方法，其中，步骤(b)中使用的限制性内切酶为3种以下。
[0031]
[5]如[1]至[4]中任一者所述的微生物细胞转化用dna片段的制备方法，其中，上述限制性内切酶为生成突出末端的限制性内切酶。
[0032]
[6]质粒，其含有通过[1]至[5]中任一者所述的制备方法得到的微生物细胞转化用dna片段。
[0033]
[7]微生物细胞转化用dna片段的制备方法，所述微生物细胞转化用dna片段具有至少1个插入dna单元，所述插入dna单元包含含有在宿主微生物中有效的复制起点的dna、和单位dna连接而成的插入dna，所述制备方法的特征在于包括下述步骤：
[0034]
步骤(b’)，将权利要求6所述的多种质粒用适合各质粒的限制性内切酶处理，分解为单位dna，制备多种单位dna混合液；和
[0035]
步骤(c)，使用通过步骤(b’)得到的单位dna混合液，通过ogab法重新组装单位dna，制备长链dna片段。
[0036]
[8]如[7]所述的微生物细胞转化用dna片段的制备方法，其特征在于，选择多种含有得到的长链dna片段的质粒，作为步骤(b’)中的质粒进行再利用。
[0037]
[9]嵌合质粒文库的构建方法，其使用[1]至[5]、[7]、[8]中任一者所述的微生物细胞转化用dna片段的制备方法。
[0038]
发明效果
[0039]
根据本发明，迅速且高效地构建长链dna的组合文库成为可能。此外，能够将选自相同文库的、碱基序列未经确认的多个质粒再次用于构建新的嵌合文库。
附图说明
[0040]
图1：图1为示出组装用质粒载体pgets302_sfii
‑
pbr的结构的图。
[0041]
图2：图2为示出构成插入单元的单位dna的详细结构的图。
[0042]
图3：图3为示出被设计用于高产异丁醇的出芽酵母的人工代谢通路的图。
[0043]
图4：图4为示意性地示出本发明的嵌合质粒文库的构建方法的图。
[0044]
图5：图5为示出通过本发明的方法得到的第1次嵌合质粒文库中各质粒中的单位基因的方向和异丁醇产量的图。
[0045]
图6：图6为示出以转化所使用的质粒作为种子质粒的、新的组合文库的构建步骤的图。
[0046]
图7：图7为示出通过本发明的方法得到的第2次嵌合质粒文库中各质粒中的单位基因的方向和异丁醇产量的图。
具体实施方式
[0047]
以下针对本发明进行详细说明。需要说明的是，本说明书中，除非特别指出，分子生物学方法可以通过本领域技术人员已知的常见实验书籍中记载的方法或基于其的方法来实施。此外，除非特别提及，本说明书中使用的术语以该技术领域中通常使用的含义来解释。
[0048]
＜微生物细胞转化用dna片段的制备方法＞
[0049]
本发明涉及新型的微生物细胞转化用dna片段的制备方法，所述方法能够高效地构建长链dna的组合文库，即使不确认得到的克隆的基因型，也容易构建新的组合文库。具体而言，涉及如下的微生物细胞转化用dna片段的制备方法，所述微生物细胞转化用dna片段具有至少1个插入dna单元，所述插入dna单元包含含有在宿主微生物中有效的复制起点的dna、和单位dna连接而成的插入dna，所述制备方法的特征在于包括下述步骤：
[0050]
步骤(a)，通过ogab方法，制备多种含有使能够以特定的连接顺序进行连接的多种单位dna连接而成的插入dna单元的质粒；
[0051]
步骤(b)，将通过步骤(a)制备的多种质粒用适合各质粒的限制性内切酶处理，分解为单位dna，制备多种单位dna混合液；和
[0052]
步骤(c)，使用通过步骤(b)得到的多种单位dna混合液，通过ogab法重新组装单位dna，制备长链dna片段。
[0053]
本发明中为下述方法：制备多个具有可将含有在宿主微生物中有效的复制起点的dna(质粒载体)、和含有插入dna的插入dna单元交替地进行连接的结构的单位dna，连接该单位dna，制造具有至少1个插入dna单元且具有至少2个相同的单位dna的dna片段，然后共培养该dna片段和宿主微生物的感受态细胞，通过从该微生物回收质粒dna制备组合文库，
将从组合文库中选出的质粒dna用作新的文库的种子质粒。
[0054]
本发明中，插入dna单元是指，包含含有在宿主微生物中有效的复制起点的dna和插入dna的单位。需要说明的是，微生物细胞转化用dna片段含有1个以上的插入dna单元。此外，除了含有在宿主微生物中有效的复制起点的dna和插入dna以外，插入dna单元还可以根据需要包含适当的碱基序列。例如，通过本发明的方法制造用于表达插入dna中所含基因的质粒时，可含有启动子、操纵子、激活子、终止子这样的控制转录翻译的碱基序列。作为以酵母为宿主时的启动子，具体而言，可举出糖酵解等初级代谢产物的启动子等。
[0055]
本发明中，含有在宿主微生物中有效的复制起点的dna可以是任何dna，只要在能够以所制造的dna片段进行转化的微生物中进行dna复制即可。作为本发明的宿主微生物，可使用芽孢杆菌(bacillus)属细菌，作为具体的微生物和含有在该微生物中有效的复制起点的dna，例如枯草芽孢杆菌(b.subtilis)的情况下为具有θ型复制机制的dna，具体而言，可举出ptb19(imanaka,t.等，j.gen.microbioi.130，1399
‑
1408.(1984))、pls32(tanaka，t和ogra，m.febs lett.422，243
‑
246.(1998))、pamβ1(swinfield，t.j.等，gene 87,79
‑
90.(1990))等质粒中所含的复制起点等序列。
[0056]
本发明中，插入dna是指所要克隆的dna，其种类、大小没有特别限定。dna的种类不限于原核生物、真核生物、病毒等天然来源序列，也可以是人工设计序列等，没有特别限制。优选的，可举出构成一系列代谢通路的基因群、以使宿主基因组中存在的基因表达失活为目的的反义rna基因群、混合有代谢通路基因群和反义rna群两者的基因群等。本发明的插入dna具有单位dna连接而成的结构。
[0057]
