人源化抗叶酸受体1嵌合抗原受体及其用途的制作方法

人源化抗叶酸受体1嵌合抗原受体及其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年4月12日提交的美国临时申请62/832,975、2019年6月19日提交的美国临时申请62/863,330和2019年11月7日提交的美国临时申请62/931,988的优先权。每个公开内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
3.本发明涉及抗叶酸受体1(folr1)嵌合抗原受体(car)、编码car的核酸和表达载体、工程化以表达car的t细胞(car
‑
t)和工程化以表达car的nk细胞(car
‑
nk)。还提供了制备car的方法、制备car
‑
t/car
‑
nk的方法以及使用car
‑
t/car
‑
nk治疗与folr1表达相关的疾病包括癌症的方法。
4.以电子方式递交的序列表参考
5.本技术包含序列表，该序列表作为ascii格式的序列表经由efs
‑
web以电子方式递交，文件名为“065799.21wo1 sequence listing”并且创建日期为2020年3月26日，并且大小为140kb。经由efs
‑
web递交的序列表是本说明书的一部分，并且该序列表全文以引用方式并入本文。


背景技术：

6.抗癌药物的护理标准提供了显著的益处。最近，免疫肿瘤药物诸如抗pd
‑
1mab、抗pd
‑
l1 mab和抗cd3双特异性t细胞衔接物的可用性已经推进了利用和激活患者的免疫系统以对抗各种类型癌症的概念。然而，仍然需要解决应答差、功效不足和/或安全性问题。car
‑
t(嵌合抗原受体
‑
t)细胞疗法涉及对患者自身的免疫细胞诸如t细胞进行遗传工程化，并将它们重定向至癌细胞上的合适细胞表面抗原(mayor等人，immunotherapy.，2016年，第8卷，第491页至第494页)。这种方法已经在患有化学难治性b细胞恶性肿瘤和其他癌症的患者中证明是成功的(pettitt等人，mol ther.，2018年，第26卷，第342页至第353页)。t细胞可被工程化以对一种或多种癌细胞表面靶标/抗原具有特异性，从而识别并杀伤癌细胞。该方法包括用编码嵌合抗原受体(car)的dna或其他遗传物质转导t细胞，该嵌合抗原受体包含胞外抗原特异性结合结构域，诸如单克隆抗体(mab)的一个或多个单链可变片段(scfv)、铰链和跨膜区，以及胞内信号传导结构域(包括一个或多个共刺激结构域和一个或多个激活结构域(kochenderfer等人，nat rev cl in oncol.，2013年，第10卷，第267页至第276页)。表达car的免疫细胞，诸如t细胞和nk细胞，可用于治疗各种疾病，包括液体和实体肿瘤。成功的car
‑
t细胞疗法可特异性识别和破坏靶细胞，并维持随着时间持续和增殖的能力。
7.叶酸受体1(folr1)，也称为叶酸受体α(frα)或叶酸结合蛋白(fbp)，是细胞表面上的糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定膜蛋白，该gpi锚定膜蛋白对叶酸的活性形式5
‑
甲基四氢叶酸(5
‑
mtf)及其衍生物具有高亲和力并将其转运到细胞中(salazar和ratnam，cancer metastasis rev，2007年，第26卷，第141页至第152页)。folr1已经成为肿瘤学靶标，因为它在某些实体肿瘤诸如卵巢癌、肺癌和乳腺癌中过表达(toffoli等人，int j cancer，1997
年，第74卷，第193页至第198页和boogerd等人，oncotarget，2016年，第7卷，第17442页至第17454页)，但在有限的正常人体组织中的表达水平很低(weitman等人，cancer res，1992年，第52卷，第3396页至第3401页)。与该观察一致，迄今为止用靶向folr1的小分子和大分子进行的1期临床试验揭示了良好的药物耐受性(cheung等人，oncotarget，2016年，第7卷，第52553页至第52574页)。因此，folr1是car
‑
t细胞疗法治疗和治愈folr1阳性癌症的理想靶标。


技术实现要素：

8.在一个总的方面，本发明涉及诱导t细胞介导的癌症杀伤的嵌合抗原受体(car)构建体，其中该car构建体包含至少一个特异性结合人叶酸受体1(folr1)的抗原结合结构域、铰链区、跨膜区和胞内信号传导结构域。
9.提供了包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列的分离的多核苷酸。car可包含(a)胞外结构域，该胞外结构域包含至少一个特异性结合叶酸受体1(folr1)的抗原结合结构域；(b)铰链区；(c)跨膜区；和(d)胞内信号传导结构域。
10.在某些实施方案中，该抗原结合结构域包含分别具有以下多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3：
11.(1)seq id no:17、18、19、41、42和43；
12.(2)seq id no:20、21、22、44、45和46；
13.(3)seq id no:23、24、25、47、48和49；
14.(4)seq id no:26、27、28、50、51和52；
15.(5)seq id no:29、30、31、53、54和55；
16.(6)seq id no:32、33、34、56、57和58；
17.(7)seq id no:35、36、37、59、60和61；或
18.(8)seq id no:38、39、40、62、63和64；
19.其中该抗原结合结构域特异性结合folr1，优选地为人folr1。
20.在某些实施方案中，该抗原结合结构域包含分别具有以下多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3：
21.(1)seq id no:65、66、67、89、90和91；
22.(2)seq id no:68、69、70、92、93和94；
23.(3)seq id no:71、72、73、95、96和97；
24.(4)seq id no:74、75、76、98、99和100；
25.(5)seq id no:77、78、79、101、102和103；
26.(6)seq id no:80、81、82、104、105和106；
27.(7)seq id no:83、84、85、107、108和109；或
28.(8)seq id no:86、87、88、110、111和112；
29.其中该抗原结合结构域特异性结合folr1，优选地为人folr1。
30.在某些实施方案中，该抗原结合结构域包含具有与seq id no:1、3、5、7、9、11、13或15有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列的重链可变区或具有与seq id no:2、4、6、8、10、12、14或16有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％
或至少99％同一性的多肽序列的轻链可变区。
31.在某些实施方案中，该抗原结合结构域包含：
32.(1)具有seq id no:1的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:2的多肽序列的轻链可变区；
33.(2)具有seq id no:3的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:4的多肽序列的轻链可变区；
34.(3)具有seq id no:5的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:6的多肽序列的轻链可变区；
35.(4)具有seq id no:7的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:8的多肽序列的轻链可变区；
36.(5)具有seq id no:9的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:10的多肽序列的轻链可变区；
37.(6)具有seq id no:11的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:12的多肽序列的轻链可变区；
38.(7)具有seq id no:13的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:14的多肽序列的轻链可变区；或
39.(8)具有seq id no:15的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:16的多肽序列的轻链可变区。
40.在某些实施方案中，该抗原结合结构域是人源化的，并且包含具有与seq id no:113、114、115、116、119、120、124、125、128、129、130、136、137、138、142、143、144、148、149、150、154、155、156或171
‑
184有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列的重链可变区或具有与seq id no:117、118、121、122、123、126、127、131、132、133、134、139、140、141、145、146、147、151、152、153、157、158或185
‑
198有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列的轻链可变区。
41.在某些实施方案中，该抗原结合结构域是人源化的，并且包含：
42.(1)具有seq id no:113的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
43.(2)具有seq id no:113的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
44.(3)具有seq id no:114的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
45.(4)具有seq id no:114的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
46.(5)具有seq id no:115的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
47.(6)具有seq id no:115的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
48.(7)具有seq id no:116的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
49.(8)具有seq id no:116的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
50.(9)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:121的多肽序列的轻链可变区；
51.(10)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:122的多肽序列的轻链可变区；
52.(11)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:123的多肽序列的轻链可变区；
53.(12)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:121的多肽序列的轻链可变区；
54.(13)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:122的多肽序列的轻链可变区；
55.(14)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:123的多肽序列的轻链可变区；
56.(15)具有seq id no:124的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:126的多肽序列的轻链可变区；
57.(16)具有seq id no:124的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:127的多肽序列的轻链可变区；
58.(17)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽序列的轻链可变区；
59.(18)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽序列的轻链可变区；
60.(19)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽序列的轻链可变区；
61.(20)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
62.(21)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽序列的轻链可变区；
63.(22)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽序列的轻链可变区；
64.(23)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽序列的轻链可变区；
65.(24)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
66.(25)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽序列的轻链可变区；
67.(26)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽序列的轻链可变区；
68.(27)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽
序列的轻链可变区；
69.(28)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
70.(29)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽序列的轻链可变区；
71.(30)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽序列的轻链可变区；
72.(31)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
73.(32)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽序列的轻链可变区；
74.(33)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽序列的轻链可变区；
75.(34)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
76.(35)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽序列的轻链可变区；
77.(36)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽序列的轻链可变区；
78.(37)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
79.(38)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽序列的轻链可变区；
80.(39)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
81.(40)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
82.(41)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽序列的轻链可变区；
83.(42)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
84.(43)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
85.(44)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽序列的轻链可变区；
86.(45)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
87.(46)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
88.(47)具有seq id no:148的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:151的多肽序列的轻链可变区；
89.(48)具有seq id no:150的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:153的多肽序列的轻链可变区；
90.(49)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:185的多肽序列的轻链可变区；
91.(50)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:186的多肽序列的轻链可变区；
92.(51)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:187的多肽序列的轻链可变区；
93.(52)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:185的多肽序列的轻链可变区；
94.(53)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:186的多肽序列的轻链可变区；
95.(54)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:187的多肽序列的轻链可变区；
96.(55)具有seq id no:182的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:190的多肽序列的轻链可变区；
97.(56)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:195的多肽序列的轻链可变区；
98.(57)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:196的多肽序列的轻链可变区；
99.(58)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:197的多肽序列的轻链可变区；
100.(59)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:198的多肽序列的轻链可变区；
101.(60)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:195的多肽序列的轻链可变区；
102.(61)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:196的多肽序列的轻链可变区；
103.(62)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:197的多肽序列的轻链可变区；或
104.(63)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:198的多肽序列的轻链可变区。
105.在某些实施方案中，该抗原结合结构域是特异性结合folr1、优选地为人folr1的单链可变片段(scfv)。
106.在某些实施方案中，该抗原结合结构域是特异性结合folr1、优选地为人folr1的人源化单链可变片段(scfv)。在某些实施方案中，该人源化单链可变片段(scfv)包含与seq id no:159
‑
170中的任一者有至少95％同一性的多肽序列。
107.在某些实施方案中，该嵌合抗原受体(car)包含一个或多个抗原结合结构域。
108.在某些实施方案中，该胞内信号传导结构域包含一个或多个共刺激结构域和一个或多个激活结构域。
109.还提供了由本发明的分离的多核苷酸编码的嵌合抗原受体(car)。
110.还提供了包含分离的多核苷酸的载体，该分离的多核苷酸包含编码本发明的car的核酸。
111.还提供了包含本发明的载体的宿主细胞。
112.在某些实施方案中，宿主细胞是t细胞，优选地为人t细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是nk细胞，优选地为人nk细胞。t细胞或nk细胞可例如被工程化以表达本发明的car，以治疗疾病诸如癌症。
113.还提供了制备表达本发明的嵌合抗原受体(car)的宿主细胞的方法。该方法包括用包含编码本发明的car的分离的核酸的载体转导t细胞或nk细胞。
114.还提供了产生本发明的car
‑
t细胞或car
‑
nk细胞的方法。该方法包括在产生嵌合抗原受体(car)
‑
t细胞或car
‑
nk细胞的条件下培养包含分离的多核苷酸的t细胞或nk细胞，以及回收该car
‑
t细胞或car
‑
nk细胞，该分离的多核苷酸包含编码本发明的car的核酸。
