一种鉴定无色书虱的方法及其使用的引物组与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定无色书虱的方法及其使用的引物组。


背景技术：

2.无色书虱隶属于啮虫目(psocodea)，书虱科(liposcelididae)，书虱属(liposcelismotschulsky，1852)，世界广泛分布。书虱个体微小，成虫体长一般为0.6-1.5mm。目前，全球已知的书虱属昆虫共计126种，其中我国已报道28种。世界常见的仓储书虱主要包括以下10种：暗褐书虱(l.brunnea)、嗜虫书虱(l.entomophila)、嗜卷书虱(l.bostrychophila)、小眼书虱(l.paeta)、无色书虱(l.decolor)、啮书虱(l.corrodens)、皮氏书虱(l.pearmani)、红书虱(l.rufa)、三色书虱(l.tricolor)和虚伪书虱(l.mendax)。
3.仓储书虱食性广，喜食粮食的胚部与破碎颗粒，喜温暖潮湿，活动能力强，繁殖速度快。在适宜条件下，仓储书虱种群极易扩张而爆发成灾。仓储书虱大量发生时会造成粮食局部发热发潮引起霉变，对原粮的储藏造成极大威胁，带来严重的污染与经济损失。书虱由于体型微小，易藏于缝隙中，可通过国际贸易随着粮食、皮张、牧草等在世界范围内进行传播，我国曾多次在口岸截获过书虱。因此，如何有效快速、准确地鉴别出书虱的种类，对于仓储物保护领域的害虫监测和植物检疫领域的害虫鉴定等，显得尤为重要。
4.书虱的鉴定方法主要采用传统的形态鉴定和分子鉴定技术。由于书虱个体微小，需要专业的形态学知识储备，进行形态鉴定困难。现有的pcr分子鉴定技术虽然可实现快速、准确的鉴定，但需昂贵的仪器设备，鉴定成本高，不适于在基层部门中推广应用。
5.环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的bst dna聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应。lamp针对靶序列的6个区域设计4条特异引物，利用具备链置换功能的dna聚合酶在恒定温度下不断复制扩增dna。为了提高反应效率，可在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。lamp是一种简便高效的核酸恒温扩增技术，可以在短时间内大量扩增反应产物，具更高灵敏度，且操作简便，无需特殊仪器，检测结果可由肉眼观察判断，适于基层部门推广应用。lamp中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。


技术实现要素：

6.本发明的目的是鉴定无色书虱。
7.本发明首先保护引物组，可包括引物-f3、引物-b3、引物-fip和引物-bip；
8.所述引物-f3的核苷酸序列如seq id no:1所示；
9.所述引物-b3的核苷酸序列如seq id no:2所示；
10.所述引物-fip的核苷酸序列如seq id no:3所示；
11.所述引物-bip的核苷酸序列如seq id no:4所示。
12.所述引物组中，所述引物-f3、所述引物-b3、所述引物-fip和所述引物-bip的摩尔比具体可为1:1:4:4。
13.上述任一所述引物组具体可由所述引物-f3、所述引物-b3、所述引物-fip和所述引物-bip组成。
14.本发明还保护上述任一所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途可为(y1)或(y2)：
15.(y1)鉴定无色书虱；
16.(y2)检测待测样本中是否含有无色书虱。
17.本发明还保护含有上述任一所述引物组的试剂盒；所述试剂盒的用途可为(y1)或(y2)：
18.(y1)鉴定无色书虱；
19.(y2)检测待测样本中是否含有无色书虱。
20.所述试剂盒还可含有染料。所述染料可为hnb染料。
21.所述试剂盒具体可由上述任一所述引物组和hnb染料组成。
22.本发明还保护上述任一所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
23.本发明还保护一种鉴定待测书虱是否为或疑似为无色书虱的方法，可包括如下步骤：以待测书虱的基因组dna为模板，采用上述任一所述引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：如果可以实现以所述基因组dna为模板的特异性扩增，则待测书虱为或疑似为无色书虱；如果不可以实现以所述基因组dna为模板的特异性扩增，则待测书虱不为或疑似不为无色书虱。
24.本发明还保护一种检测待测样本中是否含有或疑似含有无色书虱的方法，可包括如下步骤：以待测样本的总dna为模板，采用上述任一所述引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：如果可以实现以所述总dna为模板的特异性扩增，则待测样本含有或疑似含有无色书虱；如果不可以实现以所述总dna为模板的特异性扩增，则待测样本不含有或疑似不含有无色书虱。