本发明中，单位dna具有能够彼此保持其顺序进行重复连接的结构，依次连接的单位dna构成了成为1个插入dna的dna片段。单位dna片段的dna链长没有特别限制。需要说明的是，彼此保持其顺序进行连接是指，具有在插入dna上相邻的序列的单位dna保持其顺序和方向而进行结合，此外，重复连接是指，具有插入dna的5’末端碱基序列的单位dna的5’末端与具有插入dna的3’末端碱基序列的单位dna的3’末端键合。作为这样的单位dna，具体而言，例如可举出具有利用片段的突出末端的碱基序列的互补性而得以彼此保持其顺序重复连接的末端的单位dna。该突起的结构、(包括5’末端突起与3’末端突起的突起形状区别)只要不是回文结构(palindrome)即可，没有特别限制。但是，在制造单位dna时能够通过限制性内切酶消化来制造突出末端是优选的。作为限制性内切酶，如果使用识别特定序列并可在其附近制作任意序列的突出末端的酶，可以使单位dna片段的突出末端在各连接位点处是不同的，因而能够保持其进行连接的顺序。作为上述限制性内切酶的例子，除了通常的分子生物学中使用的限制性内切酶外，可举出作为人工限制性内切酶的talen、znf、或crispr
‑
cpf1等能纯化突出末端的crispr技术相关酶等，可以优选使用aari、alwni、bbsi、bbvi、bcodi、bfuai、bgli、bsai、bsaxi、bsmai、bsmbi、bsmfi、bspmi、bspqi、btgzi、draiii、foki、pflmi、sfani、sfii等这样的ii型限制性内切酶。
[0058]
就用于生成突出末端的限制性内切酶的种类数量而言，优选对于1个单位dna的切出使用1种限制性内切酶进行切割。虽然并非所有的单位dna都必须通过同一种限制性内切酶的消化来获得，但使用的限制性内切酶的种类总数较少为佳，3种以下是优选的，2种以下是更优选的，进一步优选1种。
[0059]
构成插入dna单元的单位dna之中的1个以上单位dna必须含有在宿主细胞中有效
的复制起点。对于上述以外的单位dna，虽然其是构成代谢通路簇、生物的连续基因组序列的一部分或全部、人工基因、人工基因回路等连续碱基序列的构成要素，但并不存在单独的单位dna与生物学上的功能单元必须一致这样的限制。
[0060]
作为单位dna的制造方法，只要是能够制造本发明的单位dna的方法即可，可以是任何方法。例如，将如下dna片段克隆至质粒载体中，并在确认碱基序列后使用：通过使用于模板dna上的碱基序列附加有生成各突出末端的限制性内切酶识别序列的引物的聚合酶链式反应(pcr)扩增而得的dna片段，或者预先于末端以生成任意的突出序列的方式组入限制性内切酶识别序列而得的化学合成dna片段。各单位dna以按特定顺序进行连接、最终成为想要获得的微生物转化用dna片段的方式进行设计。作为为了构成作为目标的插入dna而进行连接的单位dna的数量(种)，为3～60(种)，优选为5～50(种)，更优选为8～25(种)，进一步优选为10～20(种)。
[0061]
以下，对本发明的微生物细胞转化用dna片段的制备方法的各步骤进行详细地说明。
[0062]
[步骤(a)]
[0063]
在本发明的微生物细胞转化用dna片段的制备方法中的步骤(a)中，制备所谓的种子质粒。种子质粒必须是如下结构，所述结构考虑了步骤(b)和步骤(c)，以在组装体构建后能分割为单位dna片段的方式，配合各种设计而将合适的限制性内切酶识别序列导入至单位dna的边界或附近。作为限制性内切酶，优选使用能够制造任意的序列突出末端的酶，如aari、alwni、bbsi、bbvi、bcodi、bfuai、bgli、bsai、bsaxi、bsmai、bsmbi、bsmfi、bspmi、bspqi、btgzi、draiii、foki、pflmi、sfani、sfii等。通过上述限制性内切酶处理而得的多个突出序列必须在单一种子质粒内成为唯一的序列。此外，种子质粒群必须在组合文库的重组单位(多数情况下，单位dna与该单位是一致的，但根据情况，重组单位有时在一部分种子质粒中包含多个单位dna)中于相同的链上以相同的顺序具有相同的突出序列。
[0064]
在ogab种子质粒的构建中，即，可以通过在上述的各单位dna以成为大致等摩尔的方式制备而得的单位dna混合液中使用dna连接酶等进行连接(ligation)来制造微生物转化用dna片段，但基因组装的起始材料并非仅限于上述各单位dna本身，如果最终能成为如上所述地能分割为各单位dna片段的结构，则也可以使用以任何组装方法准备的组装体。此处，大致等摩尔是指，单位dna混合液中的、所有的dna片段的摩尔浓度的比率为0.8～1.2的范围，优选为0.9～1.1的范围，更优选为0.95～1.05的范围，进一步优选为1.0。需要说明的是，也可以将单位dna混合液中的所有dna片段的摩尔浓度的比率成为上述数值范围内的情况改述为：单位dna混合液中所含的单位dna的浓度的最大值除以最小值而得的数值为1.0～1.5的范围、为1.0～1.2的范围、为1.0～1.1、为1.0。
[0065]
以本步骤制备的种子质粒的单位dna可以是基因簇、基因、基因片段等任何形式。
[0066]
单位dna的连接方法没有特别限制，优选在聚乙二醇和盐的存在下实施。作为盐，优选1价的碱金属的盐。具体而言，以含有10％聚乙二醇6000和250mm氯化钠的连接反应液实施是更优选的。此外，各单位dna的反应液中的浓度没有特别限制，优选为各1fmol/μl以上的浓度且为等摩尔。连接的酶、反应温度、时间没有特别限制，优选为t4dna聚合酶、37℃、30分钟以上。
[0067]
作为本发明的微生物转化用dna片段中的宿主微生物，只要是具有天然转化能力
的即可，没有特别限定。作为这样的微生物，可举出具有在摄入dna时处理为单链dna而摄入的天然转化能力的微生物等。具体而言，可举出芽孢杆菌(bacillus)属细菌、链球菌(streptococcus)属细菌、嗜血杆菌(haemophilus)属细菌、和奈瑟球菌(neisseria)属等。此外，作为芽孢杆菌属细菌，可举出枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、巨大芽孢杆菌(b.megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(b.stearothermophilus)等。作为其中最优选的微生物，可举出其天然转化能力和重组能力优异的枯草芽孢杆菌。
[0068]
使微生物细胞成为感受态的方法可以选择适合各微生物的已知方法。具体而言，例如，枯草芽孢杆菌的情况下，优选使用anagnostopoulou,c.和spizizen,j.j.bacteriol.，81,741
‑
746(1961)中记载的方法。此外，转化的方法也可使用适合各微生物的已知方法。给予感受态细胞的连接产物的液量也没有特别限制。优选的是，相对于感受态细胞培养液而言，为1/20至相等量，更优选为一半量。作为从转化体纯化质粒的方法，也可使用已知方法。
[0069]