115.还提供了生成包含本发明的嵌合抗原受体(car)的rna工程化细胞群的方法。该方法包括使细胞与包含编码本发明的嵌合抗原受体(car)的核酸的分离的多核苷酸接触，其中该分离的多核苷酸是体外转录的rna或合成rna。
116.还提供了治疗对其有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本发明的car
‑
t细胞和/或car
‑
nk细胞。癌症可以是任何液体或固体癌症，例如，其可选自但不限于肺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿道上皮癌、转移性黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤和其他实体肿瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性淋巴细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、多发性骨髓瘤(mm)、急性髓性白血病(aml)和其他液体肿瘤。
117.在某些实施方案中，治疗对其有需要的受试者的癌症的方法还包括向对其有需要的受试者施用增加表达car分子的细胞的功效的药剂。
118.在某些实施方案中，治疗对其有需要的受试者的癌症的方法还包括向对其有需要的受试者施用改善与施用表达car分子的细胞相关的一种或多种副作用的药剂。
119.在某些实施方案中，治疗对其有需要的受试者的癌症的方法还包括向对其有需要的受试者施用治疗与folr1相关的疾病的药剂。
120.还提供了人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含具有与seq id no:113、114、115、116、119、120、124、125、128、129、130、136、137、138、142、143、144、148、149、150、154、155、156或171
‑
184中的任一者有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区或具有与seq id no:117、118、121、122、123、126、127、131、132、133、134、139、140、141、145、146、147、151、152、153、157、158或185
‑
198有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。
121.在某些实施方案中，该人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
122.(1)具有seq id no:113的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
123.(2)具有seq id no:113的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
124.(3)具有seq id no:114的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
125.(4)具有seq id no:114的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
126.(5)具有seq id no:115的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
127.(6)具有seq id no:115的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
128.(7)具有seq id no:116的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
129.(8)具有seq id no:116的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
130.(9)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:121的多肽序列的轻链可变区；
131.(10)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:122的多肽序列的轻链可变区；
132.(11)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:123的多肽序列的轻链可变区；
133.(12)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:121的多肽序列的轻链可变区；
134.(13)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:122的多肽序列的轻链可变区；
135.(14)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:123的多肽序列的轻链可变区；
136.(15)具有seq id no:124的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:126的多肽序列的轻链可变区；
137.(16)具有seq id no:124的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:127的多肽序列的轻链可变区；
138.(17)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽序列的轻链可变区；
139.(18)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽序列的轻链可变区；
140.(19)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽序列的轻链可变区；
141.(20)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
142.(21)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽
序列的轻链可变区；
143.(22)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽序列的轻链可变区；
144.(23)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽序列的轻链可变区；
145.(24)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
146.(25)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽序列的轻链可变区；
147.(26)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽序列的轻链可变区；
148.(27)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽序列的轻链可变区；
149.(28)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
150.(29)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽序列的轻链可变区；
151.(30)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽序列的轻链可变区；
152.(31)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
153.(32)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽序列的轻链可变区；
154.(33)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽序列的轻链可变区；
155.(34)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
156.(35)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽序列的轻链可变区；
157.(36)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽序列的轻链可变区；
158.(37)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
159.(38)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽序列的轻链可变区；
160.(39)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
161.(40)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
162.(41)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽序列的轻链可变区；
163.(42)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
164.(43)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
165.(44)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽序列的轻链可变区；
166.(45)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
167.(46)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
168.(47)具有seq id no:148的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:151的多肽序列的轻链可变区；
169.(48)具有seq id no:150的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:153的多肽序列的轻链可变区；
170.(49)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:185的多肽序列的轻链可变区；
171.(50)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:186的多肽序列的轻链可变区；
172.(51)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:187的多肽序列的轻链可变区；
173.(52)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:185的多肽序列的轻链可变区；
174.(53)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:186的多肽序列的轻链可变区；
175.(54)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:187的多肽序列的轻链可变区；
176.(55)具有seq id no:182的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:190的多肽序列的轻链可变区；
177.(56)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:195的多肽序列的轻链可变区；
178.(57)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:196的多肽序列的轻链可变区；
179.(58)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:197的多肽序列的轻链可变区；
180.(59)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:198的多肽序列的轻链可变区；
181.(60)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:195的多肽
序列的轻链可变区；
182.(61)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:196的多肽序列的轻链可变区；
183.(62)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:197的多肽序列的轻链可变区；或
184.(63)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:198的多肽序列的轻链可变区。
185.在某些实施方案中，该人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段能够结合folr1、诱导效应子介导的肿瘤细胞裂解、介导缀合的药物的募集以及/或者与具有癌症杀伤作用的另一种单克隆抗体或抗原结合片段形成双特异性抗体。
186.还提供了编码本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
187.还提供了包含编码本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸的载体。
188.还提供了包含载体的宿主细胞，该载体包含编码本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
189.还提供了包含本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体的药物组合物。
190.还提供了靶向对其有需要的受试者的癌细胞表面上的folr1的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用包含本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
191.还提供了治疗对其有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用包含本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。癌症可以是任何液体或固体癌症，例如，其可选自但不限于肺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿道上皮癌、转移性黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤和其他实体肿瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性淋巴细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、多发性骨髓瘤(mm)、急性髓性白血病(aml)和其他液体肿瘤。
192.还提供了产生本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在产生单克隆抗体或抗原结合片段的条件下培养包含编码该单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以及从该细胞或培养物中回收该抗体或抗原结合片段。
193.还提供了产生包含本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，该方法包括将该单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得该药物组合物。
附图说明
194.当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及以下对本技术的优选实施方案的详细描述。然而，应当理解，本技术不限于附图中所示的精确实施方案。
195.图1a至图1l示出了通过elisa测定的人源化mab与固定化重组人folr1蛋白的结
of)”或其变型诸如“由
…
组成(consist of或consisting of)”表示包括任何列举的整体或整体的组，但不能将附加的整体或整体组添加到指定的方法、结构或组合物中。
207.如本文所用，如在整个说明书和权利要求书中所用的术语“基本上由
…
组成(consists essentially of)”或其变型诸如“基本上由
…
组成(consist essentially of或consisting essentially of)”表示包括任何列举的整体或整体的组，并且任选地包括不会实质上改变指定方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何列举的整体或整体的组。参见m.p.e.p.
§
2111.03。
208.如本文所用，“受试者”意指任何动物，优选地为哺乳动物，最优选地为人。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等，更优选地为人。
209.词语“右”、“左”、“下”和“上”表示所参考的附图中的方向。
210.还应当理解，当提及优选发明的部件的尺寸或特性时，本文使用的“约”、“大约”、“大致”、“基本上”和类似的术语表示所描述的尺寸/特性不是严格的边界或参数，并且不排除在功能上相同或相似的微小变化，如本领域的普通技术人员所理解的。至少，包括数值参数的此类参考将包括使用本领域所接受的数学和工业原理(例如，舍入、测量或其他系统误差、制造公差等)不会改变最低有效数字的变化。
211.在两个或更多个核酸或多肽序列(例如，包含对folr1具有特异性的抗原结合结构域和编码它们的多核苷酸的嵌合抗原受体(car)、folr1多肽和编码它们的folr1多核苷酸)的上下文中，术语“同一性”或“同一性百分比”是指当使用以下序列比较算法之一或通过目视检查进行比较和比对以获得最大对应时，两个或更多个序列或子序列相同或具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同。
212.对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
213.用于比较的序列的最佳比对可例如通过smith&waterman，adv.appl.math.，1981年，第2卷，第482页的局部同源性算法、通过needleman&wunsch，j.mol.biol.，1970年，第48卷，第443页的同源性比对算法、通过pearson&lipman，proc.nat'l.acad.sci.usa，1988年，第85卷，第2444页的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实现(威斯康星州麦迪逊市科学大道575号，遗传学计算机小组，威斯康星遗传学软件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta)或通过目视检查(一般参见《现代分子生物学实验指南(current protocols in molecular biology)》，f.m.ausubel等人编辑，《现代实验指南(current protocols)》，格林出版联合公司和约翰
·
威利父子公司的合资企业，1995年增刊(ausubel))进行。
214.适于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的示例是blast和blast2.0算法，这些算法分别在altschul等人，j.mol.biol.，1990年，第215卷，第403页至第410页和altschul等人，nucleic acids res.，1997年，第25卷，第3389页至第3402页中有所描述。进行blast分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心公开获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为w的短字来鉴定高得分序列对(hsp)，当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，该短字匹配或满足一些正值阈值得分t。t被称为邻近字得分阈值(altschul等
人，同上)。这些初始邻近字命中用作启动搜索的种子以寻找含有它们的更长hsp。然后，只要累积比对得分可增加，字命中就沿每个序列在两个方向上扩展。
215.对于核苷酸序列，使用参数m(一对匹配残基的奖励得分；始终＞0)和n(错配残基的罚分；始终＜0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵计算累积得分。当出现以下情况时，停止字命中在每个方向上的扩展：累积比对得分从其最大获得值下降数量x；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或者到达任一序列的末端。blast算法参数w、t和x决定了比对的灵敏度和速度。blastn程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(w)为11，期望值(e)为10，m＝5，n＝
‑