25.上述任一所述方法中，环介导等温扩增反应体系具体可为体系1，总体积为25μl，由12.5μl warm start lamp 2
×
master mix、1μl模板、引物混合物和无菌超纯水组成。
26.采用体系1时，将环介导等温扩增的产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果呈典型梯状条带，则可以实现模板的特异性扩增；如果不呈典型梯状条带(如没有条带)，则不可以实现模板的特异性扩增。
27.上述任一所述方法中，环介导等温扩增反应体系具体可为体系2，总体积为25μl，由12.5μl warm start lamp 2
×
master mix、1μl模板、1μl hnb(3mmol/l)、引物混合物和无菌超纯水组成。
28.采用体系2时，完成环介导等温扩增后，肉眼观察反应体系的颜色，然后进行如下判断：如果呈天蓝色，则可以实现模板的特异性扩增；如果呈紫罗兰色，则不可以实现模板的特异性扩增。
29.上述任一所述引物混合物即引物组中的各条引物组成的混合物。
30.上述任一所述warm start lamp 2
×
master mix具体可为new england biolabs
公司的产品，产品目录号为e1700s。
31.上述任一所述方法中，环介导等温扩增的反应体系中外引物f3和外引物b3的浓度具体可为0.2μm，内引物fip和内引物bip的浓度具体可为0.8μm。
32.上述任一所述方法中，环介导等温扩增反应条件可为：63-67℃(如63-65℃、65-67℃、63℃、65℃或67℃)恒温1h。
33.本发明还保护上述任一所述引物组在鉴定待测书虱是否为或疑似为无色书虱中的应用。
34.本发明还保护上述任一所述引物组在检测待测样本中是否含有或疑似含有无色书虱中的应用。
35.上述任一所述待测书虱具体可为待测书虱的卵、若虫和/或成虫。
36.本发明基于环介导等温扩增技术，建立无色书虱的快速鉴定方法，针对无色书虱的coi基因全长序列中特异区段的6个区域，设计4条特异性引物，通过对反应体系和反应条件的优化，根据hnb结合mg
2
呈紫罗兰色、随lamp反应进行失去mg
2
呈天蓝色的特点，建立lamp分子鉴定技术及可视化检测方法，有效避免了开盖操作带来的检测环节中可能产生的样品阳性污染。本发明针对无色书虱鉴定的环介导等温扩增技术可以实现对无色书虱的卵、若虫/成虫个体的快速鉴定，具有快速、高效、特异性强、灵敏度高、成本低、操作简便、无需特殊仪器的优点，适用于现场，易于在基层推广，能够为无色书虱的防控提供可靠技术依据，对储粮产业及商品粮食贸易具有重要意义。
附图说明
37.图1为实施例1中步骤一引物组ld1的检测结果。
38.图2为实施例1中步骤一引物组ld2的检测结果。
39.图3为实施例1中步骤一引物组ld3的检测结果。
40.图4为实施例1中步骤一引物组ld4的检测结果。
41.图5为实施例2中步骤二可视化检测结果。
42.图6为实施例3中特异性的部分检测结果。
43.图7为实施例4中灵敏度的部分检测结果。
具体实施方式
44.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
45.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
46.下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
47.以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
48.微量样品基因组dna提取试剂盒为天根公司的产品，产品目录号为dp316。warm start lamp 2
×
master mix为new england biolabs公司的产品，产品目录号为e1700s。
49.下述实施例中涉及的引物组名称、引物名称和核苷酸序列详见表1。
50.表1
[0051][0052][0053]
下述实施例中，供试书虱样品的编号、种名和采集地点信息见表2。所有供试书虱样品在供试前均使用形态学方法进行了鉴定，并进行了若干代纯化饲养。
[0054]
表2
[0055][0056]
实施例1、用于鉴定无色书虱引物组的筛选和用于鉴定无色书虱的试剂盒的制备一、用于鉴定无色书虱引物组的筛选
[0057]
1、以无色书虱线粒体基因组中的coi基因全长序列(核苷酸序列如seq id no.5所示)作为靶基因，设计并合成用于鉴定无色书虱的引物组ld1、引物组ld2、引物组ld3和引物组ld4。各个引物组的引物序列详见表1。
[0058]
2、采用微量样品基因组dna提取试剂盒提取书虱样品的基因组dna，得到书虱样品的基因组dna。
[0059]
书虱样品为表2中编号为1的无色书虱、编号为6的嗜卷书虱、编号为7的小眼书虱、编号为8的嗜虫书虱或编号为9的啮书虱。
[0060]
3、以书虱样品的基因组dna为模板，采用引物组ld1、引物组ld2、引物组ld3或引物组ld4进行环介导等温扩增，得到扩增产物。