可以通过由限制性内切酶切割而产生的片段的大小分布(size pattern)、pcr法、碱基测序法来确认通过上述方法得到的质粒具有作为目标的插入dna。此外，当插入dna具有生产物质等功能时，可以通过检测其功能来进行确认。
[0070]
对于组合文库构建中使用的种子质粒的调整而言，只要是常见的环状质粒的纯化法即可，可使用任意的方法，期望没有混入质粒dna以外的dna的风险的方法，具体而言，优选氯化铯
‑
溴化乙锭密度梯度超速离心法。
[0071]
[步骤(b)]
[0072]
本步骤为下述步骤：将通过步骤(a)制备的多种质粒(种子质粒)，用适合各质粒的限制性内切酶处理，分解为单位dna，制备多种单位dna混合液。通过步骤(a)制备的多种质粒(种子质粒)在被纯化为高纯度后，被分解为单位dna。对于分解成单位dna而言，可以配合步骤(a)中的设计而选择合适的限制性内切酶。
[0073]
就用于生成突出末端的限制性内切酶的种类数量而言，优选对于1个单位dna的切出使用1种限制性内切酶进行切割。虽然并非所有的单位dna都必须通过同一种限制性内切酶的消化来获得，但使用的限制性内切酶的种类总数较少为佳，3种以下是优选的，2种以下是更优选的，进一步优选1种。
[0074]
对于通过本步骤得到的单位dna混合液而言，由于种子质粒被纯化至极高纯度，使得其不存在质粒dna以外的dna片段。通过以限制性内切酶切割所制备的长链dna，并去除限制性内切酶，可以获得所有的dna片段的摩尔浓度的比率无限接近于1的dna片段溶液(单位dna混合液)。
[0075]
[步骤(c)]
[0076]
本步骤为下述步骤：使用通过步骤(b)得到的多种单位dna混合液，通过ogab法重新组装单位dna，制备长链dna片段。通过将步骤(b)中得到的、所有的dna片段的摩尔浓度的比率无限接近于1的dna片段溶液(单位dna混合液)作为起始材料实施基因组装方法(ogab法)，可以更高效地实施基因组装。需要说明的是，对于本步骤中的使用单位dna混合液、通过ogab法重新组装单位dna的方法而言，可以适用步骤(a)中的说明。
[0077]
本发明还包括微生物细胞转化用dna片段的制备方法，其中，所述微生物细胞转化用dna片段具有至少1个插入dna单元，所述插入dna单元包含含有在宿主微生物中有效的复
制起点的dna、和单位dna连接而成的插入dna，所述方法的特征在于包括下述步骤：
[0078]
步骤(b’)，将通过上述的本发明的方法制备的多种质粒用适合各质粒的限制性内切酶处理，分解为单位dna，制备多种单位dna混合液；和
[0079]
步骤(c)，使用通过步骤(b’)得到的单位dna混合液，通过ogab法重新组装单位dna，制备长链dna片段。
[0080]
可以选择多种含有通过上述的本发明的方法得到的长链dna片段的质粒，作为步骤(b’)中的质粒进行再利用。
[0081]
本发明还包括含有通过上述的本发明的制备方法得到的微生物细胞转化用dna片段的质粒。此外，还包括使用了本发明的制备方法的嵌合质粒文库的构建方法。
[0082]
实施例
[0083]
通过以下实施例具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。
[0084]
实施例中使用的试剂等、共通的试验方法等如下所述。
[0085]
作为枯草芽孢杆菌的宿主，使用rm125株(uozumi,t.等，moi.gen.genet.,152,65
‑
69(1977))及其衍生菌株busy9797株。作为能够在枯草芽孢杆菌中复制的质粒载体，使用pget118(kaneko,s.等，nucleic acids res.31,e112(2003))。抗生素羧苄青霉素购自和光纯药工业会社。抗生素四环素购自sigma公司。限制性内切酶sfii和bspqi购自neb公司。t4 dna连接酶购自takarabio公司。用于构建大肠杆菌的质粒的常规连接中使用takara ligation kit(mighty)(takarabio公司)。用于单位dna制备的pcr反应中使用toyobo公司的kod plus聚合酶。另一方面，用于确定克隆至质粒中的dna的碱基序列的菌落pcr中使用takarabio公司生产的ex
‑
taq hs。pmd
‑
19(simple)购自takarabio公司。环状质粒纯化用酶plasmid safe使用epicenter公司生产的产品。作为用于dna电泳的低熔点琼脂糖凝胶的2
‑
羟乙基琼脂糖(2
‑
hydroxyethyl agarose)购自sigma公司。其它的常规电泳用琼脂糖凝胶使用invitrogen公司的ultrapure agarose。苯酚：氯仿：异戊醇25:24:1和te饱和苯酚(含有8
‑
羟基喹啉)使用nacalai tesque公司生产的产品。溶菌酶购自和光纯药工业会社。lb培养基的培养基成分及琼脂使用becton dickinson公司生产的产品。iptg(异丙基s
‑
d
‑
硫代半乳糖苷：isopropyl s
‑
d
‑
thiogalactopyranoside)使用和光纯药工业会社的产品。其它的所有培养基成分和生化试剂均使用和光纯药工业会社的产品
[0086]
特殊记载以外的质粒的构建使用大肠杆菌dh5α株、jm109株、top10株中的任一者。所构建的质粒自大肠杆菌中的少量纯化使用qiagen公司的qiaprep spin miniprep kit，大量纯化使用同一公司的qiafilter midi kit。从酶反应液中提纯(cleanup)dna使用qiagen公司的minelute reaction cleanup kit或同一公司的qiaquick pcr纯化试剂盒(qiaquick pcr purification kit)。在纯化以通常的琼脂糖凝胶电泳分离得到的凝胶块时，使用qiagen公司的minelute gel extraction kit。超微量分光光度计使用thermo公司的nano
‑
drop 2000。碱基序列确定使用作为applied biosystems公司生产的荧光自动测序仪的3130xl基因分析仪。
[0087]
对于其它的常规dna操作而言，按照标准操作流程(sambrook,j.等，molecular cloning:a laboratory manual.cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,new york(1989))实施。基于ogab法等的枯草芽孢杆菌的转化和质粒提取按现有方法实施(tsuge,k.等，nucleic acids res.31,e133.(2003)).