4，以及两条链的比较。对于氨基酸序列，blastp程序默认使用字长(w)为3、期望值(e)为10和blosum62得分矩阵(参见henikoff&henikoff，proc.nat'l.acad.sci.usa，1989年，第89卷，第10915页)。
216.除了计算序列同一性百分比之外，blast算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见，例如，karlin&altschul，proc.nat'l.acad.sci.usa，1993年，第90卷，第5873页至第5787页)。blast算法提供的一种相似性量度是最小和概率(p(n))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率小于约0.1，更优选地小于约0.01，最优选地小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。
217.两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是由第一核酸编码的多肽与由第二核酸编码的多肽发生免疫学交叉反应，如下所述。因此，多肽通常与第二多肽基本上相同，例如，在这两种肽仅因保守取代而不同的情况下。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。
218.如本文所用，术语“分离的”意指生物组分(诸如核酸、肽或蛋白质)已经与该组分天然存在的生物体的其他生物组分即其他染色体和染色体外dna和rna以及蛋白质基本上分离、分开产生或从其中纯化出来。因此，已经“分离”的核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。“分离的”核酸、肽和蛋白质可以是组合物的一部分，并且如果该组合物不是该核酸、肽或蛋白质的自身环境的一部分，则仍然可被分离。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。
219.如本文所用，术语“多核苷酸”，同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”，是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的rna或dna或修饰的rna或dna。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链dna，单链区和双链区混合的dna，单链和双链rna，单链区和双链区混合的rna，包含可以是单链或更典型地是双链或者单链区和双链区混合的dna和rna的杂合分子。此外，“多核苷酸”是指包含rna或dna或rna和dna两者的三链区。术语“多核苷酸”还包括含有一个或多个修饰的碱基的dna或rna，以及为了稳定性或其他原因主链被修饰的dna或rna。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基诸如肌苷。可对dna和rna进行各种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常天然存在的多核苷酸的化学、酶促或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的dna和rna的化学形式。“多核苷酸”还包括相对短的核酸链，通常称为寡核苷酸。
220.如本文所用，术语“载体”是复制子，其中可以可操作地插入另一个核酸片段以便引起该片段的复制或表达。
221.如本文所用，术语“宿主细胞”是指包含本发明的核酸分子的细胞。“宿主细胞”可
以是任何类型的细胞，例如，原代细胞、培养细胞或来自细胞系的细胞。在一个实施方案中，“宿主细胞”是用本发明的核酸分子转染或转导的细胞。在另一个实施方案中，“宿主细胞”是此类转染或转导的细胞的子代或潜在子代。细胞的子代可能与亲代细胞相同，也可能不同，例如，由于可能发生在随后的世代中的突变或环境影响、或核酸分子整合到宿主细胞基因组中。
222.如本文所用，术语“表达”是指基因产物的生物合成。该术语涵盖基因到rna的转录。该术语还涵盖rna到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。表达的car可处于宿主细胞的细胞质内，处于胞外环境诸如细胞培养物的生长培养基中，或锚定至细胞膜上。
223.如本文所用，术语“免疫细胞”或“免疫效应细胞”是指参与免疫应答例如促进免疫效应应答的细胞。免疫细胞的示例包括t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、肥大细胞和骨髓来源的吞噬细胞。根据具体实施方案，工程化免疫细胞是t细胞，并且被称为car
‑
t细胞，因为它们被工程化以表达本发明的car。
224.如本文所用，术语“工程化免疫细胞”是指已通过向细胞的总遗传物质中添加dna或rna形式的额外遗传物质而被遗传修饰的免疫细胞，也称为免疫效应细胞。根据本文的实施方案，工程化免疫细胞已经被遗传修饰以表达根据本发明的car构建体。
225.嵌合抗原受体(car)
226.如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(car)是指包含至少特异性结合抗原或靶标的胞外结构域、跨膜结构域和胞内t细胞受体激活信号传导结构域的重组多肽。car的胞外结构域与靶细胞表面上的靶抗原的接合导致car的聚簇，并向含car的细胞递送激活刺激。car重定向免疫效应细胞的特异性并触发增殖、细胞因子产生、吞噬作用和/或产生可以主要组织相容性(mhc)非依赖性方式介导靶抗原表达细胞的细胞死亡的分子。
227.在一个方面，car包含抗原结合结构域、铰链区、共刺激结构域、激活结构域和跨膜区。在一个方面，car包含抗原结合结构域、铰链区、两个共刺激结构域、激活结构域和跨膜区。在一个方面，car包含两个抗原结合结构域、铰链区、共刺激结构域、激活结构域和跨膜区。在一个方面，car包含两个抗原结合结构域、铰链区、两个共刺激结构域、激活结构域和跨膜区。
228.如本文所用，术语“信号肽”是指新生car蛋白的氨基末端(n
‑
末端)处的前导序列，其共翻译或翻译后将新生蛋白引导至内质网并随后进行表面表达。
229.如本文所用，术语“胞外抗原结合结构域”、“胞外结构域”或“胞外配体结合结构域”是指car的位于细胞膜外并且能够结合抗原、靶标或配体的部分。
230.如本文所用，术语“铰链区”是指car的连接car蛋白的两个相邻结构域例如胞外结构域和跨膜结构域的部分。
231.如本文所用，术语“跨膜结构域”是指car的延伸跨过细胞膜并将car锚定至细胞膜的部分。它有时被称为“跨膜区”。
232.共刺激结构域
233.如本文所用，嵌合抗原受体可掺入共刺激(信号传导)结构域以增加其效力。共刺激(信号传导)结构域可源自共刺激分子。共刺激分子是除有效免疫应答所需的抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激结构域可源自共刺激分子，该共刺激分子可包括但不
限于cd28、cd28t、ox40、4
‑
1bb/cd137、cd2、cd3(α、β、δ、ε、γ、ζ)、cd4、cd5、cd7、cd9、cd16、cd22、cd27、cd30、cd33、cd37、cd40、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、程序性死亡受体
‑
1(pd
‑
1)、诱导型t细胞共刺激物(icos)、淋巴细胞功能相关抗原
‑
1(lfa
‑
1；cd11a和cd18)、cd247、cd276(b7
‑
h3)、light(肿瘤坏死因子超家族成员14；tnfsf14)、nkg2c、igα(cd79a)、dap10、fcγ受体、mhc类i分子、tnfr、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子、btla、toll配体受体、icam
‑
1、cds、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd8α、cd8β、il
‑
2rβ、il
‑
2rγ、il
‑
7rα、itga4、vla1、cd49a、ia4、cd49d、itga6、vla
‑
6、cd49f、itgad、itgae、cd103、itgal、cd1a、cd1b、cd1c、cd1d、itgam、itgax、itgb1、cd29、itgb2(cd18)、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd 160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb
‑
a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo
‑
3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp
‑
76、pag/cbp、cd19a、cd83配体、细胞因子受体、激活nk细胞受体或它们的片段或任何组合。
234.激活结构域
235.如本文所用，嵌合抗原受体可包含激活结构域。激活结构域可包括但不限于cd3。cd3是天然t细胞上t细胞受体的要素，并已经显示是car中重要的胞内激活要素。在优选实施方案中，cd3是cd3ζ。
236.铰链区
237.如本文所述，嵌合抗原受体可包含铰链区。这是胞外结构域的一部分，有时被称为“间隔”区。根据本发明可使用多种铰链，包括如上所述的共刺激分子、免疫球蛋白(ig)序列或其他合适的分子，以实现与靶细胞的期望特定距离。在一些实施方案中，整个胞外区包含铰链区。
238.跨膜区
239.如本文所用，嵌合抗原受体(car)可包含跨膜区/结构域。car可被设计为包含与car的胞外结构域融合的跨膜结构域。它可类似地融合到car的胞内结构域。在一个实施方案中，使用与car中的结构域中的一个结构域天然相关的跨膜结构域。在一些情况下，可通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。跨膜结构域可源自天然来源或合成来源。在来源是天然的情况下，该结构域可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白质。本发明中具体使用的跨膜区可源自(即包含或工程化自)但不限于cd28、cd28t、ox40、4
‑
1bb/cd137、cd2、cd3(α、β、δ、ε、γ、ζ)、cd4、cd5、cd7、cd9、cd16、cd22、cd27、cd30、cd33、cd37、cd40、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、程序性死亡受体
‑
1(pd
‑
1)、诱导型t细胞共刺激物(icos)、淋巴细胞功能相关抗原
‑
1(lfa
‑
1；cd11a和cd18)、cd247、cd276(b7
‑
h3)、light(肿瘤坏死因子超家族成员14；tnfsf14)、nkg2c、igα(cd79a)、dap10、fcγ受体、mhc类i分子、tnfr、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子、btla、toll配体受体、icam
‑
1、cds、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd8α、cd8β、il
‑
2rβ、il
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2rγ、il
‑
7rα、itga4、vla1、cd49a、ia4、cd49d、itga6、vla
‑
6、cd49f、itgad、itgae、cd103、itgal、cd1a、cd1b、cd1c、cd1d、itgam、itgax、itgb1、cd29、itgb2(cd18)、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、
2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd 160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb
‑
a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo
‑
3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp
‑
76、pag/cbp、cd19a、cd83配体、细胞因子受体、激活nk细胞受体、免疫球蛋白蛋白质或它们的片段或任何组合。
240.免疫细胞
241.根据具体方面，本发明提供了作为免疫细胞的细胞，其包含分离的多核苷酸或包含分离的多核苷酸的载体，该分离的多核苷酸包含本文提供的编码car的核苷酸序列。包含本发明的分离的多核苷酸和/或载体的免疫细胞可被称为“工程化免疫细胞”。优选地，工程化免疫细胞源自人(在被制成重组之前是人来源的)。
242.例如，工程化免疫细胞可以是淋巴谱系的细胞。淋巴谱系的细胞的非限制性示例可包括t细胞和自然杀伤(nk)细胞。t细胞表达t细胞受体(tcr)，其中大多数细胞表达γ和δ链，并且较小的群表达γ和δ链。用作本发明的工程化免疫细胞的t细胞可以是cd4

或cd8

，并且可包括但不限于t辅助细胞(cd4

)、细胞毒性t细胞(也称为细胞毒性t淋巴细胞，ctl；cd8

细胞)和记忆t细胞，包括中枢记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞和效应记忆t细胞、自然杀伤t细胞、粘膜相关的不变t细胞和γδt细胞。其他示例性免疫细胞包括但不限于巨噬细胞、抗原呈递细胞(apc)或表达细胞介导的免疫应答的抑制剂例如免疫检查点抑制剂途径受体(例如，pd
‑
1)的任何免疫细胞。可根据本发明使用的免疫细胞的前体细胞包括造血干细胞和/或祖细胞。造血干细胞和/或祖细胞可通过本领域已知的方法源自骨髓、脐带血、细胞因子动员后的成人外周血等。免疫细胞被工程化以重组表达本发明的car。
243.免疫细胞及其前体细胞可通过本领域已知的方法分离，包括商业上可获得的方法(参见例如，rowland jones等人，《淋巴细胞：实用方法(lymphocytes:a practical approach)》，牛津大学出版社，纽约，1999年)。免疫细胞或其前体的来源包括但不限于外周血、脐带血、骨髓或其他造血细胞来源。可采用各种技术来分离细胞，以分离或富集期望的免疫细胞。例如，负向选择方法可用于去除不是期望的免疫细胞的细胞。另外，正向选择方法可用于分离或富集期望的免疫细胞或其前体，或可采用正向选择方法和负向选择方法的组合。如果要分离特定类型的细胞，例如特定的t细胞，则可使用各种细胞表面标记或标记的组合(例如，cd3、cd4、cd8、cd34)来分离细胞。
244.免疫细胞或其前体细胞对于在本发明的治疗方法中施用它们的受试者可以是自体的或非自体的。从待施用重组表达car的工程化免疫细胞的受试者中分离自体细胞。任选地，细胞可通过白细胞分离法获得，其中从抽取的血液中选择性地去除白细胞，制成重组体，然后再转移到供体中。另选地，可使用来自非受试者的非自体供体的同种异体细胞。在非自体供体的情况下，对细胞进行分型并与人白细胞抗原(hla)匹配以确定适当的相容性水平。对于自体细胞和非自体细胞，细胞可任选地被冷冻保存直到准备使用。
245.用于分离可用于重组表达本发明的car的免疫细胞的各种方法先前已经有所描述，并且可以使用，包括但不限于使用外周供体淋巴细胞(sadelain等人，nat.rev.cancer，2003年，第3卷，第35页至第45页；morgan等人，science，2006年，第314卷，第126页至第129页)、使用源自肿瘤活检中肿瘤浸润淋巴细胞(til)的淋巴细胞培养物(panelli等人，j.immunol.，2000年，第164卷，第495页至第504页；panelli等人，j.immunol.，2000年，第164卷，第4382页至第4392页)以及使用采用人工抗原呈递细胞(aapc)或树突细胞选择性地
体外扩增的抗原特异性外周血白细胞(dupont等人，cancer res，2005年，第65卷，第5417页至第5427页；papanicolaou等人，blood，2003年，第102卷，第2498页至第2505页)。在使用干细胞的情况下，细胞可通过本领域熟知的方法分离(参见例如，klug等人，《造血干细胞实验指南(hematopoietic stem cell protocols)》，瑚玛娜出版社，纽约，2002年；freshney等人，《人干细胞培养(culture of human stem cells)》，约翰
·
威利父子公司，2007年)。
246.根据具体实施方案，制备工程化免疫细胞的方法包括转染或转导从个体分离的免疫效应细胞，使得免疫效应细胞表达根据本发明实施方案的一种或多种car。制备用于免疫疗法的免疫细胞的方法在例如wo2014/130635、wo2013/176916和wo2013/176915中所述，这些文献以引用方式并入本文。可用于制备工程化免疫细胞的各个步骤在例如wo2014/039523、wo2014/184741、wo2014/191128、wo2014/184744和wo2014/184143中公开，这些文献以引用方式并入本文。
247.在一个具体实施方案中，免疫效应细胞，诸如t细胞，用本发明的car进行遗传修饰(例如，用包含编码car的核酸的病毒载体转导)，然后在体外激活和扩增。在各种实施方案中，可在表达car的遗传修饰之前或之后，使用例如us6352694、us6534055、us6905680、us6692964、us5858358、us6887466、us6905681、us7144575、us7067318、us7172869、us7232566、us7175843、us5883223、us6905874、us6797514、us6867041、us2006/121005中所述的方法激活和扩增t细胞，这些文献以引用方式并入本文。t细胞可在体外或体内扩增。通常，本发明的t细胞可通过与表面接触而扩增，该表面附着有刺激cd3/tcr复合物相关信号的药剂和刺激t细胞表面上的共刺激分子的配体。作为非限制性示例，t细胞群可如本文所述进行刺激，诸如通过与抗cd3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗cd3抗体接触，或通过与结合钙离子载体的蛋白激酶c激活剂(例如，苔藓抑素)接触，或通过car本身的激活。对于辅助分子在t细胞表面的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，t细胞群可在适于刺激t细胞增殖的条件下与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触。适于t细胞培养的条件包括，例如，可含有增殖和生存所必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、细胞因子诸如il
‑
2、il
‑
7、il
‑
15和/或il
‑
21、胰岛素、ifn
‑
g、gm
‑
csf、tgfβ和/或本领域的技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂的适当的培养基(例如，最小必需培养基或rpmi培养基1640或x
‑
vivo 5(lonza))。在其他实施方案中，可使用诸如us6040177、us5827642和wo2012129514中所述的方法用饲养细胞以及适当的抗体和细胞因子激活和刺激t细胞增殖，这些文献以引用方式并入本文。
248.抗体和抗原结合结构域
249.如本文所用，术语“抗体”采用其广义，包括免疫球蛋白或抗体分子，免疫球蛋白或抗体分子包括人抗体、人源化抗体、复合抗体和嵌合抗体以及单克隆或多克隆的抗体片段。一般来讲，抗体是对特定抗原表现出结合特异性的蛋白质或肽链。抗体结构是熟知的。根据重链恒定结构域氨基酸序列，可将免疫球蛋白指定为五大类(即iga、igd、ige、igg和igm)。iga和igg进一步细分为同种型iga1、iga2、igg1、igg2、igg3和igg4。因此，本发明的抗体可以是五大类或相应的亚型中的任一种。优选地，本发明的抗体是igg1、igg2、igg3或igg4。脊椎动物物种的抗体轻链可基于其恒定结构域的氨基酸序列指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。因此，本发明的抗体可含有κ轻链恒定结构域或λ轻链恒定结构域。根据具体实施方案，本发明的抗体包含来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除了重链和轻链
恒定结构域之外，抗体还含有由轻链可变区和重链可变区组成的抗原结合区，其中每个可变区含有三个结构域(即互补决定区1至3；cdr1、cdr2和cdr3)。轻链可变区结构域另选地被称为lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且重链可变区结构域另选地被称为hcdr1、hcdr2和hcdr3。
250.如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合folr1的分离的抗体基本上不含不结合folr1的抗体)。此外，分离的抗体基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
251.如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mab”是指从基本上同源的抗体群获得的抗体，即构成该群的单个抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变之外。本发明的单克隆抗体可通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术或通过重组dna方法制备。例如，单克隆抗体可由杂交瘤产生，该杂交瘤包括从转基因非人动物诸如转基因小鼠或大鼠获得的b细胞，该转基因非人动物具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
