新型抗IFNAR1抗体的制作方法

新型抗ifnar1抗体
发明领域
1.本公开大体上涉及新型抗ifnar1抗体。


背景技术：

2.i型干扰素(ifn
‑
i)包括具有抗病毒、免疫调节和抗增殖活性的一大类细胞因子。ifn
‑
i家族由5个密切相关的成员组成，包含ifnα、ifnβ、ifnε、ifnκ和ifnω。ifnβ在抑制单核细胞分化、抑制病毒复制、诱导人肿瘤细胞的凋亡等方面展现出比ifnα或ifnω高得多的效力(schreiber g等人(2015)《免疫学趋势(trends immunol)》36:139
‑
49)。另一方面，ifnβ极少涉及一些ifn
‑
i相关疾病发病机理，并且这将ifnβ与ifnα和ifnω区分开来(slavikova m等人(2003)《干扰素和细胞因子研究(j interferon cytokine res)》23:143
‑
147,hua j,等人(2006)《关节炎与风湿病学(arthritis rheum)》54:1906
‑
16。)。
3.所有ifn
‑
i都通过被称为ifn
‑
α受体(ifnar)的异二聚体受体进行信号传导，所述受体由ifnar1和ifnar2链组成。ifnar1对于ifnar复合物的高亲和力结合和差异特异性至关重要(cutrone ec等人(2001)《生物化学杂志(j.biol.chem.)》276:17140)。
4.仍需要新型抗ifnar1抗体。


技术实现要素：

5.在整个本公开中，冠词“一(a/an)”和“所述”在本文中用于指一个(种)或超过一个(种)(即，至少一个(种))所述冠词的语法对象。举例来说，“一抗体”意指一种抗体或多于一种抗体。
6.本公开提供抗ifnar1抗体(例如抗人ifnar1)或其抗原结合片段、编码其的分离的多核苷酸、包含其的药物组合物和其用途。
7.在一个方面中，本公开提供一种抗体或其抗原结合片段，其包括重链hcdr1、hcdr2和hcdr3和/或轻链lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中hcdr1包括sx1wx
19
n(seq id no:1)或其至少75％(例如至少75％、至少80％、至少85％)序列一致性的同源序列，hcdr2包括kidpsdsex2x
20
x
21
nqkfx
22
d(seq id no:2)或其至少75％(例如至少75％、至少80％、至少85％)序列一致性的同源序列，hcdr3包括ggx3ix4x5dydx6ax7dy(seq id no:3)或其至少60％(例如至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％)序列一致性的同源序列，lcdr1包括kx
23
seviynrla(seq id no:4)或其至少80％(例如至少80％、至少84％)序列一致性的同源序列，lcdr2包括gatx
24
lex
25
(seq id no:5)或其至少65％序列一致性的同源序列，lcdr3包括qqywx8x9pft(seq id no:6)或其至少65％(例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％)序列一致性的同源序列，其中x1是y或f，x2是t或i，x3是r或g，x4是s或y，x5是f或y，x6是a或g，x7是l或m，x8是n或s，x9是k或s，x
19
是m或l，x
20
是h或r，x
21
是f或y，x
22
是r或k，x
23
是s或a，x
24
是t或s，x
25
是s或t，并且其中所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合于ifnar1，例如人ifnar1。
8.在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括在seq id no:1中
具有不超过3、2或1个氨基酸取代的hcdr1，在seq id no:2中具有不超过6、5、4、3、2或1个氨基酸取代的hcdr2，在seq id no:3中具有不超过6、5、4、3、2或1个氨基酸取代的hcdr3，在seq id no:4中具有不超过2或1个氨基酸取代的lcdr1，在seq id no:5中具有不超过3、2或1个氨基酸取代的lcdr2和/或在seq id no:6中具有不超过3、2或1个氨基酸取代的lcdr3。
9.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括重链hcdr1，其包括选自seq id no:21和25的序列；重链hcdr2，其包括选自seq id no:22和26的序列；和重链hcdr3，其包括选自seq id no:23、27和65的序列。
10.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括轻链lcdr1，其包括选自seq id no:70和72的序列；轻链lcdr2，其包括选自seq id no:71和66的序列；和轻链lcdr3，其包括选自seq id no:24和28的序列。
11.在某些实施方式中，重链hcdr1、hcdr2和hcdr3选自：a)包括seq id no:21序列的hcdr1、包括seq id no:22序列的hcdr2和包括seq id no:23序列的hcdr3；b)包括seq id no:25序列的hcdr1、包括seq id no:26序列的hcdr2和包括seq id no:27序列的hcdr3；及c)包括seq id no:21序列的hcdr1、包括seq id no:22序列的hcdr2和包括seq id no:65序列的hcdr3。
12.在某些实施方式中，轻链lcdr1、lcdr2和lcdr3选自：a)包括seq id no:70序列的lcdr1、包括seq id no:71序列的lcdr2和包括seq id no:24序列的lcdr3；b)包括seq id no:72序列的lcdr1、包括seq id no:66序列的lcdr2和包括seq id no:28序列的lcdr3；及c)包括seq id no:70序列的lcdr1、包括seq id no:66序列的lcdr2和包括seq id no:24序列的lcdr3。
13.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括：a)包括seq id no:21序列的hcdr1、包括seq id no:22序列的hcdr2、包括seq id no:23序列的hcdr3、包括seq id no:70序列的lcdr1、包括seq id no:71序列的lcdr2和包括seq id no:24序列的lcdr3；b)包括seq id no:25序列的hcdr1、包括seq id no:26序列的hcdr2、包括seq id no:27序列的hcdr3、包括seq id no:72序列的lcdr1、包括seq id no:66序列的lcdr2和包括seq id no:28序列的lcdr3；c)包括seq id no:21序列的hcdr1、包括seq id no:22序列的hcdr2、包括seq id no:65序列的hcdr3、包括seq id no:70序列的lcdr1、包括seq id no:71序列的lcdr2和包括seq id no:24序列的lcdr3；d)包括seq id no:21序列的hcdr1、包括seq id no:22序列的hcdr2、包括seq id no:23序列的hcdr3、包括seq id no:70序列的lcdr1、包括seq id no:66序列的lcdr2和包括seq id no:24序列的lcdr3；或e)包括seq id no:21序列的hcdr1、包括seq id no:22序列的hcdr2、包括seq id no:65序列的hcdr3、包括seq id no:70序列的lcdr1、包括seq id no:66序列的lcdr2和包括seq id no:24序列的lcdr3。
14.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包括重链hfr1、hfr2、hfr3和hfr4中的一个或多个和/或轻链lfr1、lfr2、lfr3和lfr4中的一个或多个，其中：a)hfr1包括qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytft(seq id no:33)或其至少80％(例如至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)序列一致性的同源序列，b)hfr2包括wvrqx
10
pgqglewx
11
g(seq id no:34)或其至少80％(例如至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％)序列一致性的同源序列，c)hfr3序列包括rvtx
12
tx
13
dx
14
ststvymelss
lrsedtavyycar(seq id no:35)或其至少80％(例如至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％)序列一致性的同源序列，d)hfr4包括wgqgtlvtvss(seq id no:36)或其至少80％(例如至少85％、至少88％、至少90％)序列一致性的同源序列，e)lfr1包括diqmtqspsslsasvgdrvtitc(seq id no:37)或其至少80％(例如至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％)序列一致性的同源序列，f)lfr2包括wyqqkpgx
15
apkllix
16
(seq id no:38)或其至少80％(例如至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％)序列一致性的同源序列，g)lfr3包括gvpsrfsgsgsgx
17
dx
18
tltisslqpedfatyyc(seq id no:39)或其至少80％(例如至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％)序列一致性的同源序列和h)lfr4包括fgqgtkleik(seq id no:40)或其至少80％(例如至少85％、至少88％、至少90％)序列一致性的同源序列，其中x
10
是a或r，x
11
是m或i，x
12
是m或l，x
13
是r或v，x
14
是t或k，x
15
是k或n，x
16
是y或s，x
17
是t或k，x
18
是f或y。
15.在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括在seq id no:33序列中具有不超过3、2或1个氨基酸取代的hfr1，在seq id no:34序列的序列中具有不超过3、2或1个氨基酸取代的hfr2，在seq id no:35序列中具有不超过6、5、4、3、2或1个氨基酸取代的hfr3，在seq id no:36序列中具有不超过4、3、2或1个氨基酸取代的hfr4，在seq id no:37序列中具有不超过6、5、4、3、2或1个氨基酸取代的lfr1，在seq id no:38序列中具有不超过4、3、2或1个氨基酸取代的lfr2，在seq id no:39序列中具有不超过6、5、4、3、2或1个氨基酸取代的lfr3和/或在seq id no:40序列中具有不超过3、2或1个氨基酸取代的lfr4。
16.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包括重链hfr1，其包括seq id no:33的序列；重链hfr2，其包括选自seq id no:41、42和43的序列；重链hfr3，其包括选自seq id no:44和45的序列；和重链hfr4，其包括seq id no:36的序列。
17.在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包括轻链lfr1，其包括seq id no:37的序列；轻链lfr2，其包括选自seq id no:46、47和48的序列；轻链lfr3，其包括选自seq id no:49和50的序列；和轻链lfr4，其包括seq id no:40的序列。