[0088]
1.插入dna单元的制备
[0089]
(1)组装用质粒载体的构建
[0090]
组装用质粒载体pgets302_sfii
‑
pbr是具有大肠杆菌的pbr322的复制起点、在枯草芽孢杆菌中发挥功能的复制起点repa、可在出芽酵母中进行复制的ars4和cen6的大肠杆菌
‑
枯草芽孢杆菌
‑
酵母间穿梭质粒载体，是基于pgets109(tsuge等，nucleic acids res.,31,e133.(2003))经由多步过程构建而得的质粒。图1中示出了它的结构，序列号1中示出了碱基序列。组装基因的克隆位点位于2个sfii切割位点之间，组装时使用最大的15kb的sfii片段。大肠杆菌中的筛选使用氨苄西林(ampicillin)。向本质粒5μg中添加无菌水使整体成为40μl后，添加5μl限制性内切酶附带的10x neb2.1 buffer和5μl限制性内切酶sfii(neb公司)，于50℃使其反应2h。将得到的液体通过低熔点琼脂糖凝胶电泳分离后，从凝胶中切出载体本身的约15kb的片段，纯化目标dna片段，溶解于20μl的te中，取其1μl通过超微量分光光度计测定浓度。
[0091]
(2)单位dna突出序列的设计方法
[0092]
如图2所示，构成1个插入单元的单位dna包括组装用载体pgets302在内总共存在14个片段。出芽酵母中与异丁醇代谢通路相关的基因群总共有12个，将它们依次定义为第1至第12单位dna。将出芽酵母中作为转化用筛选标记发挥作用的kanmx4定义为第13单位dna，并将组装载体定义为第14单位dna。第1～第14单位dna按数字进行连续，并成为第14和第1单位dna连接的结构，由此形成1个插入单元。在各单位dna的末端存在固有的三碱基3’末端突出碱基，所述3’末端突出碱基是在片段的左右针对各单位dna编号而指定的。通过该互补性来指定连接对象。具体而言，成为如下的构成。(第14单位dna)
‑
gtt
‑
(第1单位dna)
‑
tga
‑
(第2单位dna)
‑
cga
‑
(第3单位dna)
‑
tgt
‑
(第4单位dna)
‑
gat
‑
(第5单位dna)
‑
ttg
‑
(第6单位dna)
‑
gtc
‑
(第7单位dna)
‑
atg
‑
(第8单位dna)
‑
tgg
‑
(第9单位dna)
‑
tag
‑
(第10单位dna)
‑
act
‑
(第11单位dna)
‑
gta
‑
(第12单位dna)
‑
ctt
‑
(第13单位dna)
‑
tct
‑
(第14单位dna)。
[0093]
2.出芽酵母异丁醇生产基因群的基因表达量的调节
[0094]
(1)出芽酵母
[0095]
出芽酵母(saccharomyces cerevisiae)是真核的微生物，作为真核生物的模式微生物而不断开展研究，基因组序列已完全明确，积累了各种信息。出芽酵母作为无氧呼吸而发酵醇类。出芽酵母自古以来被用于啤酒、红酒、日本酒等的发酵，由于高乙醇生产能力而逐渐被广泛地用作生物乙醇生产的宿主。目前，还在工业上被广泛地用作乙醇以外的有用物质生产的宿主，除碳链数为3个以上的高级醇、各种有机酸以外，还被用于色素、香料、补充剂(supplement)等增值产品的生产。作为真核生物的出芽酵母与作为原核生物的细菌不同，具有线粒体、细胞核等细胞器。此外，由于通常采用单顺反子的表达形式而非多顺反子的表达形式，因此每1个基因均需要1个启动子，例如为了表达12个基因，需要12个启动子。
[0096]
(2)异丁醇代谢通路设计
[0097]
异丁醇的主要用途是有机合成溶剂、除漆剂、甲基丙烯酸异丁酯的原料。此外，异丁醇可以通过脱水转化为异丁烯，可作为乙基叔丁基醚(etbe)等燃料混合剂、生物喷气燃料的原料使用，进而通过将异丁烯转化为异辛烯(二异丁烯)，还可作为各种聚合物的原料使用。出芽酵母原本是生产乙醇作为主要的生成物，生产少量的异丁醇作为杂醇。为了高产异丁醇而设计的出芽酵母的人工代谢通路示于图3中。如果针对出芽酵母内的l
‑
缬氨酸代
谢通路内的2酮异戊酸(2
‑
keto
‑
isovalerate)导入编码酮酸脱羧酶(kdc)和乙醇脱氢酶(adh)的2个基因(例如，源自乳酸乳球菌(lactococcus lactis)的kivd和源自出芽酵母的adh6)，则异丁醇的产量提高，因此，将所述基因加入组装对象。然而，由于底物2酮异戊酸本来产于线粒体内、或酮醇酸还原异构酶(ilv5)、adh6所必需的nadph不足等多种原因，不能进行高效的异丁醇生产。因此，以增强下述基因的表达为目的，将其加入组装对象：编码构成线粒体内进行的从丙酮酸到2酮异戊酸的通路(图3以双线示出的代谢通路)的乙酰乳酸合成酶(ilv2)、酮醇酸还原异构酶(ilv5)、二羟酸脱水酶(ilv3)的3个基因；和用于调整线粒体内的nadph的苹果酸酶(mae1)，共计4个基因(图3中以双下划线示出的基因)。进一步地，将下述基因加入组装对象，使得在细胞质侧也构成上述代谢通路：ilv2cec、ilvdll、alslp这3个基因；及用以解决细胞质内的nadph不足的、固碳酶(pyc2)、苹果酸脱氢酶(mdh2)、去除了苹果酸酶(mae1)n末端的线粒体定位信号而得的smae1这3个基因，共计6个基因(图3以单下划线示出的基因)。针对以上所述的12个基因分别导入了可于酵母内强力地进行表达的初级代谢通路的启动子和终止子。
[0098]
(3)种子质粒1：过表达基因群组的设计
[0099]
为了能在出芽酵母中表达12个基因，设计使用了12种启动子和终止子的表达盒。具体而言，使用adh1、fba1、hxt7、pdc1、pgk1、sed1、tdh1、tdh2、tdh3、tef1、tef2、tpi1的启动子和终止子，设计了12种表达盒(图4的基因orf上的箭头意指启动子序列，钉(pin)意指终止子序列)。在各表达盒的启动子和终止子之间，以能够将所插入的基因从起始密码子(atg)至终止密码子(taa)进行亚克隆的方式，附加以相反方向配置有2个bspqi位点的序列(