252.如本文所用，术语“抗原结合片段”和/或“抗原结合结构域”是指抗体片段，诸如例如双体、fab、fab'、f(ab')2、fv片段、二硫键稳定性fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv
‑
dsfv')、二硫键稳定性双体(ds双体)、单链抗体分子(scfv)、单结构域抗体(sdab)和scfv二聚体(二价双体)、由包含一个或多个cdr的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米体、结构域抗体、二价结构域抗体、或结合抗原但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合结构域能够结合与亲代抗体结合的相同抗原。根据具体实施方案，抗原结合结构域包含单链抗体分子(scfv)。
253.如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域中的常规单链抗体，该常规双链抗体包含由约5个至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用，术语“单结构域抗体”是指本领域中的常规单结构域抗体，该常规单结构域抗体包含重链可变区和重链恒定区或仅包含重链可变区。
254.如本文所用，术语“人抗体”指由人产生的抗体或使用本领域已知的任何技术制备的具有与由人产生的抗体对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一种人重链多肽和/或轻链多肽的抗体。
255.如本文所用，术语“人源化抗体”和/或“人源化抗原结合结构域”是指非人抗体和/或非人抗原结合结构域，该非人抗体和/或非人抗原结合结构域被修饰以增加与人抗体和/或人抗原结合结构域的序列同源性，使得抗原结合结构域的抗原结合特性得以保留，但其在人体中的抗原性降低。
256.如本文所用，术语“嵌合抗体”和/或“嵌合抗原结合结构域”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两个或更多个物种的抗体和/或抗原结合结构域。轻链和重链两者的可变区通常对应于源自一种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔等)物种的具有期望特异性、亲和力和能力的抗体和/或抗原结合结构域的可变区，而恒定区对应于源自另一种哺乳动物(例如，人)物种的抗体和/或抗原结合结构域的序列，以避免在该物种中引发免疫应答。
257.如本文所用，术语“多特异性抗体”是指包含多个免疫球蛋白可变结构域序列的抗体，其中该多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且该多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方案中，第一表位和第二表位位于相同的
抗原上，例如，相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位不重叠或基本上不重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位位于不同的抗原上，例如，不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，多特异性抗体包含第三免疫球蛋白可变结构域、第四免疫球蛋白可变结构域或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。
258.如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合不超过两个表位或两个抗原的多特异性抗体。双特异性抗体的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方案中，第一表位和第二表位位于相同的抗原上，例如，相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位位于不同的抗原上，例如，不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的scfv或其片段以及对第二表位具有结合特异性的scfv或其片段。在一个实施方案中，第一表位位于folr1上，并且第二表位位于pd
‑
1、pd
‑
l1、tim
‑
3、lag
‑
3、cd73、爱帕琳肽(apelin)、ctla
‑
4、egfr、her
‑
2、cd3、cd19、cd20、cd33、cd47、tip
‑
1、cldn18.2、dll3和/或其他肿瘤相关免疫抑制因子或表面抗原上。
259.如本文所用，术语“folr1”是指叶酸受体1(folr1)，也称为叶酸受体α(frα)或叶酸结合蛋白(fbp)，它是细胞表面上的糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定膜蛋白，该gpi锚定膜蛋白对叶酸的活性形式5
‑
甲基四氢叶酸(5
‑
mtf)及其衍生物具有高亲和力并将其转运到细胞中(salazar和ratnam，cancer metastasis rev，2007年，第26卷，第141页至第152页)。folr1已经成为肿瘤学靶标，因为它在某些实体肿瘤诸如卵巢癌、肺癌和乳腺癌中过表达(toffoli等人，int j cancer，1997年，第74卷，第193页至第198页和boogerd等人，oncotarget，2016年，第7卷，第17442页至第17454页)，但在有限的正常人体组织中的表达水平很低(weitman等人，cancer res，1992年，第52卷，第3396页至第3401页)。与该观察一致，迄今为止用靶向folr1的小分子和大分子进行的1期临床试验揭示了良好的药物耐受性(cheung等人，oncotarget，2016年，第7卷，第52553页至第52574页)。因此，folr1是car
‑
t细胞疗法治疗和治愈folr1阳性癌症的理想靶标。人folr1的示例性氨基酸序列由genbank登记号np_057937(seq id no:135)表示。
260.如本文所用，“特异性结合folr1”的抗体和/或抗原结合结构域是指以1
×
10
‑7m或更低、优选地1
×
10
‑8m或更低、更优选地5
×
10
‑9m或更低、1
×
10
‑9m或更低、5
×
10
‑
10
m或更低或者1
×
10
‑
10
m或更低的kd结合folr1、优选地结合人folr1的抗体和/或抗原结合结构域。术语“kd”是指解离常数，其由kd与ka的比率(即，kd/ka)获得，并表示为摩尔浓度(m)。抗原结合结构域的kd值可根据本公开内容使用本领域的方法来测定。例如，可通过使用表面等离子体共振，诸如通过使用生物传感器系统，例如系统，或通过使用生物层干涉测量技术，诸如octet red96系统，来测定抗体和/或抗原结合结构域的kd。
261.抗体和/或抗原结合结构域的kd值越小，抗体和/或抗原结合结构域结合靶抗原的亲和力越高。
262.根据一个具体方面，本发明涉及包含抗原结合结构域的嵌合抗原受体(car)，其中该抗原结合结构域包含分别具有以下多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3：
263.(1)seq id no:17、18、19、41、42和43；
264.(2)seq id no:20、21、22、44、45和46；
265.(3)seq id no:23、24、25、47、48和49；
266.(4)seq id no:26、27、28、50、51和52；
267.(5)seq id no:29、30、31、53、54和55；
268.(6)seq id no:32、33、34、56、57和58；
269.(7)seq id no:35、36、37、59、60和61；或
270.(8)seq id no:38、39、40、62、63和64；
271.其中该抗原结合结构域特异性结合folr1，优选地为人folr1。
272.根据另一个具体方面，本发明涉及包含抗原结合结构域的嵌合抗原受体(car)，其中该抗原结合结构域包含分别具有以下多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3：
273.(1)seq id no:65、66、67、89、90和91；
274.(2)seq id no:68、69、70、92、93和94；
275.(3)seq id no:71、72、73、95、96和97；
276.(4)seq id no:74、75、76、98、99和100；
277.(5)seq id no:77、78、79、101、102和103；
278.(6)seq id no:80、81、82、104、105和106；
279.(7)seq id no:83、84、85、107、108和109；或
280.(8)seq id no:86、87、88、110、111和112；
281.其中该抗原结合结构域特异性结合folr1，优选地为人folr1。
282.根据另一个具体方面，本发明涉及一种抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含具有与seq id no:1、3、5、7、9、11、13或15有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列的重链可变区或具有与seq id no:2、4、6、8、10、12、14或16有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列的轻链可变区。
283.根据另一个具体方面，本发明涉及一种抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：
284.(1)具有seq id no:1的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:2的多肽序列的轻链可变区；
285.(2)具有seq id no:3的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:4的多肽序列的轻链可变区；
286.(3)具有seq id no:5的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:6的多肽序列的轻链可变区；
287.(4)具有seq id no:7的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:8的多肽序列的轻链可变区；
288.(5)具有seq id no:9的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:10的多肽序列的轻链可变区；
289.(6)具有seq id no:11的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:12的多肽序列的轻链可变区；
290.(7)具有seq id no:13的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:14的多肽序列的轻链可变区；或
291.(8)具有seq id no:15的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:16的多肽序列的轻链可变区。
292.根据另一个具体方面，该抗原结合结构域是人源化的，并且包含具有与seq id no:113、114、115、116、119、120、124、125、128、129、130、136、137、138、142、143、144、148、149、150、154、155、156或171
‑
184有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列的重链可变区或具有与seq id no:117、118、121、122、123、126、127、131、132、133、134、139、140、141、145、146、147、151、152、153、157、158或185
‑
198有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列的轻链可变区。
293.根据另一个具体方面，该抗原结合结构域是人源化的，并且包含：
294.(1)具有seq id no:113的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
295.(2)具有seq id no:113的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
296.(3)具有seq id no:114的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
297.(4)具有seq id no:114的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
298.(5)具有seq id no:115的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
299.(6)具有seq id no:115的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
300.(7)具有seq id no:116的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
301.(8)具有seq id no:116的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
302.(9)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:121的多肽序列的轻链可变区；
303.(10)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:122的多肽序列的轻链可变区；
304.(11)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:123的多肽序列的轻链可变区；
305.(12)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:121的多肽序列的轻链可变区；
306.(13)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:122的多肽序列的轻链可变区；
307.(14)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:123的多肽序列的轻链可变区；
308.(15)具有seq id no:124的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:126的多肽序列的轻链可变区；
309.(16)具有seq id no:124的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:127的多肽序列的轻链可变区；
310.(17)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽序列的轻链可变区；
311.(18)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽序列的轻链可变区；
312.(19)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽序列的轻链可变区；
313.(20)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
314.(21)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽序列的轻链可变区；
315.(22)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽序列的轻链可变区；
316.(23)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽序列的轻链可变区；
317.(24)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
318.(25)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽序列的轻链可变区；
319.(26)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽序列的轻链可变区；
320.(27)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽序列的轻链可变区；
321.(28)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
322.(29)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽序列的轻链可变区；
323.(30)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽序列的轻链可变区；
324.(31)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
325.(32)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽
序列的轻链可变区；
326.(33)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽序列的轻链可变区；
327.(34)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
328.(35)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽序列的轻链可变区；
329.(36)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽序列的轻链可变区；
330.(37)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
331.(38)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽序列的轻链可变区；
332.(39)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
333.(40)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
334.(41)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽序列的轻链可变区；
335.(42)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
336.(43)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
337.(44)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽序列的轻链可变区；
338.(45)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
339.(46)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
340.(47)具有seq id no:148的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:151的多肽序列的轻链可变区；
341.(48)具有seq id no:150的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:153的多肽序列的轻链可变区；
342.(49)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:185的多肽序列的轻链可变区；
343.(50)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:186的多肽序列的轻链可变区；
344.(51)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:187的多肽序列的轻链可变区；
345.(52)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:185的多肽序列的轻链可变区；
346.(53)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:186的多肽序列的轻链可变区；
347.(54)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:187的多肽序列的轻链可变区；
348.(55)具有seq id no:182的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:190的多肽序列的轻链可变区；