18.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包括选自以下的重链hfr1、hfr2、hfr3和hfr4的组合：a)包括seq id no:33序列的hfr1、包括seq id no:41序列的hfr2、包括seq id no:44序列的hfr3和包括seq id no:36序列的hfr4；b)包括seq id no:33序列的hfr1、包括seq id no:41序列的hfr2、包括seq id no:45序列的hfr3和包括seq id no:36序列的hfr4；c)包括seq id no:33序列的hfr1、包括seq id no:42序列的hfr2、包括seq id no:45序列的hfr3和包括seq id no:36序列的hfr4；及d)包括seq id no:33序列的hfr1、包括seq id no:43序列的hfr2、包括seq id no:45序列的hfr3和包括seq id no:36序列的hfr4。
19.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包括选自以下的轻链lfr1、lfr2、lfr3和lfr4的组合：a)包括seq id no:37序列的lfr1、包括seq id no:46序列的lfr2、包括seq id no:49序列的lfr3和包括seq id no:40序列的lfr4；b)包括seq id no:37序列的lfr1、包括seq id no:46序列的lfr2、包括seq id no:50序列的lfr3和包括seq id no:40序列的lfr4；c)包括seq id no:37序列的lfr1、包括seq id no:47序列的
lfr2、包括seq id no:50序列的lfr3和包括seq id no:40序列的lfr4；和d)包括seq id no:37序列的lfr1、包括seq id no:48序列的lfr2、包括seq id no:50序列的lfr3和包括seq id no:40序列的lfr4。
20.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(v
h
)，其包括seq id no:7、9、67或51
‑
54的序列或具有其至少80％(例如至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)序列一致性的同源序列。
21.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区(v
l
)，其包括seq id no:8、10、68或55
‑
58的序列或具有其至少80％(例如至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)序列一致性的同源序列。
22.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括a)包括seq id no:7序列的重链可变区和包括seq id no:8序列的轻链可变区；b)包括seq id no:9序列的重链可变区和包括seq id no:10序列的轻链可变区；c)包括seq id no:51序列的重链可变区和包括seq id no:55序列的轻链可变区；d)包括seq id no:52序列的重链可变区和包括seq id no:55序列的轻链可变区；e)包括seq id no:53序列的重链可变区和包括seq id no:55序列的轻链可变区；f)包括seq id no:54序列的重链可变区和包括seq id no:55序列的轻链可变区；g)包括seq id no:51序列的重链可变区和包括seq id no:56序列的轻链可变区；h)包括seq id no:52序列的重链可变区和包括seq id no:56序列的轻链可变区；i)包括seq id no:53序列的重链可变区和包括seq id no:56序列的轻链可变区；j)包括seq id no:54序列的重链可变区和包括seq id no:56序列的轻链可变区；k)包括seq id no:51序列的重链可变区和包括seq id no:57序列的轻链可变区；l)包括seq id no:52序列的重链可变区和包括seq id no:57序列的轻链可变区；m)包括seq id no:53序列的重链可变区和包括seq id no:57序列的轻链可变区；n)包括seq id no:54序列的重链可变区和包括seq id no:57序列的轻链可变区；o)包括seq id no:51序列的重链可变区和包括seq id no:58序列的轻链可变区；p)包括seq id no:52序列的重链可变区和包括seq id no:58序列的轻链可变区；q)包括seq id no:53序列的重链可变区和包括seq id no:58序列的轻链可变区；r)包括seq id no:54序列的重链可变区和包括seq id no:58序列的轻链可变区；s)包括seq id no:67序列的重链可变区和包括seq id no:56序列的轻链可变区；t)包括seq id no:52序列的重链可变区和包括seq id no:68序列的轻链可变区；或u)包括seq id no:67序列的重链可变区和包括seq id no:68序列的轻链可变区。
23.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包括免疫球蛋白恒定区、任选地人免疫球蛋白恒定区或任选地人igg恒定区(例如igg1、igg2、igg3或igg4的恒定区)。在某些实施方式中，恒定区包括一种或多种修饰。在某些实施方式中，所述修饰引入或去除糖基化位点。在某些实施方式中，所述修饰引入游离半胱氨酸残基。在某些实施方式中，所述修饰改变fc介导的效应功能，例如增加或减少的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、补体依赖性细胞毒性(cdc)或fc受体结合。
24.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化单克隆抗体。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，
其抗原结合片段是骆驼化单结构域抗体、双功能抗体、scfv(单链fv)、scfv二聚体、bsfv(双特异性fv)、dsfv、(dsfv)2、dsfv
‑
dsfv'、fv片段、fab、fab'、f(ab')2、ds双功能抗体、纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体。
25.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段抑制ifnα介导和/或ifnω介导的人ifnar1活化。
26.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段不抑制ifnβ介导的人ifnar1活化。
27.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段不抑制ifnβ介导的抗病毒活性。
28.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段对ifnα介导或对ifnω介导的人ifnar1活化或抗病毒活性的抑制作用比其对ifnβ介导的人ifnar1活化或抗病毒活性的抑制作用高至少四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十一倍、十二倍、十三倍、十四倍、十五倍。
29.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段从其天然来源分离。
30.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段与一个或多个结合部分连接。
31.在另一方面中，本公开提供一种抗人ifnar1抗体或其抗原结合片段，其与本文所提供的抗体或其抗原结合片段竞争结合于人ifnar1，并且其中所述抗体或其抗原结合片段不抑制ifnβ介导的人ifnar1活化。
32.在某些实施方式中，如通过biacore所测量，所述抗体或其抗原结合片段能够以不超过8
×
10
‑8m(例如不超过5
×
10
‑8m、不超过2
×
10
‑8m、不超过8
×
10
‑9m、不超过5
×
10
‑9m、不超过2
×
10
‑9m、不超过10
‑9m、不超过8
×
10
‑
10
m、不超过7
×
10
‑
10
m或不超过6
×
10
‑
10
m)的k
d
值特异性结合于人ifnar1。
33.在某些实施方式中，如通过elisa所测量，所述抗体或其抗原结合片段能够以不超过0.1μg/ml(例如不超过0.09μg/ml、不超过0.08μg/ml、不超过0.07μg/ml、不超过0.06μg/ml、不超过0.05μg/ml、不超过0.04μg/ml、不超过0.03μg/ml、不超过0.02μg/ml、不超过0.01μg/ml、不超过0.009μg/ml、不超过0.008μg/ml、不超过0.007μg/ml、不超过0.006μg/ml或不超过0.005μg/ml)的ec
50
值特异性结合于人ifnar1。
34.在另一方面中，本公开提供一种抗人ifnar1抗体或其抗原结合片段，其结合于在ifnar1的氨基酸残基127
‑
227内的第一片段和在ifnar1的氨基酸残基231
‑
329内的第二片段两者，并且不抑制ifnβ介导的ifnar1活化。在某些实施方式中，本文所提供的抗体和抗原结合片段可以特异性结合于人/小鼠嵌合ifnar1(即seq id no:69)。
35.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段不结合于截短的人ifnar1，所述截短的人ifnar1中不存在a)氨基酸残基127
‑
227或b)氨基酸残基231
‑
329。
36.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合于截短的人ifnar1，所述截短的人ifnar1中不存在：a)氨基酸残基32
‑
126，b)氨基酸残基331
‑
432，或a)和b)两者。
37.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以与全长的人ifnar1的结合能力相当的结合能力结合于截短的人ifnar1。
38.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区为小鼠ighv1
‑
69基因、小鼠ighd2
‑
4基因和小鼠ighj4基因的产物或衍生于所述基因；和/
或轻链可变区，所述轻链可变区为小鼠igkv13
‑
84基因和小鼠igkj4基因的产物或衍生于所述基因。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化的。
39.在另一方面中，本公开提供一种由杂交瘤细胞产生的抗体，所述杂交瘤细胞的保藏号为cgmcc保藏号16286或cgmcc保藏号16287；或提供其抗原结合片段。
40.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是双特异性的。
41.在另一方面中，本公开提供了一种分离的多核苷酸，其编码本文提供的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，分离的多核苷酸包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：seq id no:11和13，和其与seq id no:11或13具有至少80％(例如至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)序列一致性的同源序列。在某些实施方式中，分离的多核苷酸进一步包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：seq id no:12和14，和其与seq id no:12或14具有至少80％(例如至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)序列一致性的同源序列。在某些实施方式中，同源序列编码与由seq id no:11、12、13或14编码的氨基酸序列一致的氨基酸序列。