…
atgagaagagctcttcataa
…
)。针对pdc1启动子和tdh2启动子，为了消除序列中所含的bspqi位点，对于pdc1启动子使用使
‑
492位的g突变为c的序列，对于tdh2启动子使用使
‑
462位的c突变为g的序列。含有启动子和终止子的12种表达盒左右的末端序列分别附加以限制性内切酶位点(sfii位点)，其是以用sfii切割后出现针对单位dna的编号而指定的固有的三碱基3’末端突出碱基的方式设计的，序列以通过互补性来指定连接对象的方式进行了设计。含有上述12种启动子和终止子的表达盒设计为可供克隆至pma或pmk载体中。之后，作为与出芽酵母中的异丁醇代谢通路相关的12个基因群，挑选ilvec、ilvdll、alslp、kivd、ilv3、ilv5、adh6、pyc2、ilv2、mdh2、maebec、smae1，改变序列以使各基因的起始密码子统一为atg，终止密码子统一为taa。此外，上述基因以能够亚克隆至12种表达盒的任一者中的方式进行设计，向两个末端附加配置有bspqi位点的序列(taggctcttcaatg
…
taaagaagagccta)(图2)。在两个末端具有bspqi位点的上述基因设计为可克隆至pcr
‑
bluntii
‑
topo载体中。最终，设计出共计12种过表达盒(ilvcec
‑
1st，ilvdll
‑
2nd，alslp
‑
3rd，kindec
‑
4th，ilv3
‑
5th，ilv5
‑
6th，adh6
‑
7th，pyc2
‑
8th，ilv2
‑
9th，mdh2
‑
10th，maebec
‑
11th，smae1
‑
12th)(序列号2
‑
13)，以使得向克隆至pma或pmk中的具有adh1、fba1、hxt7、pdc1、pgk1、sed1、tdh1、tdh2、tdh3、tef1、tef2、tpi1的启动子和终止子的12种表达盒的bspqi位点中分别插入ilvec、ilvdll、alslp、kivd、ilv3、ilv5、adh6、pyc2、ilv2、mdh2、maebec、smae1。此外，为了能够在出芽酵母内以药剂进行筛选，导入kanmx片段(kanmx4
‑
13th)作为第13个片段(序列号14)。
[0100]
(4)种子质粒2：表达抑制基因群组的设计
[0101]
遵循“(3)种子质粒1：过表达基因群组的设计”，使用相同的启动子和终止子序列，
但所插入的各基因的orf片段以相对于过表达基因群组朝向相反方向的方式进行设计。具体而言，准备了具有下述构成的质粒：以bspqi切割(3)中设计的、能够将所插入的基因从起始密码子(atg)到终止密码子(taa)亚克隆至各表达盒的启动子和终止子之间的质粒，并向其新连接以相反方向配置有2个bspqi位点的序列，从而变更了突出序列(
…
atgttaagaagagctcttcacattaa
…
的下划线部分序列)。经由上述步骤制作而得的表达抑制盒(ilvcec
‑
as
‑
1st，ilvdll
‑
as
‑
2nd，alslp
‑
as
‑
3rd，kindec
‑
as
‑
4th，ilv3
‑
as
‑
5th，ilv5
‑
as
‑
6th，adh6
‑
as
‑
7th，pyc2
‑
as
‑
8th，ilv2
‑
as
‑
9th，mdh2
‑
as
‑
10th，maebec
‑
as
‑
11th，smae1
‑
as
‑
12th)的碱基序列示于序列号15
‑
26中。对于单位dna，就结果而言，种子质粒2的单位dna与种子质粒1的单位dna相比长出新导入的突出序列的6个碱基。需要说明的是，对于作为药剂筛选标记的kanmx，使用与种子质粒1相同的物质。
[0102]
(5)种子质粒的构建
[0103]
对于基因(orf区域)，使用pcr法从出芽酵母(yph499株)基因组进行扩增。首先，使用如下引物：所述引物在用于扩增上述中确定的突出组合之间的dna序列的引物的5’末端，将上述确定的限制性内切酶识别位点附加于切出期望的突出的位置，进一步于5’末端附加tag序列。使用上述引物组，从出芽酵母基因组中扩增指定区域的dna片段。pcr的反应条件为，针对每1个反应(50μl)添加kod plus 10x缓冲液ver.2 5μl、25mm mgso
4 3μl、dntp(各2mm)5μl、kod plus(1单位/μl)1μl、λ噬菌体dna(toyobo)48pg、引物(分别为f引物和r引物)15pmol、无菌水进行制备，利用geneamp pcr system 9700(applied biosystems公司)基于以下程序实施。94℃、2分钟的孵育后，将98℃ 10s、55℃ 30s、68℃ 1分钟实施30个循环，最后于68℃孵育7分钟。
[0104]
扩增的dna片段以0.7％的低熔点琼脂糖凝胶(2
‑
hydroxyethyl agarose typevii，sigma公司)，在1x tae(tris
‑
acetate
‑
edta buffer)缓冲液的存在下，在通用琼脂糖凝胶电泳装置(i
‑
myrun.n核酸用电泳系统，cosmobio公司)施加100v(约8v/cm)的电压，电泳1h，由此分离质粒载体和单位dna。将该电泳凝胶以含有1μg/ml溴化乙锭(sigma公司)的1x tae缓冲液100ml染色30分钟，通过以长波长紫外线(366mn)照射使其可视化，用剃刀片切出目标大小的pcr产物，回收至1.5ml管中。通过向回收的低熔点琼脂糖凝胶(约300mg左右)中添加1x tae缓冲液，使总体积成为约700μl，将其于65℃恒温10分钟以使凝胶溶解。然后，添加等量的te饱和苯酚(nacalai tesque公司)，通过充分混合使限制性内切酶失活。通过离心分离(20,000x g、10分钟)分离苯酚相和水相，将水相(约900μl)回收至新的1.5ml管中。向其中添加1