349.(56)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:195的多肽序列的轻链可变区；
350.(57)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:196的多肽序列的轻链可变区；
351.(58)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:197的多肽序列的轻链可变区；
352.(59)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:198的多肽序列的轻链可变区；
353.(60)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:195的多肽序列的轻链可变区；
354.(61)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:196的多肽序列的轻链可变区；
355.(62)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:197的多肽序列的轻链可变区；或
356.(63)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:198的多肽序列的轻链可变区。
357.根据另一个具体方面，该抗原结合结构域是特异性结合folr1、优选地为人folr1的单链可变片段(scfv)。
358.在某些实施方案中，该编码的抗原结合结构域是特异性结合folr1、优选地为人folr1的人源化单链可变片段(scfv)。在某些实施方案中，该抗原结合结构域是特异性结合folr1、优选地为人folr1的人源化单链可变片段(scfv)。在某些实施方案中，该人源化单链可变片段(scfv)包含与seq id no:159
‑
170中的任一者有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，人源化单链可变片段(scfv)包含具有选自由seq id no:159
‑
170组成的组的氨基酸序列的多肽序列。
359.根据另一个具体方面，嵌合抗原受体包含一个或多个抗原结合结构域。
360.根据另一个具体方面，胞内信号传导结构域包含一个或多个共刺激结构域和一个或多个激活结构域。
361.在另一个总的方面，本发明涉及一种包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸的分离的多核苷酸，其中该car包含本发明的其抗原结合结构域。本领域的技术人员将理解，可改变(例如，替换、缺失、插入等)蛋白质的编码序列而不改变蛋白质的氨基酸序列。因此，本领域的技术人员将理解，可改变编码本发明的其抗原结合结构域的核酸序列而不改变蛋白质
的氨基酸序列。
362.在另一个总的方面，本发明涉及一种包含分离的多核苷酸的载体，该分离的多核苷酸包含编码car的核酸，其中该car包含本发明的其抗原结合结构域。鉴于本公开内容，可使用本领域的技术人员已知的任何载体，诸如质粒、粘粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方案中，载体是重组表达载体，诸如质粒。载体可包括建立表达载体的常规功能的任何要素，例如，启动子、核糖体结合要素、终止子、增强子、选择标记和复制起点。启动子可以是组成型、诱导型或阻抑型启动子。能够将核酸递送至细胞的许多表达载体在本领域是已知的，并且可在本文中用于在细胞中产生其抗原结合结构域。常规克隆技术或人工基因合成可用于生成根据本发明的实施方案的重组表达载体。
363.在另一个总的方面，本发明涉及一种用包含编码本发明的car的分离的核酸的载体转导的细胞。术语“转导的”或“转导”是指将外源核酸转移或引入到宿主细胞中的过程。“转导的”细胞是已用外源核酸转导的细胞。该细胞包括原代受试细胞及其子代。在某些实施方案中，该细胞是car
‑
t细胞，优选地为人car
‑
t细胞，其中t细胞被工程化以表达本发明的car来治疗疾病诸如癌症。在某些实施方案中，该细胞是car
‑
nk细胞，优选地为人car
‑
nk细胞，其中经工程化以表达本发明的car的nk细胞用于治疗疾病诸如癌症。
364.在另一个总的方面，本发明涉及一种通过用包含编码本发明的car的分离的核酸的载体转导t细胞来制备car
‑
t细胞的方法。
365.在另一个总的方面，本发明涉及一种产生本发明的嵌合抗原受体(car)
‑
t细胞的方法，该方法包括在产生car
‑
t细胞的条件下培养包含编码本发明的car的核酸的t细胞，以及回收该car
‑
t细胞。
366.在另一个总的方面，本发明涉及一种通过用包含编码本发明的car的分离的核酸的载体转导nk细胞来制备car
‑
nk细胞的方法。
367.在另一个总的方面，本发明涉及一种产生本发明的嵌合抗原受体(car)
‑
nk细胞的方法，该方法包括在产生car
‑
nk细胞的条件下培养包含编码其car的核酸的nk细胞，以及回收该car
‑
nk细胞。
368.在另一个总的方面，本发明涉及一种生成包含本发明的嵌合抗原受体(car)的rna工程化细胞群的方法。该方法包括使细胞群与包含编码本发明的car的核酸的分离的多核苷酸接触，其中该分离的多核苷酸是体外转录的rna或合成rna。
369.在另一个总的方面，本发明涉及一种人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含具有与seq id no:113、114、115、116、119、120、124、125、128、129、130、136、137、138、142、143、144、148、149、150、154、155、156或171
‑
184中的任一者有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区或具有与seq id no:117、118、121、122、123、126、127、131、132、133、134、139、140、141、145、146、147、151、152、153、157、158或185
‑
198有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。
370.根据另一个具体方面，该人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
371.(1)具有seq id no:113的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
372.(2)具有seq id no:113的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
373.(3)具有seq id no:114的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
374.(4)具有seq id no:114的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
375.(5)具有seq id no:115的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
376.(6)具有seq id no:115的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
377.(7)具有seq id no:116的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
378.(8)具有seq id no:116的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
379.(9)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:121的多肽序列的轻链可变区；
380.(10)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:122的多肽序列的轻链可变区；
381.(11)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:123的多肽序列的轻链可变区；
382.(12)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:121的多肽序列的轻链可变区；
383.(13)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:122的多肽序列的轻链可变区；
384.(14)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:123的多肽序列的轻链可变区；
385.(15)具有seq id no:124的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:126的多肽序列的轻链可变区；
386.(16)具有seq id no:124的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:127的多肽序列的轻链可变区；
387.(17)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽序列的轻链可变区；
388.(18)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽序列的轻链可变区；
389.(19)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽序列的轻链可变区；
390.(20)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
391.(21)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽序列的轻链可变区；
392.(22)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽
序列的轻链可变区；
393.(23)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽序列的轻链可变区；
394.(24)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
395.(25)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽序列的轻链可变区；
396.(26)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽序列的轻链可变区；
397.(27)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽序列的轻链可变区；
398.(28)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
399.(29)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽序列的轻链可变区；
400.(30)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽序列的轻链可变区；
401.(31)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
402.(32)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽序列的轻链可变区；
403.(33)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽序列的轻链可变区；
404.(34)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
405.(35)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽序列的轻链可变区；
406.(36)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽序列的轻链可变区；
407.(37)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
408.(38)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽序列的轻链可变区；
409.(39)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
410.(40)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
411.(41)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽序列的轻链可变区；
412.(42)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
413.(43)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
414.(44)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽序列的轻链可变区；
415.(45)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
416.(46)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
417.(47)具有seq id no:148的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:151的多肽序列的轻链可变区；
418.(48)具有seq id no:150的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:153的多肽序列的轻链可变区；
419.(49)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:185的多肽序列的轻链可变区；
420.(50)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:186的多肽序列的轻链可变区；
421.(51)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:187的多肽序列的轻链可变区；
422.(52)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:185的多肽序列的轻链可变区；
423.(53)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:186的多肽序列的轻链可变区；
424.(54)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:187的多肽序列的轻链可变区；
425.(55)具有seq id no:182的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:190的多肽序列的轻链可变区；
426.(56)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:195的多肽序列的轻链可变区；
427.(57)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:196的多肽序列的轻链可变区；
428.(58)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:197的多肽序列的轻链可变区；
429.(59)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:198的多肽序列的轻链可变区；
430.(60)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:195的多肽序列的轻链可变区；
431.(61)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:196的多肽
序列的轻链可变区；
432.(62)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:197的多肽序列的轻链可变区；或
433.(63)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:198的多肽序列的轻链可变区。
434.根据另一个具体方面，该人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段能够结合folr1、诱导效应子介导的肿瘤细胞裂解、介导缀合的药物的募集以及/或者与具有癌症杀伤作用的另一种单克隆抗体或抗原结合片段形成双特异性抗体。
435.在另一个总的方面，本发明涉及一种编码本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
436.在另一个总的方面，本发明涉及一种包含编码本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸的载体。
437.在另一个总的方面，本发明涉及一种包含载体的宿主细胞，该载体包含编码本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
438.在另一个总的方面，本发明涉及一种产生本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在产生单克隆抗体或抗原结合片段的条件下培养包含编码该单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以及从该细胞或培养物中回收该抗体或抗原结合片段。
439.药物组合物
440.在另一个总的方面，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的分离的多核苷酸、本发明的分离的多肽、本发明的宿主细胞和/或本发明的工程化免疫细胞和药学上可接受的载体。
441.在另一个总的方面，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
442.如本文所用，术语“药物组合物”意指包含本发明的分离的多核苷酸、本发明的分离的多肽、本发明的宿主细胞、本发明的工程化免疫细胞和/或本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的载体的产物。本发明的多核苷酸、多肽、宿主细胞、工程化免疫细胞和/或本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或抗原结合片段以及包含它们的组合物也可用于制造用于本文提及的治疗应用的药物。
443.如本文所用，术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含脂囊泡、微球体、脂质体包封或本领域熟知的用于药物制剂的其他材料。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特征将取决于特定应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰根据本发明的组合物的有效性或根据本发明的组合物的生物活性的无毒材料。根据具体实施方案，鉴于本公开内容，适用于多核苷酸、多肽、宿主细胞和/或工程化免疫细胞药物组合物的任何药学上可接受的载体可用于本发明。
444.药学活性成分与药学上可接受的载体的制剂是本领域已知的，例如，《雷明顿：药学科学与实践》(例如，2005年第21版，以及任何后来的版本)。附加成分的非限制性示例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张力调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。一种或多种药学上可接受的载体可用于配制本发明的药物组合物。
445.在另一个总的方面，本发明涉及一种产生包含本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，该方法包括将单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得该药物组合物。
446.使用方法
447.在另一个总的方面，本发明涉及一种治疗对其有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本发明的car
‑
t细胞和/或car
‑
nk细胞。癌症可例如选自但不限于肺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿道上皮癌、转移性黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤和其他实体肿瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性淋巴细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、多发性骨髓瘤(mm)、急性髓性白血病(aml)和其他液体肿瘤。