42.在另一方面中，本公开提供一种表达载体，该表达载体包括本文所提供的分离的多核苷酸。
43.在另一方面中，本公开提供了一种宿主细胞，其包含本文所提供的表达载体。在某些实施方式中，宿主细胞能够产生本文所提供的抗体或其抗原结合片段。
44.在另一方面中，本公开提供一种杂交瘤细胞，其保藏号为cgmcc保藏号16286或cgmcc保藏号16287。
45.在另一方面中，本公开提供一种产生本文所提供的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在表达本文所提供的表达载体的条件下培养本文所提供的宿主细胞。在某些实施方式中，所述方法进一步包括纯化由宿主细胞产生的抗体或其抗原结合片段。
46.在另一方面中，本公开提供一种药物组合物，其包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
47.在另一方面中，本公开提供一种治疗受试者的i型ifn相关疾病或病况的方法，其包括施用治疗有效量的本文所提供的抗体或其抗原结合片段或本文所提供的药物组合物。在某些实施方式中，i型ifn为ifnα和/或ifnω。在某些实施方式中，所述疾病或病况的特征在于表达或过度表达i型干扰素(ifn)和/或i型ifn标签基因。在某些实施方式中，所述疾病是hiv感染或aids、胰岛素依赖型糖尿病(iddm)、炎性肠病(ibd)、克罗恩氏病(crohn's disease)、溃疡性结肠炎、乳糜泻、慢性阻塞性肺病(copd)、牛皮癣、自体免疫性甲状腺炎、自体免疫性原发性甲状腺功能减退、格雷夫斯氏病(graves'disease)、桥本氏甲状腺炎(hashimoto's thyroiditis)、破坏性甲状腺炎伴有甲状腺功能减退、肾小球肾炎、iga肾病、igm多发性神经病、重症肌无力、雷诺氏综合征(reynaud's syndrome)、掌跖脓疱病(ppp)、糜烂型扁平苔癣、大疱性天疱疮、大疱性表皮松懈、接触性皮炎和特应性皮炎、多发性神经根炎、全身性红斑狼疮(sle)、肌炎、干燥综合征(syndrome)、类风湿性关节炎、全身性硬化症、硬皮病、多发性硬化症(ms)、特发性炎性肌病(iim)、类风湿性关节炎(ra)、移植排斥反应和移植物抗宿主疾病(gvhd)以及艾卡迪
‑
古特里斯综合征(aicardi
‑
no:26)和cdr3(seq id no:27)的序列。
60.图9显示抗人ifnar1单克隆抗体10c5的轻链可变区的核苷酸序列(seq id no:14)和氨基酸序列(seq id no:10)。阴影分别显示轻链的cdr1(seq id no:72)、cdr2(seq id no:66)和cdr3(seq id no:28)的序列。
61.图10显示抗人ifnar1单克隆抗体7g4(seq id no:7)和10c5(seq id no:9)的重链可变区的氨基酸序列与由小鼠v区的原始vdj基因编码的氨基酸序列(seq id no:15)的比对结果。还在比对中显示了鼠类物种的重链可变区的共有序列。
62.图11显示抗人ifnar1单克隆抗体7g4(seq id no:8)和10c5(seq id no:10)的轻链可变区的氨基酸序列与由小鼠v区的原始vj基因编码的氨基酸序列(seq id no:16)的比对结果。还在比对中显示了鼠类物种的轻链可变区的共有序列。
63.图12显示人源化7g4变体(即hu4
‑
6、hu4
‑
13至hu4
‑
16)的elisa结合分析结果的结果。
64.图13显示hu7g4变体(即hu4
‑
5至hu4
‑
16)对由ifnα(图13a)介导但不由ifnβ(图13b)介导的人ifnar1活化的阻断活性。水平轴线指示测试抗体或模拟或同种型的对照。“5”意指hu4
‑
5，以下类推。
65.图14a
‑
14d显示，如通过流式细胞测量术所测量，抗体7g4和10c5在不同于由现有抗体10c2和10c9结合的位点处结合于人ifnar1。ifnar1
‑
wt：野生型人ifnar1；ifnar1
‑
m149
‑
214：其中氨基酸残基149
‑
214被小鼠ifnar1单应序列置换的人ifnar1。人ifnar1的氨基酸残基149
‑
214对于抗体10c2和10c9的结合为所需的(图14a和14b)，但显示在抗体7g4和10c5的结合中起不同作用，且因此将抗体7g4和10c5与抗体10c2和10c9区分开来。
66.图15a
‑
15b显示具有一个、两个或三个突变的人源化7g4抗体仍展现与人ifnar1类似的结合特性。图15a显示具有与人ifnar1类似的结合效率的两种7g4人源化抗体hu4
‑
6和hu4
‑
13；图15b显示所有三种hu4
‑
6突变体以类似的结合效率结合于人ifnar1。hu4
‑6‑
mut
‑
1：在vh中有a108g；hu4
‑6‑
mut
‑
2：在vl中有t53s和s56t；hu4
‑6‑
mut
‑
3：在vh中有a108g和在vl中有t53s和s56t。
67.图16显示本文中所提及的seq id no:1
‑
seq id no:72的序列。
具体实施方式
68.以下对本公开的描述仅打算说明本公开的各种实施方式。因此，所论述的具体修改不应被解释为对本公开范围的限制。对本领域的技术人员将显而易见的是，可以在不脱离本公开范围的情况下作出各种等效物、变化和修改，并且应理解，这些等效实施方式将包括在本文中。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均以全文引用的方式并入本文中。
69.定义
70.如本文所用，术语“抗体”包含与特异性抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、一价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。天然完整抗体包括两条重(h)链和两条轻(l)链。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由可变区(v
h
)以及第一、第二、第三和任选存在的第四恒定区(分别为c
h1
、c
h2
、c
h3
、c
h4
)组成；哺乳动物轻链分类为λ或κ，而每条轻链由可变区(v
l
)和恒定区组成。抗体呈“y”形，其中y的茎部由通
过二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区组成。y的每个臂包含与单一轻链的可变区和恒定区结合的单一重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链的可变区一般含有三个高度可变的环，称为互补决定区(cdr)(轻链cdr包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，重链cdr包含hcdr1、hcdr2、hcdr3)。本文中所公开的抗体和抗原结合片段的cdr边界可通过kabat、imgt、chothia或al
‑
lazikani的约定来限定或鉴定(al
‑
lazikani,b.,chothia,c.,lesk,a.m.,《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》,273(4),927(1997)；chothia,c.等人,《分子生物学杂志》12月5日；186(3):651
‑
63(1985)；chothia,c.和lesk,a.m.,《分子生物学杂志》196,901(1987)；chothia,c.等人,《自然(nature)》.12月21
‑
28日；342(6252):877
‑
83(1989)；kabat e.a.等人,免疫学相关蛋白质的序列(sequences of proteins of immunological interest),第5版.马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院公共卫生署(public health service,national institutes of health,bethesda,md.)(1991)；marie
‑
paule lefranc等人,《发育与比较免疫学(developmental and comparative immunology)》,27:55
‑
77(2003)；marie
‑
paule lefranc等人,《免疫组学研究(immunome research)》,1(3),(2005)；marie
‑
paule lefranc,b细胞分子生物学(molecular biology of b cells)(第二版),第26章,481
‑
514,(2015))。三个cdr插入在称为框架区(fr)的侧翼片段之间，框架区比cdr更高度保守，并形成一个支撑高变环的支架。重链和轻链的恒定区不涉及抗原结合，但展现出各种效应功能。基于抗体重链恒定区的氨基酸序列，将抗体分类。抗体的五个主要类别或同种型是iga、igd、ige、igg和igm，分别以α、δ、ε、γ和μ重链的存在为特征。将数种主要抗体类别划分为亚类，如igg1(γ1重链)、igg2(γ2重链)、igg3(γ3重链)、igg4(γ4重链)、iga1(α1重链)或iga2(α2重链)。
71.如本文所使用，术语“二价”是指具有两个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；术语“一价”是指仅具有单一抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；并且术语“多价”是指具有多个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段为二价。
72.如本文所用，“双特异性”抗体是指具有来源于两种不同单克隆抗体的片段且能够与两种不同的表位结合的人工抗体。两个表位可存在于同一抗原上，或其可存在于两种不同抗原上。
73.如本文所用，术语“抗原结合片段”是指由包括一个或多个cdr的抗体的一部分形成的抗体片段，或与抗原结合但不包括完整天然抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段的实例包括但不限于双功能抗体、fab、fab'、f(ab')2、fv片段、二硫键稳定化的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv
‑
dsfv')、二硫键稳定化的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scfv)、scfv二聚体(二价双功能抗体)、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。抗原结合片段能够与亲本抗体所结合的相同抗原结合。
74.与抗体有关的“fab”是指抗体的由通过二硫键结合至单一重链的可变区和第一恒定区的单一轻链(可变区和恒定区)组成的部分。
[0075]“fab'”是指包含一部分铰链区的fab片段。
[0076]“f(ab')
2”是指fab'的二聚体。关于抗体的“fv”是指最小的带有完整抗原结合位
点的抗体片段。fv片段由与单一重链的可变区结合的单一轻链的可变区组成。
[0077]“dsfv”是指二硫键稳定化fv片段，其中在单一轻链的可变区与单一重链的可变区之间的键联是二硫键。在一些实施方式中，“(dsfv)
2”或“(dsfv
‑
dsfv')”包括三条肽链：通过肽连接子(例如较长柔性连接子)连接且分别通过二硫桥键与两个v
l
部分结合的两个v
h
部分。在一些实施方式中，dsfv
‑
dsfv'具有双特异性，其中每一二硫键配对的重链和轻链具有不同抗原特异性。
[0078]“单链fv抗体”或“scfv”是指由轻链可变区和重链可变区直接或通过肽连接子序列彼此连接组成的工程改造的抗体(huston js等人《美国国家科学院院刊(proc natl acad sci usa)》,85:5879(1988))。
[0079]