[0061]
反应体系为25μl，由12.5μl warm start lamp 2
×
master mix、1μl模板、引物混合物和无菌超纯水组成。引物混合物即引物组中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物f3和外引物b3的浓度为0.2μm，内引物fip和内引物bip的浓度为0.8μm。
[0062]
反应条件：65℃1h。
[0063]
4、将扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。
[0064]
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为阴性对照。
[0065]
引物组ld1的检测结果见图1(m为dna marker，1为无色书虱，2为嗜虫书虱，3为嗜卷书虱，4为小眼书虱，5为啮书虱，n为阴性对照)。
[0066]
引物组ld2的检测结果见图2(m为dna marker，1为无色书虱，2为嗜虫书虱，3为嗜卷书虱，4为小眼书虱，5为啮书虱，n为阴性对照)。
[0067]
引物组ld3的检测结果见图3(m为dna marker，1为无色书虱，2为嗜虫书虱，3为嗜卷书虱，4为小眼书虱，5为啮书虱，n为阴性对照)。
[0068]
引物组ld4的检测结果见图4(m为dna marker，1为无色书虱，2为嗜虫书虱，3为嗜卷书虱，4为小眼书虱，5为啮书虱，n为阴性对照)。
[0069]
结果表明，引物组ld1在鉴定无色书虱时呈清晰明亮的典型梯状条带且阴性对照不出现条带，与其它引物组相比，鉴定效果最优。因此，后续采用引物组ld1鉴定无色书虱。
[0070]
二、用于鉴定无色书虱的试剂盒的制备
[0071]
用于鉴定无色书虱的试剂盒由引物组ld1组成。
[0072]
实施例2、采用实施例1制备的试剂盒鉴定待测书虱是否为或疑似为无色书虱
[0073]
一、通过琼脂糖凝胶电泳结果鉴定待测书虱是否为或疑似为无色书虱
[0074]
1、采用微量样品基因组dna提取试剂盒提取待测书虱的基因组dna，得到待测书虱的基因组dna。
[0075]
2、以待测书虱的基因组dna为模板，采用引物组ld1进行环介导等温扩增，得到扩增产物。
[0076]
反应体系为25μl，由12.5μl warm start lamp 2
×
master mix、1μl模板、引物混合物和无菌超纯水组成。引物混合物即引物组ld1中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物f3和外引物b3的浓度为0.2μm，内引物fip和内引物bip的浓度为0.8μm。
[0077]
反应条件：65℃1h。
[0078]
3、将扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。
[0079]
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为阴性对照。
[0080]
按照上述方法，将模板替换为无色书虱的基因组dna，其它步骤均不变，作为阳性对照。
[0081]
4、根据电泳结果进行如下判断：
[0082]
阳性对照呈典型梯状条带且阴性对照没有条带时，如果待测书虱呈典型梯状条带，则待测书虱为或疑似为无色书虱；如果待测书虱不呈典型梯状条带(如没有条带)，则待
测书虱不为或疑似不为无色书虱；
[0083]
阳性对照不呈典型梯状条带或阴性对照有条带时，待测书虱的鉴定结果无效。
[0084]
二、可视化鉴定待测书虱是否为或疑似为无色书虱
[0085]
1、采用微量样品基因组dna提取试剂盒提取待测书虱的基因组dna，得到待测书虱的基因组dna。
[0086]
2、以待测书虱的基因组dna为模板，采用引物组ld1进行环介导等温扩增。
[0087]
反应体系为25μl，由12.5μl warm start lamp 2
×
master mix、1μl模板、1μl hnb(3mmol/l)、引物混合物和无菌超纯水组成。引物混合物即引物组ld1中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物f3和外引物b3的浓度为0.2μm，内引物fip和内引物bip的浓度为0.8μm。
[0088]
反应条件：65℃1h。
[0089]
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为阴性对照。
[0090]
按照上述方法，将模板替换为无色书虱的基因组dna，其它步骤均不变，作为阳性对照。
[0091]
3、完成步骤2后，肉眼观察反应体系的颜色，然后进行如下判断：
[0092]
阳性对照呈天蓝色且阴性对照呈紫罗兰色时，如果待测书虱呈天蓝色，则待测书虱为或疑似为无色书虱；如果待测书虱呈紫罗兰色，则待测书虱不为或疑似不为无色书虱；
[0093]
阳性对照不呈天蓝色或阴性对照不呈紫罗兰色时，待测书虱的鉴定结果无效。
[0094]