‑
丁醇(和光纯药工业会社)500μl，充分混合后，通过离心分离(20,000
×
g、1分钟)来进行分离，重复进行去除水饱和1
‑
丁醇的操作直至使水相的体积成为450μl以下，由此使水相的体积减少。向其中添加3m乙酸钾
‑
乙酸缓冲液(ph5.2)50μl和乙醇900μl，通过离心分离(20,000x g、10分钟)沉淀dna，将其用70％乙醇清洗，溶解于20μl的te(10mm tris
‑
hcl，1mm edta，ph8.0)中。该回收dna保存于
‑
20℃至使用。
[0105]
得到的dna片段通过以下所示的方法由ta克隆法克隆至大肠杆菌质粒载体中。对于dna片段8μl，向takara公司的pcr反应用酶ex
‑
taq附带的10x ex
‑
taq buffer 1μl中添加100mm datp 0.5μl、ex
‑
taq 0.5μl，于65℃恒温10分钟，将a的突出附加于dna片段的3’末端。向该dna片段溶液1μl中混合takara公司的pmd19
‑
simple 1μl和无菌水3μl，然后加入takata ligation(mighty)mix 5μl，于16℃恒温30分钟。将该连接溶液5μl添加至50μl的大
肠杆菌dh5α的化学感受态细胞中，冰上恒温15分钟后，于42℃热激30秒，冰上放置2分钟，然后添加lb培养基200μl，37℃恒温1h，然后涂抹至以100μg/ml的浓度含有羧苄青霉素并含有1.5％琼脂的lb平板上，37℃培养过夜，由此获得质粒的转化体。
[0106]
将得到的菌落使用pcr用模板dna制备试剂(cica geneus dna制备试剂、关东化学)进行制备。具体而言，准备2.5μl将试剂盒内的试剂a与试剂b按1:10的比率混合而得的溶液，将牙签少量采集的平板上的菌落悬浮于其中后，于72℃处理6分钟，然后于94℃处理3分钟。向得到的液体中添加takara ex
‑
taq用10x酶2.5μl和2.5mm dntp溶液2μl、10pmol/μl的m13f引物0.25μl和10pmol/μl的m13r引物0.25μl、无菌水17μl、ex
‑
taqhs 0.5μl，94℃孵育5分钟，然后将98℃、20秒、55℃、30秒、72℃、1分钟实施30个循环，由此扩增dna，通过调查该pcr产物的碱基序列，调查是否与期望的序列完全一致。最终从所有克隆中均得到了正确的序列。
[0107]
将携带克隆具有期望序列的dna片段的质粒的大肠杆菌转化体分别用加有2ml的100μg/ml羧苄青霉素的lb培养基于37℃、120spm培养过夜，将得到的菌体使用qiafilter plasmid minikit(qiagen公司)根据手册进行纯化。得到的质粒用bspqi进行切割，通过基于电泳的大小分级，回收orf区域。
[0108]
委托thermo fisher公司合成了以能够于sfii位点切出于bspqi位点连接处连接有酵母的启动子和终止子的dna片段的方式设计的dna(图2过表达用)。上述dna片段以克隆至质粒载体pam或pmk中的形态接收。以bspqi切割该质粒，构建上述orf的bspqi片段的连接物，作为携带种子质粒1的单位dna的质粒进行准备。上述单位dna片段的序列如序列号2～13所示。对于种子质粒2所使用的，通过用bspqi切割上述克隆至pma或pmk中的于bspqi位点连接处连接有启动子和终止子的dna片段，并导入接头dna，新构建为图2的表达抑制所使用的方式。以bspqi切割该质粒，并导入上述orf的bspqi片段，由此进行构建。将携带克隆具有上述期望序列的dna片段的质粒的大肠杆菌转化体分别用加入2ml的100μg/ml羧苄青霉素的lb培养基于37℃、120spm培养过夜，将得到的菌体使用qiafilter plasmid minikit(qiagen公司)根据手册进行纯化。分取得到的质粒10μl，添加无菌水30μl、10x neb缓冲液#2 5μl、sfii限制性内切酶(neb)5μl，使其于50℃反应2h，由此将单位dna片段从质粒载体切离。将其在0.7％的低熔点琼脂糖凝胶中，于1x tae缓冲液的存在下，在通用琼脂糖凝胶电泳装置中施加50v(约4v/cm)的电压，电泳1h，由此分离质粒载体和单位dna。将该电泳凝胶以含有1μg/ml溴化乙锭(sigma公司)的1x tae缓冲液100ml染色30分钟，通过以长波长紫外线(366mn)照射使其可视化，用剃刀片切出3kb附近，回收至1.5ml管中。回收的低熔点琼脂糖凝胶(约300mg左右)如上所述进行纯化，溶解于20μl的te中。如此制备的单位dn质粒使用基于市售的λ噬菌体基因组dna(toyobo)的稀释系列制作的校正曲线，通过核酸荧光染料的sybr greenii荧光读板器进行定量。
[0109]
(6)基因组装
[0110]
向如下混合溶液10μl中添加2x连接缓冲液11μl，种子质粒1的组装中，所述混合溶液含有0.1foml以上的等摩尔的序列号2～14的各单位dna和作为基因组装用载体的pgets302
‑
sfii(序列号1)，种子质粒2的组装中，所述混合溶液含有0.1foml以上的等摩尔的序列号14～26的各单位dna和作为基因组装用载体的pgets302
‑
sfii(序列号1)，整体于37℃恒温5分钟后，添加1μl的t4dna连接酶(takara)，于37℃恒温4h。通过取10μl进行电泳
确认已连接，然后采集10μl至新管中，添加枯草芽孢杆菌感受态细胞100μl，于37℃使用鸭式转子(duck rotor)旋转培养30分钟。然后，添加300μl的lb培养基，于37℃使用鸭式转子(duck rotor)旋转培养1h，然后将培养基铺展于加有10μg/ml四环素的lb平板上，于37℃培养过夜。对于菌落而言，从过表达和基因表达抑制的任一方的构建中均获得了100个转化体。通过提取质粒并调查限制性内切酶切割模式，分别选择各1个携带目标结构(图4的步骤(a)的种子质粒)的转化体。