与抗体(例如igg、iga或igd同种型的抗体)有关的“fc”是指抗体的由通过二硫键与第二重链的第二和第三恒定结构域结合的第一重链的第二和第三恒定结构域组成的部分。关于igm和ige同种型抗体的fc进一步包括第四恒定结构域。抗体的fc部分负责各种效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和补体依赖性细胞毒性(cdc)，但不在抗原结合中起作用。
[0080]“单链fv
‑
fc抗体”或“scfv
‑
fc”是指由连接至抗体fc区的scfv组成的工程改造的抗体。
[0081]“骆驼化单结构域抗体”、“重链抗体”或“hcab”是指含有两个v
h
结构域且不含轻链的抗体(riechmann l.和muyldermans s.,《免疫学方法杂志(j immunol methods)》.12月10日；231(1
‑
2):25
‑
38(1999)；muyldermans s.,《生物技术杂志(j biotechnol)》.6月；74(4):277
‑
302(2001)；wo94/04678；wo94/25591；美国专利第6,005,079号)。重链抗体最初衍生自骆驼科(camelidae)(骆驼、单峰骆驼和美洲驼)。尽管缺乏轻链，但骆驼化抗体具有真实的抗原结合谱系(hamers
‑
casterman c.等人,《自然》.6月3日；363(6428):446
‑
8(1993)；nguyen vk.等人《免疫遗传学(immunogenetics)》.4月；54(1):39
‑
47(2002)；nguyen vk.等人《免疫学(immunology)》.5月；109(1):93
‑
101(2003))。重链抗体的可变结构域(vhh结构域)代表由后天免疫反应产生的已知最小的抗原结合单元(koch
‑
nolte f.等人，《美国实验生物学学会联合会杂志(faseb j)》11月；21(13):3490
‑
8.电子版2007年6月15日(2007))。
[0082]“纳米抗体”是指由来自重链抗体的vhh结构域和两个恒定结构域ch2和ch3组成的抗体片段。
[0083]“双功能抗体”或“dab”包含具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述片段包括同一多肽链中与v
l
结构域连接的v
h
结构域(v
h
‑
v
l
或v
l
‑
v
h
)(参见例如holliger p.等人，《美国国家科学院院刊》7月15日；90(14):6444
‑
8(1993)；ep404097；wo93/11161)。通过使用过短以使得同一链上的两个结构域之间不能配对的连接子，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。所述抗原结合位点可靶向相同或不同的抗原(或表位)。在某些实施方式中，“双特异性ds双功能抗体”是靶向两个不同抗原(或表位)的双功能抗体。在某些实施方式中，“scfv二聚体”是二价双功能抗体或二价scfv(bsfv)，其包括v
h
‑
v
l
(由肽连接子连接)与另一个v
h
‑
v
l
部分二聚，使得一个部分的v
h
与另一个部分的v
l
配位并形成可靶向相同抗原(或表位)或不同抗原(或表位)的两个结合位点。在其它实施方式中，“scfv二聚体”是双特异性双功能抗体，其包括v
h1
‑
v
l2
(由肽连接子连接)与v
l1
‑
v
h2
(也由肽连接子连接)结合，使得v
h1
与v
l1
配位且v
h2
与v
l2
配位并且每个配位对具有不同的抗原特异
性。
[0084]“结构域抗体”是指仅含重链的可变区或轻链的可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或更多个v
h
结构域用肽连接子共价接合，产生二价或多价结构域抗体。二价结构域抗体的两个v
h
结构域可靶向相同或不同的抗原。
[0085]
如本文所使用，术语“嵌合”意指重链和/或轻链中的一部分来源于一个物种且重链和/或轻链中的其余部分来源于不同物种的抗体或抗原结合片段。在一示意性实例中，嵌合抗体可包括来源于人的恒定区和来源于如小鼠的非人动物的可变区。在一些实施方式中，非人动物是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。
[0086]
如本文所用，术语“人源化”意指抗体或抗原结合片段包括来源于非人动物的cdr、来源于人的fr区，和在适用时，来源于人的恒定区。
[0087]
如本文所用，“ifnar1”是指来源于如灵长类动物(例如人、猴)的哺乳动物的干扰素α受体1。在某些实施方式中，ifnar1为人ifnar1。人ifnar1的示例性序列包含人ifnar1蛋白质(ncbi参考序列第np_000620.2号)。ifnar1的示例性序列包含恒河猕猴(macaca mulatta)(恒河猴)ifnar1蛋白质(ncbi参考序列号np_001253442.1)、食蟹猕猴(macaca fascicularis)(食蟹猴)ifnar1蛋白质(ncbi参考序列第xp_005548866.2号或第xp_015302385.1号或第xp_005548864.1号或第xp_005548865.1号)。
[0088]
ifnar1为两种跨膜蛋白质中的一种，i型干扰素(ifn
‑
i)通过其进行信号传导。已知ifnar1通过ifn
‑
i的活化引起抗病毒活性以及抗细菌、抗原虫、免疫调节、抗增殖活性和细胞生长调节功能。
[0089]
ifn
‑
i是一大类对广泛多种细胞类型具有多重效应的结构上相关的细胞因子。在某些实施方式中，ifn
‑
i是人ifn
‑
i。ifn
‑
i家族由5个密切相关的成员组成，包含ifnα、ifnβ、ifnε、ifnκ和ifnω。ifnα具有总共13种亚型，包含ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna8、ifna10、ifna13、ifna14、ifna16、ifna17和ifna21，其中ifna1和ifna13具有相同氨基酸序列。如本文所用，“ifnα”涵盖ifnα的所有亚型。
[0090]“ifnω”为另一种ifn
‑
i，其由至少5个假基因和1个展现与ifn
‑
α基因的70％同源性的功能基因编码。
[0091]“ifn
‑
β”由与ifnα基因具有约50％同源性的单拷贝基因编码。与ifnα或ifnω相比，ifnβ对于细胞表面受体具有基本上更高的整体亲和力。因此，ifnβ(而非ifnα或ifnω)以独立于ifnar2的方式结合于ifnar1，并且ifnar1
‑
ifnβ复合物以更有效方式转导信号。据信，ifnβ在抑制单核细胞分化、抑制病毒复制、诱导人肿瘤细胞的凋亡等中展现比ifnα或ifnω高得多的效力。
[0092]
术语“抗ifnar1抗体”是指能够特异性结合于ifnar1(例如人或猴ifnar1)的抗体。术语“抗人ifnar1抗体”是指能够特异性结合于人ifnar1的抗体。
[0093]
如本文所用，术语“特异性结合(specific binding/specifically binds)”是指两个分子之间，如例如抗体和抗原之间的非随机结合反应。特异性结合的特征可在于结合亲和力，例如由k
d
值表示，即，当抗原与抗原结合分子之间的结合达到平衡时，解离速率与结合速率的比率(k
off
/k
on
)。k
d
可通过使用本领域中已知的任何常规方法确定，所述方法包含但不限于表面等离子体共振法、微量热泳法、hplc
‑
ms法和流式细胞测量术(如facs)方法。≤10
‑6m(例如≤5
×
10
‑7m、≤2
×
10
‑7m、≤10
‑7m、≤5
×
10
‑8m、≤2
×
10
‑8m、≤10
‑8m、≤5
×
10
‑9m、≤4
×
10
‑9m、≤3
×
10
‑9m、≤3
×1‑9m或≤10
‑9m)的k
d
值可指示抗体或其抗原结合片段与ifnar1(例如人ifnar1)之间的特异性结合。
[0094]
如本文所用，“竞争相同表位”的能力是指抗体或抗原结合片段以任何可检测程度抑制两个分子(例如人ifnar1和抗ifnar1抗体)之间的结合相互作用的能力。在某些实施方式中，阻断两个分子之间的结合的抗体或抗原结合片段将两个分子之间的结合相互作用抑制至少85％或至少90％。在某些实施方式中，此抑制可大于95％，或大于99％。
[0095]
如本文所用的术语“表位”是指抗体所结合的抗原上特定的一组原子或氨基酸。如果两个抗体对某个抗原呈现竞争性结合，那么其可以结合所述抗原内的相同或紧密相关的表位。表位可以是线性或构象的(即，包含间隔开的氨基酸残基)。举例来说，如果抗体或抗原结合片段阻断参考抗体与抗原的结合至少85％、或至少90％或至少95％，那么抗体或抗原结合片段可视为结合与参考抗体相同/紧密相关的表位。
[0096]
本领域的技术人员将认识到，有可能在无过度实验的情况下，通过确认给定抗体是否阻止本公开抗体结合于ifnar1抗原多肽来确定前者是否与后者(例如小鼠单克隆抗体7g4和10c5，以及人源化抗体hu4
‑
1、hu4
‑
2、hu4
‑
3、hu4
‑
4、hu4
‑
5、hu4
‑
6、hu4
‑6‑
mut
‑
1、hu4
‑6‑
mut
‑
2、hu4
‑6‑
mut
‑
3、hu4
‑
7、hu4
‑
8、hu4
‑
9、hu4
‑
10、hu4
‑
11、hu4
‑
12、hu4
‑
13、hu4
‑
14、hu4
‑
15、hu4
‑
16)结合于相同或紧密相关的表位。如果给定抗体与本公开的抗体竞争，如通过本公开的抗体与ifnar1抗原多肽的结合减少所展示，那么两种抗体结合于相同或密切相关的表位。或者，如果给定抗体与ifnar1抗原多肽的结合由本公开的抗体抑制，那么两种抗体结合于相同或紧密相关的表位。
[0097]
关于氨基酸序列的“保守取代”是指用具有生理化学特性类似的侧链的不同氨基酸残基置换氨基酸残基。举例来说，可在具有疏水性侧链的氨基酸残基(例如met、ala、val、leu和ile)间、具有中性亲水性侧链的残基(例如cys、ser、thr、asn和gln)间、具有酸性侧链的残基(例如asp、glu)间、具有碱性侧链的氨基酸(例如his、lys和arg)间或具有芳香族侧链的残基(例如trp、tyr和phe)间进行保守取代。如本领域中已知，保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著变化，并且因此可保持蛋白质的生物活性。
[0098]
如本文所用，术语“同源”是指在最佳比对时，与另一序列具有至少60％(例如至少65％、70％、75％、80％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的核酸序列(或其互补股)或氨基酸序列。
[0099]
与氨基酸序列(或核酸序列)有关的“序列一致性百分比(％)”定义为在对准候选序列与参考序列并在必要时，引入空位以使一致氨基酸(或核酸)达到最大数量之后，该候选序列中与该参照序列中的氨基酸(或核酸)残基一致的氨基酸(或核酸)残基的百分比。氨基酸残基的保守取代可视为或可不视为一致残基。出于确定氨基酸(或核酸)序列一致性百分比的目的进行的比对可以例如使用可公开获得的工具，如blastn、blastp(可在美国国家生物技术信息中心(ncbi)的网站上获得，另参见altschul s.f.等人,《分子生物学杂志》,215:403
‑
410(1990)；stephen f.等人,《核酸研究(nucleic acids res.)》,25:3389
‑
3402(1997))、clustalw2(可在欧洲生物信息研究所(european bioinformatics institute)网站上获得，另参见higgins d.g.等人,《酶学方法(methods in enzymology)》,266:383
‑
402(1996)；larkin m.a.等人,《生物信息学(bioinformatics)》(英格兰牛津(oxford,england)),23(21):2947
‑
8(2007))和align或megalign(dnastar)软件实现。本领域的技术
人员可使用所述工具提供的默认参数，或可定制适于比对的参数，如例如通过选择合适算法进行。
[0100]
如本文所用，“效应功能”是指由抗体fc区与其效应物，如c1复合物与fc受体结合引起的生物活性。示例性效应功能包含：由抗体与c1复合物上的c1q的相互作用介导的补体依赖性细胞毒性(cdc)；由抗体fc区与效应细胞上的fc受体的结合介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；和吞噬作用。可以使用各种分析(如fc受体结合分析、c1q结合分析和细胞溶解分析)评估效应功能。