448.在另一个总的方面，本发明涉及一种靶向对其有需要的受试者的癌细胞表面上的folr1的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用包含本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
449.在另一个总的方面，本发明涉及一种治疗对其有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用包含本发明的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。癌症可以是任何液体或固体癌症，例如，其可选自但不限于肺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿道上皮癌、转移性黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤和其他实体肿瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性淋巴细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、多发性骨髓瘤(mm)、急性髓性白血病(aml)和其他液体肿瘤。
450.根据本发明的实施方案，car
‑
t细胞或car
‑
nk细胞包含治疗有效量的本发明的表达的car，并且药物组合物包含治疗有效量的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受试者中引起期望生物或药物应答的活性成分或组分的量。治疗有效量可根据经验和常规方式来确定，与所述目的相关。
451.如本文关于car所用，治疗有效量意指在转导的t细胞或nk细胞中表达的调节对其有需要的受试者中的免疫应答的car分子的量。此外，如本文关于car所用，治疗有效量意指在转导的t细胞或nk细胞中表达的导致对疾病、障碍或病症进行治疗，预防或减缓疾病、障碍或病症的发展，或减轻或完全缓解与疾病、障碍或病症相关的症状的car分子的量。
452.如本文关于car
‑
t细胞或car
‑
nk细胞所用，治疗有效量意指调节对其有需要的受试者中的免疫应答的car
‑
t细胞或car
‑
nk细胞的量。此外，如本文关于car
‑
t细胞或car
‑
nk细胞所用，治疗有效量意指导致对疾病、障碍或病症进行治疗，预防或减缓疾病、障碍或病症的进展，或减轻或完全缓解与疾病、障碍或病症相关的症状的car
‑
t细胞或car
‑
nk细胞的量。
453.如本文关于人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段所用，治疗有效量意指调节对其有需要的受试者中的免疫应答的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的量。此外，如本文关于人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段所用，治疗有效量意指导致对疾病、障碍或病症进行治疗，预防或减缓疾病、障碍或病症的进展，或减轻或完全缓解与疾病、障碍或病症相关的症状的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的量。
454.根据具体实施方案，待治疗的疾病、障碍或病症是癌症，优选地选自由以下项组成
的组的癌症：肺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿道上皮癌、转移性黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤和其他实体肿瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性淋巴细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、多发性骨髓瘤(mm)、急性髓性白血病(aml)和其他液体肿瘤。
455.根据具体实施方案，治疗有效量是指足以实现以下作用中的一种、两种、三种、四种或更多种的治疗量：(i)减轻或改善待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的严重程度；(ii)缩短待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的持续时间；(iii)预防待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的进展；(iv)引起待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的消退；(v)预防待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的发展或发作；(vi)预防待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的复发；(vii)缩短患有待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的受试者的住院治疗；(viii)缩短患有待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的受试者的住院时间长度；(ix)延长患有待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的受试者的存活；(xi)抑制或减轻受试者中待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状；以及/或者(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗作用。
456.治疗有效量或剂量可根据各种因素而变化，诸如待治疗的疾病、障碍或病症，施用方式，靶部位，受试者的生理状态(包括例如，年龄、体重、健康)，受试者是人还是动物，施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。最佳地滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
457.根据具体实施方案，本文所述的组合物被配制成适于向受试者施用的预期途径。例如，本文所述的组合物可被配制成适于静脉内施用、皮下施用或肌内施用。
458.本发明的细胞可以本领域的技术人员已知的任何方便的方式施用。例如，本发明的细胞可通过气溶胶吸入、注射、摄取、输注、植入和/或移植施用于受试者。包含本发明的细胞的组合物可经动脉、皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内、胸膜内、通过静脉(i.v.)注射或腹膜内施用。在某些实施方案中，本发明的细胞可在受试者的淋巴细胞清除或不清除的情况下施用。
459.包含表达本发明car的本发明细胞的药物组合物可在无菌液体制剂中提供，通常是与细胞悬浮液等渗的水溶液，或任选地作为乳液、分散体等，其通常被缓冲至选定的ph。组合物可包含适于细胞的完整性和生存力以及适于施用细胞组合物的载体，例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水等。
460.无菌注射溶液可通过将本发明的细胞与根据需要的各种其他成分掺入到适量的适当溶剂中来制备。此类组合物可包含适合与细胞组合物一起使用并且适合施用于受试者诸如人的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等。用于提供细胞组合物的合适的缓冲液是本领域熟知的。所用的任何载体、稀释剂或添加剂都与保持本发明细胞的完整性和生存力相容。
461.本发明的细胞可在任何生理上可接受的载体中施用。包含本发明细胞的细胞群可包含经纯化的细胞群。本领域的技术人员可使用各种熟知的方法容易地确定细胞群中的细胞。包含本发明的经遗传修饰的细胞的细胞群的纯度范围可以是约50％至约55％、约55％至约60％、约60％至约65％、约65％至约70％、约70％至约75％、约75％至约80％、约80％至
约85％、约85％至约90％、约90％至约95％或约95％至约100％。本领域的技术人员可容易地调整剂量，例如，纯度的降低可能需要增加剂量。
462.本发明的细胞通常以基于施用细胞的受试者每千克体重的细胞(细胞/kg)的剂量施用。通常，该细胞剂量在约104个细胞/kg体重至约10
10
个细胞/kg体重例如约105个细胞/kg体重至约109个细胞/kg体重、约105个细胞/kg体重至约108个细胞/kg体重、约105个细胞/kg体重至约107个细胞/kg体重或约105个细胞/kg体重至约106个细胞/kg体重的范围内，这取决于施用模式和位置。一般来讲，在全身施用的情况下，使用比局部施用更高的剂量，其中本发明的免疫细胞在肿瘤和/或癌症的区域中施用。示例性剂量范围包括但不限于1
×
104个细胞/kg至1
×
108个细胞/kg、2
×
104个细胞/kg至1
×
108个细胞/kg、3
×
104个细胞/kg至1
×
108个细胞/kg、4
×
104个细胞/kg至1
×
108个细胞/kg、5
×
104个细胞/kg至6
×
108个细胞/kg、7
×
104个细胞/kg至1
×
108个细胞/kg、8
×
104个细胞/kg至1
×
108个细胞/kg、9
×
104个细胞/kg至1
×
108个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至1
×
108个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至9
×
107个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至8
×
107个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至7
×
107个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至6
×
107个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至5
×
107个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至4
×
107个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至4
×
107个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至3
×
107个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至2
×
107个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至1
×
107个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至9
×
106个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至8
×
106个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至7
×
106个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至6
×
106个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至5
×
106个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至4
×
106个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至4
×
106个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至3
×
106个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至2
×
106个细胞/kg、1
×
105个细胞/kg至1
×
106个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至9
×
107个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至8
×
107个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至7
×
107个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至6
×
107个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至5
×
107个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至4
×
107个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至4
×
107个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至3
×
107个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至2
×
107个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至1
×
107个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至9
×
106个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至8
×
106个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至7
×
106个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至6
×
106个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至5
×
106个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至4
×
106个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至4
×
106个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至3
×
106个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至2
×
106个细胞/kg、2
×
105个细胞/kg至1
×
106个细胞/kg、3
×
105个细胞/kg至3
×
106个细胞/kg等。另外，可调整剂量以考虑是施用单一剂量还是施用多剂量。将被认为是有效剂量的精确确定可基于每个受试者的个体因素。
463.如本文所用，术语“治疗(treat、treating和treatment)”均旨在指与癌症相关的至少一个可测量的身体参数的改善或逆转，该身体参数在受试者中不一定可辨别，但能够在受试者中可辨别。术语“治疗”也可指引起疾病、障碍或病症的消退、预防进展或至少减缓进展。在一个具体实施方案中，“治疗”是指缓解、预防与疾病、障碍或病症诸如肿瘤或更优选地为癌症相关的一种或多种症状的发展或发作，或缩短其持续时间。在一个具体实施方案中，“治疗”是指预防疾病、障碍或病症的复发。在一个具体实施方案中，“治疗”是指延长患有该疾病、障碍或病症的受试者存活。在一个具体实施方案中，“治疗”是指消除受试者的疾病、障碍或病症。
464.根据具体实施方案，提供了用于治疗癌症的组合物。对于癌症疗法，所提供的组合物可与另一种治疗组合使用，该另一种治疗包括但不限于化学疗法、抗cd20 mab、抗tim
‑
3 mab、抗lag
‑
3 mab、抗egfr mab、抗her
‑
2 mab、抗cd19 mab、抗cd33 mab、抗cd47 mab、抗cd73 mab、抗dll
‑
3 mab、抗爱帕琳肽mab、抗tip
‑
1 mab、抗claudin18.2 mab、抗ctla
‑
4 mab、抗pd
‑
l1 mab、抗pd
‑
1 mab、其他免疫肿瘤药物、抗血管生成剂、放射疗法、抗体
‑
药物缀合物(adc)、靶向疗法或其他抗癌药物。
465.根据具体实施方案，治疗对其有需要的受试者的癌症的方法包括向受试者施用本发明的car
‑
t细胞和/或car
‑
nk细胞与增加表达car分子的细胞的功效的药剂的组合。此类药剂包括但不限于结合cd73、cd39、pd1、pd
‑
l1、pd
‑
l2、ctla4、tim3或lag3的抗体片段，或腺苷a2a受体拮抗剂。
466.根据具体实施方案，治疗对其有需要的受试者的癌症的方法包括向受试者施用本发明的car
‑
t细胞和/或car
‑
nk细胞与改善与施用表达car分子的细胞相关的一种或多种副作用的药剂的组合。此类药剂包括但不限于类固醇、tnfα抑制剂或il
‑
6抑制剂。
467.根据具体实施方案，治疗对其有需要的受试者的癌症的方法包括向受试者施用本发明的car
‑
t细胞和/或car
‑
nk细胞与治疗与folr1相关的疾病的药剂的组合。此类药剂包括但不限于抗folr1单克隆抗体或双特异性抗体。
468.如本文所用，在向受试者施用两种或更多种疗法的上下文中，术语“组合”是指使用多于一种疗法。术语“组合”的使用不限制向受试者施用疗法的顺序。例如，第一疗法(例如，本文所述的组合物)可在向受试者施用第二疗法之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、同时或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用。
469.实施方案
470.本发明还提供了以下非限制性实施方案。
471.实施方案1是一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列，其中所述car包含：(a)胞外结构域，所述胞外结构域包含至少一个特异性结合叶酸受体1(folr1)的抗原结合结构域；(b)铰链区；(c)跨膜区；和(d)胞内信号传导结构域。
472.实施方案2是根据实施方案1所述的分离的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域包含分别具有以下多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3：
473.(1)seq id no:17、18、19、41、42和43；
474.(2)seq id no:20、21、22、44、45和46；
475.(3)seq id no:23、24、25、47、48和49；
476.(4)seq id no:26、27、28、50、51和52；
477.(5)seq id no:29、30、31、53、54和55；
478.(6)seq id no:32、33、34、56、57和58；
479.(7)seq id no:35、36、37、59、60和61；或
480.(8)seq id no:38、39、40、62、63和64；
481.其中该抗原结合结构域特异性结合folr1，优选地为人folr1。
482.实施方案3是根据实施方案1所述的分离的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域包含分别具有以下多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3：
483.(1)seq id no:65、66、67、89、90和91；
484.(2)seq id no:68、69、70、92、93和94；
485.(3)seq id no:71、72、73、95、96和97；
486.(4)seq id no:74、75、76、98、99和100；
487.(5)seq id no:77、78、79、101、102和103；
488.(6)seq id no:80、81、82、104、105和106；
489.(7)seq id no:83、84、85、107、108和109；或
490.(8)seq id no:86、87、88、110、111和112；
491.其中该抗原结合结构域特异性结合folr1，优选地为人folr1。
492.实施方案4是根据实施方案1至3中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域包含具有与seq id no:1、3、5、7、9、11、13或15有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列的重链可变区或具有与seq id no:2、4、6、8、10、12、14或16有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列的轻链可变区。
493.实施方案5是根据实施方案1至4中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域包含：
494.(1)具有seq id no:1的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:2的多肽序列的轻链可变区；
495.(2)具有seq id no:3的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:4的多肽序列的轻链可变区；
496.(3)具有seq id no:5的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:6的多肽序列的轻链可变区；