本发明的发明人采用步骤二的方法鉴定待测书虱是否为或疑似为无色书虱。待测书虱分别为表2中编号为1的无色书虱、编号为2的无色书虱、编号为3的无色书虱、编号为4的无色书虱、编号为5的无色书虱、编号为6的嗜虫书虱、编号为7的小眼书虱。
[0095]
部分结果见图5(1-7依次为编号为1的无色书虱、编号为2的无色书虱、编号为3的无色书虱、编号为4的无色书虱、编号为5的无色书虱、编号为6的嗜虫书虱、编号为7的小眼书虱，n为阴性对照)。结果表明，不同地理种群的无色书虱的反应体系均呈天蓝色，嗜虫书虱和小眼书虱的反应体系均呈紫罗兰色。
[0096]
实施例3、特异性实验
[0097]
待测书虱1为编号为1的无色书虱。
[0098]
待测书虱2为编号为2的无色书虱。
[0099]
待测书虱3为编号为3的无色书虱。
[0100]
待测书虱4为编号为4的无色书虱。
[0101]
待测书虱5为编号为5的无色书虱。
[0102]
待测书虱6为编号为6的嗜卷书虱。
[0103]
待测书虱7为编号为7的小眼书虱。
[0104]
待测书虱8为编号为8的嗜虫书虱。
[0105]
待测书虱9为编号为9的啮书虱。
[0106]
待测书虱10为编号为10的暗褐书虱。
[0107]
待测书虱11为编号为11的皮氏书虱。
[0108]
待测书虱12为编号为12的红书虱。
[0109]
待测书虱13为编号为13的三色书虱。
[0110]
待测书虱14为编号为14的虚伪书虱。
[0111]
各个待测书虱分别进行如下步骤：
[0112]
1、采用微量样品基因组dna提取试剂盒提取待测书虱的基因组dna。
[0113]
2、以步骤1提取的待测书虱的基因组dna为模板，采用引物组ld1进行环介导等温扩增，得到扩增产物。
[0114]
反应体系为25μl，由12.5μl warm start lamp 2
×
master mix、1μl模板、引物混合物和无菌超纯水组成。引物混合物即引物组ld1中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物f3和外引物b3的浓度为0.2μm，内引物fip和内引物bip的浓度为0.8μm。
[0115]
反应条件：65℃1h。
[0116]
3、将扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。
[0117]
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为阴性对照。
[0118]
按照上述方法，将模板替换为无色书虱的基因组dna，其它步骤均不变，作为阳性对照。
[0119]
部分检测结果见图6(1-14依次为待测书虱1-待测书虱14，n为阴性对照)。结果表明，待测书虱为无色书虱的时候呈典型梯状条带；待测书虱为非无色书虱的时候，没有条带(即不呈典型梯状条带)；阴性对照也没有条带。
[0120]
由此可见，采用引物组ld1鉴定无色书虱具有良好的特异性。
[0121]
实施例4、灵敏度实验
[0122]
1、采用微量样品基因组dna提取试剂盒提取无色书虱的基因组dna。
[0123]
2、取无色书虱的基因组dna，用无菌水进行梯度稀释，得到各个稀释液。
[0124]
3、以步骤2得到的稀释液为模板，采用引物组ld1进行环介导等温扩增，得到扩增产物。
[0125]
反应体系为25μl，由12.5μl warm start lamp 2
×
master mix、1μl稀释液(1μl稀释液中含有无色书虱的基因组dna为10.0ng、1.0ng、1.0
×
10-1
ng、1.0
×
10-2
ng或1.0
×
10-3
ng)、引物混合物和无菌超纯水组成。引物混合物即引物组ld1中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物f3和外引物b3的浓度为0.2μm，内引物fip和内引物bip的浓度为0.8μm。
[0126]
反应条件：65℃1h。
[0127]
4、将扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。
[0128]
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为阴性对照。
[0129]
按照上述方法，将模板替换为无色书虱的基因组dna，其它步骤均不变，作为阳性对照。
[0130]
如果呈典型梯状条带，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果不呈典型梯状条带(如没有条带)，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
[0131]
部分检测结果见图7(1-5的dna模板浓度依次为：10.0ng/μl、1.0ng/μl、1.0
×
10-1
ng/μl、1.0
×
10-2
ng/μl、1.0
×
10-3
ng/μl，n为阴性对照)。结果表明，引物组ld1鉴定无色书虱的灵敏度为1.0
×
10-1
ng/反应体系。
[0132]
由此可见，采用引物组ld1鉴定无色书虱具有较高的灵敏度。