[0101]“分离”的物质已通过人工方式自天然状态改变。如果“分离的”组合物或物质存在于自然界中，则该组合物或物质已经从其原始环境改变或从其原始环境移出，或这两种情况都有。例如，天然地存在于活的动物体内的多核苷酸或多肽不是“分离”的，但如果该多核苷酸或多肽与其天然状态的共存物质充分地分离，由此以大体上纯的状态存在，则该多核苷酸或多肽是“分离的”。“分离的核酸序列”是指分离的核酸分子的序列。在某些实施方式中，“分离的抗体或其抗原结合片段”是指如通过电泳法(如sds
‑
page、等电聚焦、毛细管电泳)或色谱法(如离子交换色谱或反相hplc)所测定，纯度为至少60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗体或抗原结合片段。
[0102]
如本文所用，术语“载体”是指一种运载体(vehicle)，可将基因元件可操作地插入其中，以实现所述基因元件的表达，从而产生由所述基因元件编码的蛋白质、rna或dna，或复制所述基因元件。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其携带的基因元件在宿主细胞内表达。载体的实例包含质粒；噬菌粒；粘粒；人工染色体，如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1衍生的人工染色体(pac)；噬菌体，如λ噬菌体或m13噬菌体；和动物病毒。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包含启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。另外，载体可以含有复制起点。载体还可以包含有助于其进入细胞的物质，包含但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包膜。载体可以是表达载体或克隆载体。本公开提供了含有本文提供的编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列、至少一个与所述核酸序列可操作地连接的启动子(例如sv40、cmv、ef
‑
1α)和至少一个选择标记的载体(例如表达载体)。
[0103]
如本文所用，短语“宿主细胞”是指可将或已将外源多核苷酸和/或载体引入其中的细胞。
[0104]
如本文所用的病况的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括预防或减轻病况，减缓病况的发作或发展速率，降低罹患病况的风险，预防或延迟与病况相关的症状的发展，减少或消除与病况相关的症状，产生病况的完全或部分消退，治愈病状或其某种组合。
[0105]
如本文所用，“i型ifn相关”疾病或病况是指由i型ifn的表达或活性增加或降低所引起、加剧或以其它方式与其有关的任何疾病或病况。在一些实施方式中，i型ifn相关疾病或病况为免疫相关病症，如例如自身免疫疾病。在某些实施方式中，i型ifn相关疾病或病况的特征在于表达或过度表达i型干扰素(ifn
‑
i)和/或i型ifn标签基因。
[0106]
术语“药学上可接受的”指示，指定载体、媒剂、稀释剂、赋形剂和/或盐一般在化学上和/或物理上与构成配制物的其它成分相容，并且在生理上与其接受者相容。
[0107]
抗ifnar1抗体
[0108]
本公开提供抗ifnar1抗体和其抗原结合片段。本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段能够特异性结合于ifnar1。
[0109]
在某些实施方式中，通过biacore分析，本文所提供的抗体和其片段以不超过8
×
10
‑8m、不超过5
×
10
‑8m、不超过2
×
10
‑8m、不超过8
×
10
‑9m、不超过5
×
10
‑9m、不超过2
×
10
‑9m、不超过10
‑9m、不超过8
×
10
‑
10
m、不超过7
×
10
‑
10
m或不超过6
×
10
‑
10
m的k
d
值特异性结合于人ifnar1。biacore分析是基于表面等离子体共振技术，参见例如murphy,m.等人,《最新蛋白质科学实验指南(current protocols in protein science)》,第19章,第19.14单元,2006。
[0110]
抗体与人ifnar1的结合也可由“半数最大有效浓度”(ec
50
)值表示，ec
50
是指观察到其最大结合的50％时的抗体浓度。ec
50
值可以通过本领域中已知的结合分析，例如夹心分析，如酶联免疫吸附分析(elisa)、流式细胞测量分析和其它结合分析来测量。在某些实施方式中，如通过elisa所测，本文所提供的抗体和其片段以不超过0.1μg/ml、不超过0.09μg/ml、不超过0.08μg/ml、不超过0.07μg/ml、不超过0.06μg/ml、不超过0.05μg/ml、不超过0.04μg/ml、不超过0.03μg/ml、不超过0.02μg/ml、不超过0.01μg/ml、不超过0.009μg/ml、不超过0.008μg/ml、不超过0.007μg/ml、不超过0.006μg/ml或不超过0.005μg/ml的ec
50
值(即50％结合浓度)特异性结合于人ifnar1。
[0111]
本文所提供的抗ifnar1抗体和其抗原结合片段在覆盖ifnar1的氨基酸残基127
‑
227内的第一片段和ifnar1的氨基酸残基231
‑
329内的第二片段两者的表位处结合于人ifnar1。
[0112]
未经处理的人ifnar1表达产物由557个氨基酸组成，包含具有409个残基的胞外结构域(ecd)、具有21个残基的跨膜结构域和具有100个残基的胞内结构域。ifnar1的ecd由两个结构域，即结构域1和结构域2构成，这两个结构域被三元脯氨酸基元分隔开。每一结构域由大约200个残基构成且可进一步细分成具有大约100个氨基酸的两个同源子结构域。因此，ifnar1的ecd可以划分成四个子结构域：子结构域1(从野生型人ifnar1的氨基酸残基32跨至126，即seq id no:17)、子结构域2(即来自野生型人ifnar1的氨基酸残基127
‑
227，即seq id no:18)、子结构域3(从野生型人ifnar1的氨基酸残基231
‑
329，即seq id no:19)和子结构域4(从野生型人ifnar1的氨基酸残基331
‑
432残基，即seq id no:20)。
[0113]
在ifnar1的氨基酸残基127
‑
227内的第一片段(子结构域2)可以具有任何合适的长度，足以构成抗体结合的表位的一部分(例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、25、40、50、60、70、80或90个氨基酸残基)，并且可以处于ifnar1的子结构域2内的任何合适位置(例如处于氨基酸残基127或227附近或处于氨基酸残基127和227之间某处)。
[0114]
类似地，在ifnar1的氨基酸残基231
‑
329内的第二片段(子结构域3)可以具有任何合适的长度，足以构成抗体结合的表位的一部分(例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、25或40个氨基酸残基)，并且可以处于ifnar1的子结构域3内的任何合适位置(例如处于氨基酸残基231或329附近或处于氨基酸残基231和329之间某处)。
[0115]
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和抗原结合片段可以特异性结合跨越子结构域2与子结构域3之间的间隔序列。在某些实施方式中，本文所提供的抗体和抗原结合片段可以特异性结合于覆盖氨基酸残基227
‑
231的片段或氨基酸残基226
‑
232的片段的表位。另一方面，本文所提供的抗体和抗原结合片段不需要结合于子结构域2或子结构域3的全长
上的每一个残基。可以在子结构域2内具有至少一个结合位点和在子结构域3内具有至少一个额外的结合位点，并且因此展现与子结构域2和子结构域3两者的结合。在某些实施方式中，本文所提供的抗体和抗原结合片段可以特异性结合于包括人野生型ifnar1序列但其中氨基酸残基149
‑
214被小鼠ifnar1对应物替换的人/小鼠嵌合ifnar1(即seq id no:69)。
[0116]
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段不结合于截短的ifnar1，所述截短的ifnar1中不存在a)氨基酸残基127
‑
227(子结构域2)或b)氨基酸残基231
‑
329(子结构域3)。如本文所用，“截短的ifnar1”是指与野生型ifnar1在其它方面相同的经修饰ifnar1，不同之处在于一个或多个片段缺失或被显著不同的片段，如丙氨酸或聚丙氨酸替换。本文所提供的抗体或其抗原结合片段无法结合于缺乏子结构域2或缺乏子结构域3或缺乏两者的截短ifnar1。这表明ifnar1的子结构域2内的结合位点和子结构域3内的结合位点对于本文所提供的抗体和其抗原结合片段特异性结合于ifnar1都是必要的并且必不可少的。不存在子结构域2或子结构域3或这两者足以减弱或消除本文所提供的抗体和其抗原结合片段的ifnar1特异性结合。另一方面，这可另外或替代地表明，子结构域2与子结构域3之间的相交对于本文所提供的抗体和其抗原结合片段特异性结合于ifnar1为潜在所需的。
[0117]
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段能够特异性结合于截短的ifnar1，所述截短的ifnar1中不存在：a)氨基酸残基32
‑
126(子结构域1)，b)氨基酸残基331
‑
432(子结构域4)，或a)和b)两者。子结构域1、子结构域4或这两者对于抗体和其抗原结合片段的ifnar1特异性结合并非所需的(或甚至可省去的)。
[0118]
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合于不存在子结构域1、不存在子结构域4或两者都不存在的截短ifnar1，其结合能力相当于与全长的ifnar1的结合能力。
[0119]
如本文所用，“结合能力”是指分子(如抗体)结合于另一分子(如抗原)的能力。所述能力可以使用本领域中已知的任何合适的结合分析通过例如与所关注抗原的结合活性来测量。举例来说，所关注的抗体可以经标记以允许直接定量与抗原的结合活性。对于另一实例，所关注的抗体(即初级抗体)与其抗原的结合活性还可以通过使用标记的二级抗体(例如抗物种抗体)检测，所述标记的二级抗体通过结合于复合物中的初级抗体检测初级抗体与其抗原结合的复合物，并且因此间接定量结合活性。标记的抗体可以通过例如酶联免疫吸附分析(elisa，例如其中标记是酶)、流式细胞测量术(例如其中标记是荧光的)、蛋白质印迹(例如其中标记是荧光或放射性配位体)、比色法、基于化学发光的方法等检测。
[0120]
如果如在等效分析条件下所检测，与不同抗原的结合活性差异不超过20％(例如不超过15％、10％、8％、5％)，那么对不同抗原的结合能力被视为相当的。如本文所用，“等效分析条件”是指在相同或等效浓度的抗体或抗原下相对于相同或等效对照物测试、在相同或等效条件等下检测的相同分析类型。
[0121]
本文所提供的抗体和抗原结合片段不抑制ifnβ介导的ifnar1活化。ifnβ，如同其它ifn
‑
i，如ifnα和ifnω，可以结合于ifnar1并且诱导ifnar1活化。如本文所用，“ifnβ介导的ifnar1活化”意指ifnβ介导的或反应于ifnβ的存在的ifnar1活化。许多分析可用于确定ifnar1活化。非限制性实例包含在存在感兴趣的ifn
‑
i的情况下或在存在含有一个或多个ifn
‑
i的生物样品(如来自sle患者的血浆样品)的情况下所测定的道迪(daudi)细胞增殖、干扰素刺激反应元件(isre)连接的报告基因表达的活化、ifn
‑
i效应基因(例如mx2和
isg15)表达、通过外周血单核细胞(pbmc)进行的ip
‑
10表达、树突状细胞发育和抗病毒活性。因此，ifnβ介导的ifnar1活化可以在存在ifnβ情况下相对于不存在ifnβ情况下使用针对ifnar1活化的任何合适分析来确定。