497.(4)具有seq id no:7的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:8的多肽序列的轻链可变区；
498.(5)具有seq id no:9的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:10的多肽序列的轻链可变区；
499.(6)具有seq id no:11的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:12的多肽序列的轻链可变区；
500.(7)具有seq id no:13的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:14的多肽序列的轻链可变区；或
501.(8)具有seq id no:15的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:16的多肽序列的轻链可变区。
502.实施方案6是根据实施方案1至4中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域是人源化的，并且包含具有与seq id no:113、114、115、116、119、120、124、125、
128、129、130、136、137、138、142、143、144、148、149、150、154、155、156或171
‑
184有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列的重链可变区或具有与seq id no:117、118、121、122、123、126、127、131、132、133、134、139、140、141、145、146、147、151、152、153、157、158或185
‑
198有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的多肽序列的轻链可变区。
503.实施方案7是根据实施方案6所述的分离的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域是人源化的，并且包含：
504.(1)具有seq id no:113的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
505.(2)具有seq id no:113的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
506.(3)具有seq id no:114的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
507.(4)具有seq id no:114的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
508.(5)具有seq id no:115的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
509.(6)具有seq id no:115的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
510.(7)具有seq id no:116的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
511.(8)具有seq id no:116的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
512.(9)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:121的多肽序列的轻链可变区；
513.(10)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:122的多肽序列的轻链可变区；
514.(11)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:123的多肽序列的轻链可变区；
515.(12)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:121的多肽序列的轻链可变区；
516.(13)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:122的多肽序列的轻链可变区；
517.(14)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:123的多肽序列的轻链可变区；
518.(15)具有seq id no:124的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:126的多肽序列的轻链可变区；
519.(16)具有seq id no:124的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:127的多肽序列的轻链可变区；
520.(17)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽序列的轻链可变区；
521.(18)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽序列的轻链可变区；
522.(19)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽序列的轻链可变区；
523.(20)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
524.(21)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽序列的轻链可变区；
525.(22)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽序列的轻链可变区；
526.(23)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽序列的轻链可变区；
527.(24)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
528.(25)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽序列的轻链可变区；
529.(26)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽序列的轻链可变区；
530.(27)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽序列的轻链可变区；
531.(28)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
532.(29)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽序列的轻链可变区；
533.(30)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽序列的轻链可变区；
534.(31)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
535.(32)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽序列的轻链可变区；
536.(33)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽序列的轻链可变区；
537.(34)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
538.(35)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽序列的轻链可变区；
539.(36)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽
序列的轻链可变区；
540.(37)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
541.(38)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽序列的轻链可变区；
542.(39)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
543.(40)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
544.(41)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽序列的轻链可变区；
545.(42)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
546.(43)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
547.(44)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽序列的轻链可变区；
548.(45)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
549.(46)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
550.(47)具有seq id no:148的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:151的多肽序列的轻链可变区；
551.(48)具有seq id no:150的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:153的多肽序列的轻链可变区；
552.(49)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:185的多肽序列的轻链可变区；
553.(50)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:186的多肽序列的轻链可变区；
554.(51)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:187的多肽序列的轻链可变区；
555.(52)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:185的多肽序列的轻链可变区；
556.(53)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:186的多肽序列的轻链可变区；
557.(54)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:187的多肽序列的轻链可变区；
558.(55)具有seq id no:182的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:190的多肽序列的轻链可变区；
559.(56)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:195的多肽序列的轻链可变区；
560.(57)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:196的多肽序列的轻链可变区；
561.(58)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:197的多肽序列的轻链可变区；
562.(59)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:198的多肽序列的轻链可变区；
563.(60)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:195的多肽序列的轻链可变区；
564.(61)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:196的多肽序列的轻链可变区；
565.(62)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:197的多肽序列的轻链可变区；或
566.(63)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:198的多肽序列的轻链可变区。
567.实施方案8是根据实施方案1至7中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域是特异性结合folr1、优选地为人folr1的单链可变片段(scfv)。
568.实施方案9是根据实施方案8所述的分离的多核苷酸，其中所述单链可变片段(scfv)是人源化的。
569.实施方案10是根据实施方案8或9所述的分离的多核苷酸，其中所述单链可变片段(scfv)包含与seq id no:159
‑
170中的任一者有至少95％同一性的多肽序列。
570.实施方案11是根据实施方案1至10中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述嵌合抗原受体(car)包含一个或多个抗原结合结构域。
571.实施方案12是根据实施方案1至11中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述car的所述胞内信号传导结构域包含一个或多个共刺激结构域和一个或多个激活结构域。
572.实施方案13是一种嵌合抗原受体(car)，所述car由根据实施方案1至12中任一项所述的分离的多核苷酸编码。
573.实施方案14是一种载体，所述载体包含根据实施方案1至12中任一项所述的分离的多核苷酸。
574.实施方案15是一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方案14所述的载体。
575.实施方案16是根据实施方案15所述的宿主细胞，其中所述细胞是car
‑
t细胞，优选地为人car
‑
t细胞。
576.实施方案17是根据实施方案15所述的宿主细胞，其中所述细胞是car
‑
nk细胞，优选地为人car
‑
nk细胞。
577.实施方案18是一种制备表达嵌合抗原受体(car)的宿主细胞的方法，所述方法包括用根据实施方案14所述的载体转导t细胞。
578.实施方案19是一种产生嵌合抗原受体(car)
‑
t细胞的方法，所述方法包括在产生所述car
‑
t细胞的条件下培养包含根据实施方案1至12中任一项所述的包含编码嵌合抗原
受体(car)的核酸的分离的多核苷酸的t细胞，以及回收所述car
‑
t细胞。
579.实施方案20是一种制备表达嵌合抗原受体(car)的宿主细胞的方法，所述方法包括用根据实施方案14所述的载体转导nk细胞。
580.实施方案21是一种产生嵌合抗原受体(car)
‑
nk细胞的方法，所述方法包括在产生所述car
‑
nk细胞的条件下培养包含根据实施方案1至12中任一项所述的包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸的分离的多核苷酸的nk细胞，以及回收所述car
‑
nk细胞。
581.实施方案22是一种生成包含嵌合抗原受体(car)的细胞的方法，所述方法包括使细胞与根据实施方案1至12中任一项所述的包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸的分离的多核苷酸接触，其中所述分离的多核苷酸是体外转录的rna或合成rna。
582.实施方案23是一种治疗对其有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方案15至17中任一项所述的宿主细胞。
583.实施方案24是根据实施方案23所述的方法，其中所述癌症选自肺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿道上皮癌、转移性黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤和其他实体肿瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性淋巴细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、多发性骨髓瘤(mm)、急性髓性白血病(aml)和其他液体肿瘤。
584.实施方案25是根据实施方案23或24所述的方法，所述方法还包括向所述对其有需要的受试者施用增加表达car的细胞的功效的药剂。
585.实施方案26是根据实施方案23或24所述的方法，所述方法还包括向所述对其有需要的受试者施用改善与施用表达car的细胞相关的一种或多种副作用的药剂。
586.实施方案27是根据实施方案23或24所述的方法，所述方法还包括向所述对其有需要的受试者施用治疗与folr1相关的疾病的药剂。
587.实施方案28是一种人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有与seq id no:113、114、115、116、119、120、124、125、128、129、130、136、137、138、142、143、144、148、149、150、154、155、156或171
‑
184中的任一者有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区或具有与seq id no:117、118、121、122、123、126、127、131、132、133、134、139、140、141、145、146、147、151、152、153、157、158或185
‑
198有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。
588.实施方案29是根据实施方案28所述的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
589.(1)具有seq id no:113的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
590.(2)具有seq id no:113的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
591.(3)具有seq id no:114的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
592.(4)具有seq id no:114的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
593.(5)具有seq id no:115的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序
列的轻链可变区；
594.(6)具有seq id no:115的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
595.(7)具有seq id no:116的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:117的多肽序列的轻链可变区；
596.(8)具有seq id no:116的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:118的多肽序列的轻链可变区；
597.(9)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:121的多肽序列的轻链可变区；
598.(10)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:122的多肽序列的轻链可变区；
599.(11)具有seq id no:119的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:123的多肽序列的轻链可变区；
600.(12)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:121的多肽序列的轻链可变区；
601.(13)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:122的多肽序列的轻链可变区；
602.(14)具有seq id no:120的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:123的多肽序列的轻链可变区；
603.(15)具有seq id no:124的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:126的多肽序列的轻链可变区；
604.(16)具有seq id no:124的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:127的多肽序列的轻链可变区；
605.(17)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽序列的轻链可变区；
606.(18)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽序列的轻链可变区；
607.(19)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽序列的轻链可变区；