[0111]
(7)种子质粒的高纯度纯化
[0112]
通过氯化铯
‑
溴化乙锭密度梯度超速离心法供应高纯度的质粒dna。具体而言，准备加有抗生素(四环素)的lb培养基200ml，向500ml三角烧瓶中各自加入100ml，于37℃培养过夜。充分增殖后，为了使质粒的拷贝数增加，向各烧瓶中各自加入1m的iptg100μl，继续培养3小时至12小时左右。培养结束后，各分配50ml至4根50ml管(falcon 2070)中，5,000rpm离心10分钟。弃上清液，通过涡旋(vortex)使菌体团块完全散开。准备加有10mg/ml溶菌酶的sol.i溶液(组成为50mm葡萄糖、25mm tris
‑
cl(ph 8.0)、10mm edta)，向4根装有菌的管中分别各添加2.5ml，充分混合。将其于37℃孵育30分钟。5,000rpm离心10分钟，通过倾倒去除上清液，向4根管中分别新添加2.5ml不含溶菌酶的sol.i，将团块均匀地悬浮。制备新鲜的sol.ii(组成为0.2n naoh、1％(w/v)十二烷基硫酸钠)，向4根管中分别添加各5ml，缓慢地混合至成为透明。向各管中添加sol.iii(组成为60ml 5m乙酸钾、11.5ml冰乙酸、28.5ml水)各3.75ml，以能使白浊物质均等分散的程度强力混合。5,000rpm离心10分钟，用移液器吸取上清液，移至4根新的螺旋盖的50ml管(falcon 2070)中。向各管中添加5ml苯酚
·
氯仿，激烈混合。5,000rpm离心10分钟，用移液器吸取上清液，移至4根新的螺旋盖的50ml管(falcon2070)中。添加100％乙醇各25ml并混合，5,000rpm离心10分钟。去除上清液。向各管添加在10ml的te中添加有10mg/ml的rnasea溶液10μl的溶液(最终浓度10μg/ml)各2.5ml，溶解沉淀。将4根管的液体合入1根中，在37℃的气相的孵育箱中孵育30分钟。孵育结束后，添加5ml苯酚
·
氯仿，充分混合后，5,000rpm离心10分钟。将上清液移取至新的50ml管中，添加1ml的sol.iii后，添加100％乙醇25ml并混合。然后，5,000rpm离心10分钟并去除上清液。向沉淀中添加5.4ml的te，完全溶解。之后，投入准确称量的6.40g氯化铯，完全溶解。进一步地，添加1.3g/ml氯化铯溶液(混合1.3g氯化铯与1ml水制造的溶液，未调整体积)2.6ml。最后，添加10mg/ml溴化乙锭溶液600μl，充分混合。准备1根超速离心管(beckman362181)，将内容物移至超速离心管中。添加水或1.3g/ml氯化铯溶液(比重约1.5g/ml左右)对重量进行微调，使与平衡物的重量差异为20mg以内。以超速离心装置(beckman coulter)在以下条件下实施离心。温度18℃、速度50,000rpm、加速度max、减速度max，离心15小时以上。离心结束后，于紫外线(365nm)观察下，准备配置了针(21gx5/8”)的1ml注射器，插入ccc型质粒的条带中，回收质粒溶液，移至15ml管。向其中添加sol.iii 500μl，之后，以整体成为3ml的方式添加水。进而添加9ml的100％乙醇。5,000rpm离心10分钟，去除上清液。于15ml管中向得到的沉淀中添加700μl的te，溶解dna。将其移至1.5ml管中，添加600μl的1
‑
丁醇并混合，以15,000rpm离心10s左右，分离为2层，舍去上层的丁醇层。新添加600μl的1
‑
丁醇并混合，15,000rpm离心10s左右，分离为2层，舍去上层的丁醇层。继续该操作直至水层成为450μl以下。添加50μl的sol.iii，进而添加100％乙醇900μl。15,000rpm离心10分钟。舍去上清液，以70％乙醇清洗沉淀。将沉淀溶解于22μl的te中。
[0113]
(8)从种子质粒生成单位dna
[0114]
图4的步骤(b)的单位dna的制备如下实施。分取通过超速离心法纯化至高纯度的种子质粒300ng，以无菌水定容至40μl后，添加5μl的10x neb缓冲液#2和5μl限制性内切酶sfii(neb公司)，使其于37℃反应2h。对1μl反应液施以电泳，确认到已进行了切割。然后，合并2个种子质粒的反应液，添加450μl苯酚
·
氯仿
·
异戊醇(25:24:1)(nacalai tesque公司)，混合后，通过离心分离(20,000xg、10分钟)分离为苯酚相和水相，将水相(约900μl)回收至新的1.5ml管中。向其中添加1
‑
丁醇(和光纯药工业会社)500μl，充分混合后，通过离心分离(20,000
×
g、1分钟)进行分离，重复进行去除水饱和1
‑
丁醇的操作直至使水相的体积成为450μl以下，由此使水相的体积减少。向其中添加3m乙酸钾
‑
乙酸缓冲液(ph5.2)50μl和乙醇900μl，通过离心分离(20,000x g、10分钟)，沉淀dna，将其用70％乙醇清洗，溶解于20μl的te中。
[0115]
(9)组合文库的构建
[0116]
图4的步骤(c)的组合文库的构建如下实施。(8)得到的dna混合溶液通过(6)所示的基因组装方法进行组装，获得约400个转化体。从得到的转化体随机选择96株菌落，用2ml的加有10μg/ml四环素的lb培养基培养过夜，为了使内部的质粒拷贝数扩增，以最终浓度成为1mm的方式添加iptg，进而于37℃培养3h。从得到的菌体提取质粒。使用序列号27
‑
62所示的引物组，通过pcr法确定上述提取的质粒的各基因的方向(图5)。其结果是，75个克隆具备12个基因的所有要素，21个克隆观察到单位dna的部分缺失或重复。75个克隆中存在71种不同的组合，针对4个克隆观察到种类的重复。