[0122]“不抑制ifnβ介导的ifnar1活化”的抗体或抗原结合片段是指，与不存在抗体的情况下或在存在等效浓度的对照抗体(如不结合于ifnβ的同种型对照抗体)的情况下所测值相比，在等效分析条件下，所述抗体或抗原结合片段在对ifnβ介导的ifnar1活化水平展现出小于20％的抑制。对照抗体可以是已知不干扰ifnβ介导的ifnar1活化的任何抗体。这可以包含例如不结合于ifnar1和ifnβ的抗体。
[0123]
在某些实施方式中，与在不存在抗体的情况下或存在等效浓度的对照抗体(如不结合于ifnar1的同种型对照抗体)的情况下所测量的基线ifnβ介导的ifnar1活化相比，在等效分析设定下，本文所提供的抗体或其抗原结合片段在合适的ifnar1活化分析中抑制不超过20％、不超过15％、不超过10％、不超过8％、不超过5％、不超过2％或不超过1％的ifnβ介导的ifnar1活化。
[0124]
在某些实施方式中，ifnar1活化分析为ifn
‑
i报告物分析，例如如pct公开号wo2018/010140中所描述。简单来说，报告细胞系通过在如mx2和isg 15的ifn效应基因的启动子的控制下制造报告基因(如绿色荧光蛋白gfp)来构造。在ifn
‑
i(例如ifnβ)存在下，ifnar1将被活化，并且这将随后引起mx2或isg 15启动子的活化，其接着引发报告基因的表达。可以通过如流式细胞测量术的方便的方法分析报告基因信号。报告基因信号的强度或报告基因信号的阳性细胞数目可以指示ifnar1活化水平。在等效分析条件下，与在不存在抗体的情况下或在存在等效浓度的对照抗体(如同种型对照抗体)的情况下测量的活化信号抑制的基线水平相比，抑制由ifn
‑
i介导的ifnar1活化或ifn
‑
i与ifnar1的结合的抗体或其抗原结合片段抑制由ifn
‑
i介导的更多ifnar1活化信号。
[0125]
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段抑制ifnα介导和/或ifnω介导的ifnar1活化。如本文所用，“ifnα介导的ifnar1活化”和“ifnω介导的ifnar1活化”分别意指由ifnα或ifnω的存在而介导或响应的ifnar1活化。类似地，ifnα和/或ifnω介导的ifnar1活化可以分别在存在ifnα和ifnω情况下相对于不存在ifnα和ifnω情况下，通过如上文所描述的适用于确定ifnar1活化的任何分析来确定。
[0126]
在某些实施方式中，与分别在不存在抗体的情况下或在存在等效浓度的对照抗体(如不结合于ifnar1的同种型对照抗体)的情况下所测量的基线ifnα和/或ifnω介导的ifnar1活化相比，在等效分析条件下，所述抗体或其抗原结合片段在合适的ifnar1活化分析中抑制至少约30％、至少约40％、至少约50％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％或约100％的ifnα和/或ifnω介导的ifnar1活化。此类对照抗体可以是已知不干扰ifnα和/或ifnω介导的ifnar1活化的任何抗体。这可以包括例如不结合于ifnar1、ifnα和ifnω的抗体。
[0127]
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段不抑制ifnβ介导的抗病毒活性。
[0128]
如本文所用，由干扰素介导的术语“抗病毒活性”是指干扰素降低病毒活性(例如病毒的感染性、复制或活力)的能力。可以使用本领域中已知的任何合适的方法测定抗病毒活性的抑制。示例性方法涉及，一般来说，在测试抗体或其抗原结合片段存在下，将预接种
的表达ifnar1的细胞与所关注的干扰素(例如ifnβ)一起培育一天，例如随后进行病毒攻击另外一天，且接着通过定量培养物中剩余的活细胞的量，在溶解细胞之后定量培养物中的病毒效价，或定量经感染细胞上形成的菌斑来确定抗病毒活性。另一示例性方法涉及培育含有报告基因构造体如sinv
‑
luc(《病毒学杂志(j virol.)》2016年10月28日；90(22):10247
‑
10258.)和flu
‑
luc(《胸部疾病杂志(j thorac dis.)》2018年7月；10(增刊19):s2230
‑
s2237.)的细胞，使得如果细胞感染病毒，那么将诱导报告基因表达。
[0129]
在某些实施方式中，抗体和其抗原结合片段在相同类型的病毒活性分析中在等效分析条件下展现出与在不存在抗体的情况下或在存在相同浓度的对照抗体(如不结合于ifnar1的同种型对照抗体)的情况下所测量的相同或大致相同的ifnβ介导的抗病毒活性水平。
[0130]
在某些实施方式中，与在存在等效浓度的对照抗体情况下所测量的基线ifnβ介导的抗病毒活性相比，在等效分析条件下，本文所提供的抗体或其抗原结合片段在合适的抗病毒分析中抑制不超过20％、不超过15％、不超过10％、不超过8％、不超过5％、不超过2％或不超过1％的ifnβ介导的抗病毒活性。
[0131]
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段抑制ifnα和/或ifnω介导的抗病毒活性。
[0132]
在某些实施方式中，与分别在存在等效浓度的对照抗体的情况下所测量的基线ifnα和/或ifnω介导的抗病毒活性相比，在等效分析条件下，所述抗体或其抗原结合片段在合适的抗病毒分析中抑制至少约30％、至少约40％、至少约50％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％或约100％的ifnα和/或ifnω介导的抗病毒活性。
[0133]
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段对ifnα介导的或对ifnω介导的ifnar1活化或对ifnα介导的或对ifnω介导的抗病毒活性的抑制作用分别比其对ifnβ介导的ifnar1活化或对ifnβ介导的抗病毒活性的抑制作用高至少四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十一倍、十二倍、十三倍、十四倍、十五倍或二十倍。本文所提供的抗体或其抗原结合片段对ifnα、ifnω和ifnβ介导的ifnar1活化或抗病毒活性的抑制作用在等效分析条件下测量，如(但不限于)使用相同类型的分析、使用等效分析参数、使用相同或等效浓度的测试抗体，并且使用相同或等效量的表达ifnar1的细胞。在某些实施方式中，在1ng/ml ifnα、50pg/ml ifnω或50pg/ml ifnβ存在下分别测量对ifnα、ifnω或ifnβ介导的ifnar1活化或抗病毒活性的抑制作用。
[0134]
不希望受任何理论束缚，据信，抗体和其抗原结合片段在提供ifnα介导的和ifnω介导的ifnar1活化的优先抑制和使对ifnβ介导的ifnar1活化的抑制最小化方面是特别有利的。
[0135]
ifnα和ifnω都被报道在i型ifn相关疾病(如全身性红斑狼疮(sle))的病理中被诱导。在sle患者中ifnω表达在rna水平上调(yao y等人,《人基因体蛋白质组学(hum genomics proteomics)》2009)。ifn
‑
ω是在sle中诱导ifn标签的活性i型ifn环境的一部分。已报告，ifnω和ifnα两者的共抑制比单独的ifnα或ifnω抑制剂引起对sle患者的血液中所长存的ifn标签更显著的抑制(参见美国专利第us9902770b2号中的详细信息)。类似地，通过抑制ifnα和ifnω介导的ifnar1活化，本文所提供的抗体和其抗原结合片段也预期
id no:25的序列的hcdr1、含有seq id no:26的序列的hcdr2和含有seq id no:27的序列的hcdr3，和/或含有seq id no:72的序列的lcdr1、含有seq id no:66的序列的lcdr2和含有seq id no:28的序列的lcdr3。
[0146]
下表1显示抗体7g4和10c5的cdr序列。下表2显示7g4和10c5的重链和轻链可变区氨基酸序列，且下表3显示编码可变区的核酸序列。
[0147]
表1. 7g4和10c5的cdr氨基酸序列
[0148][0149]
表2. 7g4和10c5的可变区氨基酸序列
[0150][0151][0152]
表3编码7g4和10c5的可变区的核苷酸序列
[0153][0154]
本公开还提供分别表达7g4和10c5的杂交瘤细胞，其已经由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏。
[0155]
产生7g4的杂交瘤的详细保藏信息如下：微生物保藏号：cgmcc号16286；分类名称：杂交瘤细胞系；保藏地址：北京朝阳区北辰西路1号1栋(building 1,no.1beichen west road,chaoyang district,beijing)；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；以及保藏日期：2018年8月27日。
[0156]
产生10c5的杂交瘤的详细保藏信息如下：微生物保藏号：cgmcc号16287；分类名称：杂交瘤细胞系；保藏地址：北京朝阳区北辰西路1号1栋；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；以及保藏日期：2018年8月27日。
[0157]
本公开还提供由保藏号为cgmcc保藏号16286的杂交瘤细胞或保藏号16287的杂交瘤细胞表达的抗体，和其抗原结合片段。
[0158]
在7g4和10c5中的每一者可结合于ifnar1且抗原结合特异性主要由cdr1、cdr2和cdr3区提供的条件下，7g4和10c5的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列和lcdr1、lcdr2和lcdr3序列可为“混合和匹配的”(即，来自不同抗体的cdr可混合和匹配，但每一抗体必须含有hcdr1、hcdr2和hcdr3以及lcdr1、lcdr2和lcdr3)，以产生本公开的抗ifnar1结合分子。此类“混合
和匹配的”抗体的ifnar1结合可以使用上文和实例中所描述的结合分析来测试。优选地，当混合并且匹配vh cdr序列时，来自特定vh序列的hcdr1、hcdr2和/或hcdr3序列被结构上类似的cdr序列替换。同样地，当混合并且匹配vl cdr序列时，来自特定vl序列的lcdr1、lcdr2和/或lcdr3序列优选地用结构上类似的cdr序列替换。举例来说，7g4和10c5的vh hcdr1共享一些结构类似性并且因此能够进行混合和匹配。本领域的普通技术人员将显而易见，针对单克隆抗体7g4和10c5，新型vh和vl序列可以通过用来自本文所公开的cdr序列的结构类似序列取代一个或多个vh和/或vl cdr区序列来产生。
[0159]
已知cdr负责抗原结合。然而，已发现并非全部6个cdr均为必不可少的或不可改变的。换句话说，有可能置换或改变或修改抗ifnar1抗体7g4或10c5中的一个或多个cdr，但基本上保持对于ifnar1的特异性结合亲和力。
[0160]
在某些实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段包括抗体7g4或10c5的重链cdr3序列。在某些实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段包括选自由seq id no:23、65和27组成的群组的重链cdr3序列。
[0161]
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段包括适合构架区(fr)序列，只要抗体和其抗原结合片段可以特异性结合于ifnar1即可。上表1中提供的cdr序列是从小鼠抗体获得的，但可以使用本领域中已知的合适方法如重组技术，将其移植到任何合适的物种如小鼠、人、大鼠、兔等的任何合适的fr序列。
[0162]
在某些实施方式中，本文提供的抗体和其抗原结合片段是人源化的。人源化抗体或抗原结合片段在其降低人的免疫原性方面是合乎需要的。人源化抗体在其可变区中是嵌合的，因为非人cdr序列被移植到人或实质上人fr序列。抗体或抗原结合片段的人源化基本上可以通过将非人(如鼠)cdr基因替换为人免疫球蛋白基因中相应的人cdr基因来进行(参见例如jones等人(1986)《自然》321:522
‑
525；riechmann等人(1988)《自然》332:323