608.(20)具有seq id no:128的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
609.(21)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽序列的轻链可变区；
610.(22)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽序列的轻链可变区；
611.(23)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽序列的轻链可变区；
612.(24)具有seq id no:129的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
613.(25)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:131的多肽序列的轻链可变区；
614.(26)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:132的多肽序列的轻链可变区；
615.(27)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:133的多肽序列的轻链可变区；
616.(28)具有seq id no:130的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:134的多肽序列的轻链可变区；
617.(29)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽序列的轻链可变区；
618.(30)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽序列的轻链可变区；
619.(31)具有seq id no:136的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
620.(32)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽序列的轻链可变区；
621.(33)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽序列的轻链可变区；
622.(34)具有seq id no:137的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
623.(35)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:139的多肽序列的轻链可变区；
624.(36)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:140的多肽序列的轻链可变区；
625.(37)具有seq id no:138的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:141的多肽序列的轻链可变区；
626.(38)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽序列的轻链可变区；
627.(39)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
628.(40)具有seq id no:142的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
629.(41)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽序列的轻链可变区；
630.(42)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
631.(43)具有seq id no:143的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
632.(44)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:145的多肽
序列的轻链可变区；
633.(45)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:146的多肽序列的轻链可变区；
634.(46)具有seq id no:144的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:147的多肽序列的轻链可变区；
635.(47)具有seq id no:148的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:151的多肽序列的轻链可变区；
636.(48)具有seq id no:150的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:153的多肽序列的轻链可变区；
637.(49)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:185的多肽序列的轻链可变区；
638.(50)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:186的多肽序列的轻链可变区；
639.(51)具有seq id no:171的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:187的多肽序列的轻链可变区；
640.(52)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:185的多肽序列的轻链可变区；
641.(53)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:186的多肽序列的轻链可变区；
642.(54)具有seq id no:173的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:187的多肽序列的轻链可变区；
643.(55)具有seq id no:182的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:190的多肽序列的轻链可变区；
644.(56)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:195的多肽序列的轻链可变区；
645.(57)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:196的多肽序列的轻链可变区；
646.(58)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:197的多肽序列的轻链可变区；
647.(59)具有seq id no:183的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:198的多肽序列的轻链可变区；
648.(60)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:195的多肽序列的轻链可变区；
649.(61)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:196的多肽序列的轻链可变区；
650.(62)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:197的多肽序列的轻链可变区；或
651.(63)具有seq id no:184的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:198的多肽序列的轻链可变区。
652.实施方案30是根据实施方案28或29所述的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够结合folr1、诱导效应子介导的肿瘤细胞裂解、介导缀合的药物的募集以及/或者与具有癌症杀伤作用的另一种单克隆抗体或抗原结合片段形成双特异性抗体。
653.实施方案31是一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据实施方案28至30中任一项所述的抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段。
654.实施方案32是一种载体，所述载体包含根据实施方案31所述的分离的核酸。
655.实施方案33是一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方案32所述的载体。
656.实施方案34是一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案28至30中任一项所述的抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
657.实施方案35是一种靶向对其有需要的受试者的癌细胞表面上的folr1的方法，所述方法包括向所述对其有需要的受试者施用包含根据实施方案28至30中任一项所述的人源化抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
658.实施方案36是一种治疗对其有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方案34所述的药物组合物。
659.实施方案37是根据实施方案36所述的方法，其中所述癌症选自肺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿道上皮癌、转移性黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤和其他实体肿瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性淋巴细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、多发性骨髓瘤(mm)、急性髓性白血病(aml)和其他液体肿瘤。
660.实施方案38是一种产生根据实施方案28至30中任一项所述的抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在产生所述单克隆抗体或抗原结合片段的条件下培养包含编码所述单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以及从所述细胞或培养物中回收所述抗体或抗原结合片段。
661.实施方案39是一种产生根据实施方案34所述的药物组合物的方法，所述方法包括将所述单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
662.实施例
663.实施例1：特异性结合folr1的抗原结合结构域的鉴定
664.特异性结合folr1的抗原结合结构域是如2019年3月7日提交的pct/us2019/021084中所述分离和测序的抗folr1 mab，该专利全文以引用方式并入本文。
665.特异性结合folr1的抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区的序列提供于表1和表2中，并且特异性结合folr1的抗原结合结构域的cdr区提供于表3至表6中。
666.表1：特异性结合folr1的抗原结合结构域的重链可变区序列
[0667][0668]
vh：重链可变区
[0669]
表2：特异性结合folr1的抗原结合结构域的轻链可变区序列
[0670][0671]
vl：轻链可变区
[0672]
表3：特异性结合folr1的抗原结合结构域的重链cdr区1至3
[0673]
名称hc cdr1nohc cdr2nohc cdr3nof4gftfsdyg17issgsnti18arlaewdvay19f5gftfsnyg20issggsyt21stqgssgyvgy22f7gysftdyn23idpnygtt24aikgygnpaay25f8gftlstya26isggggdt27arqshygssyyfdn28f10gyafsssw29iypgdgyt30trhgdfpywyfdv31f17gftfsdfg32msytpgtf33arvhvgtvdy34f19gftfsdyw35ignkfhnyet36tklgrgyyvmdy37f20gytfasyy38inprsggt39srsgrlrgfytmdy40
[0674]
hc：重链；cdr：互补决定区；id：seq id no
[0675]
利用imgt方法(lefranc,m.
‑
p.等人，nucleic acids res.，1999年，第27卷，第209页至第212页)测定特异性结合folr1的抗原结合结构域的hc cdr。
[0676]
表4：特异性结合folr1的抗原结合结构域的轻链cdr区1至3
[0677]
名称lc cdr1nolc cdr2nolc cdr3nof4qninnn41fas42qqiyswpqlt43f5qditnf44yts45lqyynlwt46f7qdinky47yts48lqyynlwt49f8enidsy50aat51qhyyttppt52f10enidsy53aat54qhhystppt55f17qninnn56yas57qqsnswpalt58f19qditnh59yts60qqdsqhpwt61f20envgsy62gas63gqtyrflt64
[0678]
lc：轻链；cdr：互补决定区；no：seq id no
[0679]
利用imgt方法(lefranc,m.
‑
p.等人，nucleic acids res.，1999年，第27卷，第209页至第212页)测定特异性结合folr1的抗原结合结构域的lc cdr。
[0680]
表5：特异性结合folr1的抗原结合结构域的重链cdr区1至3
[0681]
名称hc cdr1nohc cdr2nohc cdr3nof4gftfsdygmh65fissgsntiyyadivkg66arlaewdvay67f5gftfsnygms68tissggsytyypdsvkg69stqgssgyvgy70f7gysftdynmn71vidpnygttnynqkfvg72aikgygnpaay73f8gftlstyams74tisggggdtyhldtvkg75arqshygssyyfdn76f10gyafssswmn77riypgdgythyngmfkg78trhgdfpywyfdv79f17gftfsdfgmh80ymsytpgtfhyadtvkd81arvhvgtvdy82f19gftfsdywmn83qignkfhnyetyysdsvkg84tklgrgyyvmdy85f20gytfasyyly86einprsggtnfnekfks87srsgrlrgfytmdy88
[0682]
hc：重链；cdr：互补决定区；no：seq id no
[0683]
利用imgt(lefranc,m.
‑
p.等人，nucleic acids res.，1999年，第27卷，第209页至第212页)和kabat(elvin a.kabat等人，《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(sequences of proteins of immunological interest)》，第5版，1991年)方法的组合测定特异性结合folr1的抗原结合结构域的hc cdr。
[0684]
表6：特异性结合folr1的抗原结合结构域的轻链cdr区1至3
[0685]
名称lc cdr1nolc cdr2nolc cdr3nof4rasqninnnlh89fasqsis90qqiyswpqlt91f5kasqditnfig92ytsiles93lqyynlwt94f7kasqdinkyla95ytsiles96lqyynlwt97f8rvsenidsyla98aatnlad99qhyyttppt100f10rasenidsyla101aatnlav102qhhystppt103
f17rasqninnnlh104yasqsis105qqsnswpalt106f19rasqditnhln107ytsrlhs108qqdsqhpwt109f20kagenvgsyvs110gasnryt111gqtyrflt112
[0686]
lc：轻链；cdr：互补决定区；no：seq id no
[0687]
利用imgt(lefranc,m.
‑
p.等人，nucleic acids res.，1999年，第27卷，第209页至第212页)和kabat(elvin a.kabat等人，《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(sequences of proteins of immunological interest)》，第5版，1991年)方法的组合测定特异性结合folr1的抗原结合结构域的lc cdr。
[0688]
实施例2：小鼠抗folr1 mab的人源化
[0689]
将小鼠抗folr1 mab人源化以降低在人患者中使用时的免疫原性潜力，如2019年3月7日提交的pct/us2019/021084中所述，该专利全文以引用方式并入本文。人源化vh区和vl区的序列示于表7中。人源化vh和vl命名如下：f5
‑
h1是指小鼠mab f5的人源化vh的h1序列；f5
‑
l1是指小鼠mab f5的人源化vl的l1序列。所有其他人源化vh区和vl区采用相同的命名规则。
[0690]
表7：特异性结合folr1的人源化抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区序列
[0691]
[0692]
[0693][0694]
人源化vh区和vl区分别与人igg1重链和κ轻链的恒定区融合。人源化mab命名如下：f5
‑
h1l1是指具有f5
‑
h1重链可变区和f5
‑
l1轻链可变区的mab；所有其他人源化mab采用相同的命名规则。
[0695]
实施例3：人源化mab向单链可变片段(scfv)的转化
[0696]
将人源化mab转化为scfv，其中每个由一个vh和一个vl组成，其间具有(g4s)
n
接头(其中“n”表示g4s重复的数量)。将vh区或vl区置于融合蛋白的n
‑
末端以鉴定最有效的scfv
设计。所设计的scfv的序列示于表8中。scfv命名如下：f5
‑
h2(g4s)3l2是指具有f5
‑
h2重链可变区、(g4s)3接头和f5
‑
l2轻链可变区的scfv；所有其他scfv采用相同的命名规则。
[0697]
表9：特异性结合folr1的人源化scfv的序列
[0698]
[0699][0700]
实施例4：人源化mab和scfv的elisa结合分析
[0701]
为了测试mab和scfv与人folr1的结合，通过在expicho或expi293细胞中瞬时表达，产生mab和与一个g4s接头和人igg4 fc融合的scfv融合蛋白(以scfv、g4s接头和fc从n
‑
末端到c
‑
末端的顺序)。mab或人源化scfv的elisa结合分析的方法在2019年3月7日提交的pct/us2019/021084中有所描述。elisa测定的结果示于图1a至图1l和图3a至图3g中。
[0702]
实施例5：mab和人源化scfv的facs分析
[0703]
还测试了mab和scfv融合蛋白结合表达内源folr1的sk
‑
ov
‑
3细胞的能力。mab或人源化scfv的facs分析方法在2019年3月7日提交的pct/us2019/021084中有所描述，并稍作修改。sk
‑
ov
‑
3细胞以100,000个细胞/孔铺板。在该板的每个孔中，将碘化丙锭与二抗一起孵育以标记死细胞。结合结果示于图2a至图2e和图4a至图4g中。
[0704]
实施例6：包含抗folr1单克隆抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体构建体的构建
[0705]
为了构建car，使用vh、vl和(g4s)n接头将每种mab转化成scfv，并将scfv融合到源自人cd8α的铰链和跨膜结构域的n
‑
末端(aa 114
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188，boursier jp等人，j biol chem.，1993年，第268卷第3期，第2013页至第2020页)。通过融合cd28的胞内共刺激结构域(aa 162
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202，aruffo a和seed b，proc natl acad sci usa，1987年，第84卷第23期，第8573页至第8577页)随后是来自cd3ζ链的激活结构域(aa 52
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162，letournew f和klausner rd，proc.nat'l.acad.sci.usa，1991年，第88卷第20期，第8905页至第8909页)来构建car的c
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末端胞内信号传导结构域。使用标准分子生物学克隆技术，将编码car的dna序列组装并克隆到逆转录病毒载体中以生成car构建体。
[0706]
本领域的技术人员将理解，在不脱离本发明的广义发明构思的情况下，可对上述实施方案进行改变。因此，应当理解，本发明不限于所公开的具体实施方案，但本发明旨在覆盖由本说明书限定的本发明的实质和范围内的修改。