[0117]
(10)向酵母中导入组合文库
[0118]
使用乙酸锂(liac)法将(9)中得到的96个组合文库导入至酵母中。具体而言，将作为亲本株的出芽酵母yph499株接种至ypda培养基(10g/l干燥酵母提取物[nacalai tesque公司制]、20g/l蛋白胨[becton dickinson(bd difco)公司制]、20g/l葡萄糖、40mg/l腺嘌呤硫酸盐)5ml中，于30℃、150opm培养过夜。将培养液以3,000rpm离心分离5分钟，弃去培养基后，以无菌蒸馏水5ml悬浮菌体团块。进而，以3,000rpm离心分离5分钟后，舍去上清液，将菌体团块悬浮于te/liac溶液1.5ml(10x te 150μl、10x liac 150μl、无菌蒸馏水1,200μl)中。将菌体悬浮液100μl移至1.5ml eppendorf管中，加入质粒dna(组合文库)1～5xμl和carrier dna[takara bio(clontech)公司制]2μl，然后加入te/liac/peg溶液600μl(10x te60μl、10x liac 60μl、50％peg3350溶液480μl)，涡旋混合10秒。将混合液于30℃孵育30分钟后，加入二甲基亚砜(dmso)70μl颠倒混和，进而于42℃孵育15分钟。于14,000rpm离心分离5秒后，完全除去上清液，加入不含l
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亮氨酸的100x氨基酸储液(4g/l腺嘌呤硫酸盐、2g/l l
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组氨酸、4g/l l
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色氨酸、2g/l尿嘧啶、3g/l l
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赖氨酸)250μl，将菌体团块悬浮，补加无菌蒸馏水550μl，然后将全部悬浮液铺展于sd培养基(6.7g/l不含氨基酸的酵母氮源基础(yeast nitrogen base without amino acids：ynb)[becton dickinson(bd difco)公司制]、20g/l葡萄糖)的琼脂平板(向培养基中加入20g/l琼脂粉末)上，干燥后于30℃孵育3天，获得转化体。
[0119]
(11)出芽酵母中的异丁醇生产性能的评价
[0120]
将得到的酵母转化体的菌落接种至sd筛选培养基(加入不含l
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亮氨酸的100x氨基酸储液的sd培养基)5ml中，于30℃、150opm培养3天。3,000rpm离心分离5分钟，弃去培养基
后，用无菌蒸馏水5ml悬浮菌体团块。进而于3,000rpm离心分离5分钟，弃去上清液，然后用新的sd筛选培养基5ml悬浮菌体团块，于30℃、150opm培养48小时。将培养液于3,000rpm离心分离5分钟后，回收上清液。将回收的培养基上清液5100μl加至丙酮45900μl中，涡旋混合，以12,000rpm离心分离5分钟后，回收上清液。回收的上清液移至玻璃小瓶(glass vial)中，在气相色谱质谱仪(gcms qp2010 ultra[岛津制作所制])中，使用db
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ffap柱[agilent technologies公司制]对培养基中所含的异丁醇浓度进行定量。其结果如图5所示，得到了以克隆96为代表(146mg/l)的、显示出各种异丁醇产量的菌株。其中，得到了异丁醇产量比向酵母中导入过表达的种子质粒和基因表达抑制的种子质粒而得的菌株(分别为29mg/l和15mg/l)更多的菌株。
[0121]
(12)基于文库的优良质粒的选择和文库的再次构建
[0122]
以异丁醇产量成为120mg/ml以上的克隆8、42、68、96的转化中使用的质粒作为种子质粒，构建了新的组合文库(图6)。首先，大量培养携带上述质粒的枯草芽孢杆菌，通过(7)中所示的超速离心法提取质粒，通过(8)中所示的方法准备以等摩尔混合的单位dna。然后，通过实施(6)中所示的遗传组装，构建包含约200个转化体的第2个循环的目标组合文库。针对从中随机选择的24个菌落，从枯草芽孢杆菌中提取质粒，通过(10)中所示的方法个别地导入酵母中，通过(11)中所示的方法测定异丁醇产量。针对从枯草芽孢杆菌中提取的质粒，另行通过(9)中记载的方法鉴定各单位dna内的基因的方向。其结果示于图7中。就文库而言，对于除组装不完整的克隆3和克隆12这2个克隆以外的22个克隆，与期待一致，在4个种子质粒中共通的第6、第9、第11、第12单位dna是共通的，而对于其它的单位dna，则是大致反映了种子质粒的组成比率的形式。在22个中存在19种不同的组合，其中2种与作为种子质粒的第1次文库的克隆68和96是相同的。对于异丁醇产量而言，克隆8、4、23、13分别为173mg/l、171mg/l、169mg/l、164mg/l，得到了大量显示出高于第1次文库的最大值146mg/l的生产性能的克隆。
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产业上的可利用性
[0124]
根据本发明，迅速且高效地构建长链dna的组合文库成为可能。特别地，具有如下特征：即使不确认得到的质粒的基因型，也可以将选自相同文库的多个质粒再次用于构建新的嵌合文库，因而能够迅速地实施第2次之后的文库的构建。