‑
327；verhoeyen等人(1988)《科学(science)》239:1534
‑
1536)。
[0163]
可使用本领域中已知的方法选择合适的人重链和轻链可变结构域以实现此目的。在一说明性实例中，可以使用“最佳拟合”方法，其中针对已知的人可变结构域序列的数据库筛选或blast化非人(例如啮齿动物)抗体可变结构域序列，并且识别最接近非人查询序列的人序列，并将其用作移植非人cdr序列的人支架(参见例如sims等人,(1993)《免疫学杂志》151:2296；chothia等人(1987)《分子生物学杂志》196:901)。或者，从所有人抗体的共有序列衍生出的框架可用于非人cdr的移植(参见例如carter等人(1992)《美国国家科学院院刊》,89:4285；presta等人(1993)《免疫学杂志》,151:2623)。
[0164]
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或其抗原结合片段除cdr序列为非人序列外，基本上全部由人序列构成。在一些实施方式中，可变区fr和恒定区如果存在则完全或基本上来自人免疫球蛋白序列。人fr序列和人恒定区序列可以来源于不同的人免疫球蛋白基因，例如fr序列来源于一种人抗体，而恒定区来源于另一种人抗体。在一些实施方式中，人源化抗体或抗原结合片段包括人重链hfr1
‑
4和/或轻链lfr1
‑
4。
[0165]
在一些实施方式中，来源于人的fr区可以包括与其来源于的人免疫球蛋白相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，人fr的一个或多个氨基酸残基经来自亲本非人抗体的相应残基取代。在某些实施方式中，可能需要使人源化抗体或其片段紧密近似非人亲本抗体结构。在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或抗原结合片段在每个人fr序列中包
括不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代，或者在重链或轻链可变结构域的所有fr中包括不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代。在一些实施方式中，此类氨基酸残基的变化可以仅存在于重链fr区，仅存在于轻链fr区，或存在于两条链中。
[0166]
在某些实施方式中，本公开还提供人源化抗ifnar1抗体和其抗原结合片段，其包括：重链hfr1，其包括seq id no:33的序列；重链hfr2，其包括选自seq id no:41、42和43的序列；重链hfr3，其包括选自seq id no:44和45的序列；和重链hfr4，其包括seq id no:36的序列。
[0167]
在某些实施方式中，本公开还提供人源化抗ifnar1抗体和其抗原结合片段，其包括：轻链lfr1，其包括seq id no:37的序列；轻链lfr2，其包括选自seq id no:46、47和48的序列；轻链lfr3，其包括选自seq id no:49和50的序列；和轻链lfr4，其包括seq id no:40的序列。
[0168]
在某些实施方式中，本公开还提供人源化抗ifnar1抗体和其抗原结合片段，其包括重链可变区中所含有的hfr1、hfr2、hfr3和/或hfr4序列，所述重链可变区选自由以下组成的群组：7g4
‑
g0
‑
vh(seq id no:51)、7g4
‑
g1
‑
vh(seq id no:52)、7g4
‑
g2
‑
vh(seq id no:53)和7g4
‑
g3
‑
vh(seq id no:54)。
[0169]
在某些实施方式中，本公开还提供人源化抗ifnar1抗体和其抗原结合片段，其包括轻链可变区中所含有的lfr1、lfr2、lfr3和/或lfr4序列，所述轻链可变区选自由以下组成的群组：7g4
‑
g0
‑
vl(seq id no:55)、7g4
‑
g1
‑
vl(seq id no:56)、7g4
‑
g1
‑
vl
‑
mut
‑
1(seq id no:68)、7g4
‑
g2
‑
vl(seq id no:57)和7g4
‑
g3
‑
vl(seq id no:58)。
[0170]
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗ifnar1抗体和其抗原结合片段包括选自由以下组成的群组的重链可变结构域序列：seq id no:51、seq id no:52、seq id no:53和seq id no:54；和/或选自由以下组成的群组的轻链可变结构域序列：seq id no:55、seq id no:56、seq id no:57和seq id no:58。
[0171]
本公开还提供7g4的示例性人源化抗体，包含：
[0172]
1)“hu4
‑
1”，其包括7g4
‑
g0
‑
vh的重链可变区(seq id no:51)和7g4
‑
g0
‑
vl的轻链可变区(seq id no:55)；
[0173]
2)“hu4
‑
2”，其包括7g4
‑
g1
‑
vh的重链可变区(seq id no:52)和7g4
‑
g0
‑
vl的轻链可变区(seq id no:55)；
[0174]
3)“hu4
‑
3”，其包括7g4
‑
g2
‑
vh的重链可变区(seq id no:53)和7g4
‑
g0
‑
vl的轻链可变区(seq id no:55)；
[0175]
4)“hu4
‑
4”，其包括7g4
‑
g3
‑
vh的重链可变区(seq id no:54)和7g4
‑
g0
‑
vl的轻链可变区(seq id no:55)；
[0176]
5)“hu4
‑
5”，其包括7g4
‑
g0
‑
vh的重链可变区(seq id no:51)和7g4
‑
g1
‑
vl的轻链可变区(seq id no:56)；
[0177]
6)“hu4
‑
6”，其包括7g4
‑
g1
‑
vh的重链可变区(seq id no:52)和7g4
‑
g1
‑
vl的轻链可变区(seq id no:56)；
[0178]
7)“hu4
‑6‑
mut
‑
1”，其包括7g4
‑
g1
‑
vh
‑
mut
‑
1的重链可变区(seq id no:67)和7g4
‑
g1
‑
vl的轻链可变区(seq id no:56)；
[0179]
8)“hu4
‑6‑
mut
‑
2”，其包括7g4
‑
g1
‑
vh的重链可变区(seq id no:52)和7g4
‑
g1
‑
vl
‑
mut
‑
1的轻链可变区(seq id no:68)；
[0180]
9)“hu4
‑6‑
mut
‑
3”，其包括7g4
‑
g1
‑
vh
‑
mut
‑
1的重链可变区(seq id no:67)和7g4
‑
g1
‑
vl
‑
mut
‑
1的轻链可变区(seq id no:68)；
[0181]
10)“hu4
‑
7”，其包括7g4
‑
g2
‑
vh的重链可变区(seq id no:53)和7g4
‑
g1
‑
vl的轻链可变区(seq id no:56)；
[0182]
11)“hu4
‑
8”，其包括7g4
‑
g3
‑
vh的重链可变区(seq id no:54)和7g4
‑
g1
‑
vl的轻链可变区(seq id no:56)；
[0183]
12)“hu4
‑
9”，其包括7g4
‑
g0
‑
vh的重链可变区(seq id no:51)和7g4
‑
g2
‑
vl的轻链可变区的轻链可变区(seq id no:57)；
[0184]
13)“hu4
‑
10”，其包括7g4
‑
g1
‑
vh的重链可变区(seq id no:52)和7g4
‑
g2
‑
vl的轻链可变区的轻链可变区(seq id no:57)；
[0185]
14)“hu4
‑
11”，其包括7g4
‑
g2
‑
vh的重链可变区(seq id no:53)和7g4
‑
g2
‑
vl的轻链可变区(seq id no:57)；
[0186]
15)“hu4
‑
12”，其包括7g4
‑
g3
‑
vh的重链可变区(seq id no:54)和7g4
‑
g2
‑
vl的轻链可变区(seq id no:57)；
[0187]
16)“hu4
‑
13”，其包括7g4
‑
g0
‑
vh的重链可变区(seq id no:51)和7g4
‑
g3
‑
vl的轻链可变区的轻链可变区(seq id no:58)；
[0188]
17)“hu4
‑
14”，其包括7g4
‑
g1
‑
vh的重链可变区(seq id no:52)和7g4
‑
g3
‑
vl的轻链可变区(seq id no:58)；
[0189]
18)“hu4
‑
15”，其包括7g4
‑
g2
‑
vh的重链可变区(seq id no:53)和7g4
‑
g3
‑
vl的轻链可变区(seq id no:58)；
[0190]
19)“hu4
‑
16”，其包括7g4
‑
g3
‑
vh的重链可变区(seq id no:54)和7g4
‑
g3
‑
vl的轻链可变区(seq id no:58)。
[0191]
这些示例性人源化抗ifnar1抗体保持与ifnar1的特异性结合能力或亲和力，并且在所述方面至少与亲本小鼠抗体7g4相当或甚至优于亲本小鼠抗体7g4。举例来说，实例9中提供了数据。
[0192]
来源于基因片段的重排的抗体
[0193]
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括：来自特定小鼠生殖系重链ig基因的重链可变区，所述重链ig基因包括作为小鼠ighv1
‑
69基因的产物或衍生于其的v基因、作为小鼠ighd2
‑
4基因的产物或衍生于其的d基因和作为小鼠ighj4基因的产物或衍生于其的j基因；和/或来自特定小鼠生殖系轻链ig基因的轻链可变区，所述轻链ig基因包括作为小鼠igkv13
‑
84基因的产物或衍生于其的v基因和作为小鼠igkj4基因的产物或衍生于其的j基因。
[0194]
与生殖系免疫球蛋白序列相比，“作为特定小鼠生殖系免疫球蛋白基因序列的产物”或“衍生于特定小鼠生殖系免疫球蛋白基因序列”的抗体或其抗原结合片段可含有一个或多个氨基酸残基差异，此归因于例如天然产生的体细胞突变或定点突变的有意引入。然而，本文所提供的所选抗体或其抗原结合片段通常在氨基酸序列中与由小鼠生殖系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少75％(例如至少80％，至少85％)一致，并且当与其它物种的生殖系免疫球蛋白氨基酸序列(例如大鼠生殖系序列)相比时，可以含有将抗体或其抗原
结合片段识别为小鼠或人的氨基酸残基。
[0195]
示例性小鼠抗体7g4和10c5都衍生于小鼠生殖系ig基因，包含用于重链可变区的ighv1
‑
69基因、ighd2
‑
4基因和ighj4基因；和用于轻链可变区的igkv13
‑
84基因和igkj4基因。不希望受任何理论所束缚，据信，小鼠基因的此组合在重排后偏向有利于产生vh和vl的组合，其可组装到如本文所公开的具有与7g4和10c5类似的结合能力、结合特征和/或生物活性的抗ifnar1抗体中。
[0196]
本领域的技术人员可以使用本领域中已知的方法，如例如通过使用噬菌体展示库、通过基因序列的人工突变或使用转基因动物获得衍生于包含ighv1
‑
69基因、ighd2
‑
4基因、ighj4基因、igkv13
‑
84基因和igkj4基因的小鼠生殖系ig基因的抗ifnar1抗体。在一个实施方式中，小鼠基因可以克隆并且重组到噬菌体展示库，之后淘选或筛选能够结合于所关注的抗原(例如ifnar1)的噬菌体克隆(例如，如winter等人,《免疫学年度评论(ann.rev immunol.)》,12:433
‑
455(1994)中所描述)。在另一个实施方式中，ighv1
‑
69、ighd2
‑
4、ighj4、igkv13
‑
84和igkj4基因的基因序列可以经工程改造以引入一个或多个突变，使得经编码重链或轻链可变区序列在氨基酸序列中与seq id no:15(重链)或与seq id no:16(轻链)至少75％(例如至少80％、至少85％)一致。在另一个实施方式中，缺乏产生内源性抗体的基因的转基因动物可以经工程改造以携带小鼠ighv1
‑
69基因、ighd2
‑
4基因、ighj4基因、igkv13
‑
84基因和igkj4基因的特定组合，其中在针对所关注的抗原(例如ifnar1)免疫接种后，转基因动物易于从这些可能产生抗ifnar1抗体的经工程改造小鼠基因产生抗ifnar1抗体。
[0197]
在一些实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段包括重链可变结构域的全部或一部分和/或轻链可变结构域的全部或一部分。在一个实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段为由本文所提供的重链可变结构域的全部或一部分组成的单一结构域抗体。本领域中可获得此类单结构域抗体的更多信息(参见例如美国专利第6,248,516号)。
[0198]
在某些实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗体和其片段进一步包括免疫球蛋白(ig)恒定区，其任选地进一步包括重链和/或轻链恒定区。在某些实施方式中，重链恒定区包括ch1、铰链和/或ch2
‑
ch3区(或任选地ch2
‑
ch3
‑
ch4区)。在某些实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗体和其片段包括人igg1、igg2、igg3或igg4的重链恒定区。在某些实施方式中，轻链恒定区包括cκ或cλ。本文所提供的抗ifnar1抗体和其片段的恒定区可与野生型恒定区序列一致或相差一个或多个突变。
[0199]
在某些实施方式中，重链恒定区包括fc区。已知fc区介导效应功能，如抗体的adcc和cdc。不同ig同种型的fc区具有不同的诱导效应功能的能力。例如，已经认识到igg1和igg3的fc区比igg2和igg4的fc区更有效地诱导adcc和cdc。在某些实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗体和其抗原结合片段包括igg1或igg3同种型的fc区，其可诱导adcc或cdc；或者，igg4或igg2同种型的恒定区，其具有降低或耗竭的效应功能。在某些实施方式中，抗ifnar1抗体或其抗原结合片段包括包含seq id no:61序列的野生型人igg1 fc区或其它野生型人igg1等位基因。
[0200]
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其片段对人ifnar1具有特异性结合亲和力，其足以提供诊断和/或治疗用途。
[0201]
本文所提供的抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、双特异性抗体、标记抗体、二价抗体或抗个体基因型抗体。重组抗体为使用重组方法在体外而非在动物中制备的抗体。
[0202]
在某些实施方式中，本技术提供一种抗ifnar1抗体或其抗原结合片段，其与本文所提供的抗体或其抗原结合片段竞争结合于ifnar1，并且其中所述抗体或其抗原结合片段不抑制ifnβ介导的ifnar1活化。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段抑制ifnα介导和/或ifnω介导的ifnar1活化。此类抗体或其抗原结合片段可以充分抑制ifnar1活化，同时保持ifnβ的所需生物活性，如抑制病毒复制。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段对ifnα介导或对ifnω介导的ifnar1活化或抗病毒活性的抑制作用比其对ifnβ介导的ifnar1活化的抑制作用高至少四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十一倍、十二倍、十三倍、十四倍、十五倍或二十倍。
[0203]
抗体变体
[0204]
本文所提供的抗体和其抗原结合片段还涵盖其各种变体。
[0205]
在某些实施方式中，抗体变体在如上表1中所提供的一个或多个cdr序列、上表2中所提供的一个或多个可变区序列(但不在任一cdr序列中)和/或恒定区(例如fc区)中包括一个或多个修饰或取代。此类变体保持其亲本抗体的与ifnar1的结合特异性，但具有由一个或多个修饰或一个或多个取代赋予的一种或多种所需特性。举例来说，抗体变体可以具有提高的抗原结合亲和力、改进的糖基化模式、减少的糖基化风险、减少的脱氨基、减少或耗乏的一种或多种效应功能、改进的fcrn受体结合、增加的药物动力学半衰期、ph敏感性和/或对结合(例如一个或多个引入的半胱氨酸残基)的相容性。
[0206]
可使用本领域中已知的方法，例如“丙氨酸扫描诱变”(参见例如cunningham和wells(1989)《科学》,244:1081
‑
1085)来筛选亲本抗体序列以识别合适的或优选的残基以进行修饰或取代。简单来说，可识别靶标残基(例如带电残基，如arg、asp、his、lys和glu)，且所述靶标残基可被中性或带负电氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)置换，且产生已修饰的抗体且针对所关注特性进行筛选。如果在特定氨基酸位置的取代显示出感兴趣的功能变化，则所述位置可以被确定为用于修饰或取代的潜在残基。潜在残基可通过用不同类型的残基(例如半胱氨酸残基、带正电残基等)取代来进一步评估。
[0207]
亲和力变体
[0208]
亲和力变体可以在一个或多个如上表1中所提供的cdr序列、一个或多个本文所提供的fr序列或上表2中所提供的重链或轻链可变区序列中含有修饰或取代。fr序列可由本领域的技术人员基于上表1中的cdr序列和上表2中的可变区序列容易地被鉴别，因为在本领域中众所周知，cdr区由可变区中的两个fr区侧接。亲和力变体保持亲本抗体的与ifnar1的特异性结合亲和力，或甚至具有优于亲本抗体的提高的ifnar1特异性结合亲和力。在某些实施方式中，cdr序列、fr序列或可变区序列中的至少一个(或所有)取代包括保守取代。
[0209]
本领域的技术人员应理解，在上表1和上表2中提供的cdr序列和可变区序列中，一个或多个氨基酸残基可被取代，而所得抗体或抗原结合片段仍保持对于ifnar1的结合亲和力或结合能力，或甚至具有提高的结合亲和力或能力。可以使用本领域中已知的各种方法来实现这一目的。举例来说，可以产生抗体变体(如fab或scfv变体)库并且用噬菌体展示技术表达，且接着针对人ifnar1的结合亲和力进行筛选。对于另一实例，可以使用计算机软件
实际上模拟抗体与人ifnar1的结合，并且鉴别形成结合界面的抗体上的氨基酸残基。此类残基可避免进行取代以便防止结合亲和力的降低，或作为取代的目标以实现更强结合。
[0210]
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或抗原结合片段包括一或多个cdr序列和/或一或多个fr序列中的一或多个氨基酸残基取代。在某些实施方式中，亲和力变体在cdr序列和/或fr序列中包括总共不超过20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
[0211]
在某些实施方式中，抗ifnar1抗体和其抗原结合片段包括与上表1中所列的(或那些)序列具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的1、2或3个cdr序列，并且同时保持与其亲本抗体类似或甚至更高水平的对ifnar1的结合亲和力。
[0212]
在某些实施方式中，抗ifnar1抗体和其抗原结合片段包括与上表2中所列的(或那些)序列具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的一个或多个可变区序列，并且同时保持与其亲本抗体类似或甚至比其更高的水平的对ifnar1的结合亲和力。在一些实施方式中，上表2中所列的可变区序列中总共有1至10个氨基酸被取代、插入或缺失。在一些实施方式中，取代、插入或缺失发生于cdr外部的区域中(例如fr中)。
[0213]
糖基化变体
[0214]
本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段还涵盖糖基化变体，可以获得其以增加或降低抗体或抗原结合片段的糖基化程度。
[0215]
抗体或其抗原结合片段可以包括引入或去除糖基化位点的一种或多种修饰。糖基化位点是侧链可与碳水化合物部分(例如寡糖结构)连接的氨基酸残基。抗体的糖基化通常是n
‑
连接型或o
‑
连接型。n
‑
连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基(例如三肽序列如天冬酰胺
‑
x
‑
丝氨酸和天冬酰胺
‑
x
‑
苏氨酸中的天冬酰胺残基，其中x是除脯氨酸外的任何氨基酸)的侧链的连接。o
‑
连接型糖基化是指糖n
‑
乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，最常见地与丝氨酸或苏氨酸的连接。天然糖基化位点的去除可方便地实现，例如通过改变氨基酸序列以使得上文所描述的三肽序列中的一个(对于n
‑
连接型糖基化位点)或序列中存在的丝氨酸或苏氨酸残基(对于o
‑
连接型糖基化位点)被取代来实现。可以类似方式，通过引入此类三肽序列或丝氨酸或苏氨酸残基来产生新的糖基化位点。
[0216]
在某些实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段包括在n297(例如n297a、n297q或n297g)处的突变以去除糖基化位点。
[0217]
半胱氨酸工程改造的变体
[0218]
本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段还涵盖半胱氨酸工程改造的变体，其包括一个或多个引入的游离半胱氨酸氨基酸残基。
[0219]
游离半胱氨酸残基是不作为二硫桥键的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸工程改造的变体可用于在工程改造的半胱氨酸位点处，通过例如顺丁烯二酰亚胺或卤代乙酰基与尤其例如细胞毒性和/或成像化合物、标记或放射性同位素结合。用于工程改造抗体或其抗原结合片段以引入游离半胱氨酸残基的方法是本领域中已知的，参见例如wo2006/034488。
[0220]
fc变体
[0221]
本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段还涵盖fc变体，其在其fc区和/或铰链区处包括一个或多个氨基酸残基修饰或取代，例如以提供更改的效应功能，如adcc和
cdc。本领域中已描述通过抗体工程改造改变adcc活性的方法，参见例如shields rl.等人,《生物化学杂志(j biol chem.)》2001.276(9):6591
‑
604；idusogie ee.等人,《免疫学杂志(j immunol.)》2000.164(8):4178
‑
84；steurer w.等人,《免疫学杂志》1995,155(3):1165
‑
74；idusogie ee.等人,《免疫学杂志》2001,166(4):2571
‑
5；lazar ga.等人,《美國國家科學院院刊(pnas)》,2006,103(11):4005
‑
4010；ryan mc.等人,《分子癌症治疗学(mol.cancer ther.)》,2007,6:3009
‑
3018；richards jo,.等人,《分子癌症治疗学》2008,7(8):2517
‑
27；shields r.l.等人,《生物化学杂志(j.biol.chem)》,2002,277:26733
‑
26740；shinkawa t.等人,《生物化学杂志》,2003,278:3466
‑
3473。
[0222]
也可例如通过改进或减弱c1q结合和/或cdc来改变本文所提供的抗体的cdc活性(参见例如wo99/51642；duncan及winter《自然》322:738
‑
40(1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号)；和关于fe区变体的其它实例，wo94/29351。选自fc区的氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸可用不同氨基酸残基置换，以改变clq结合和/或降低或消除补体依赖性细胞毒性(cdc)(参见idusogie等人的美国专利第6,194,551号)。也可引入一个或多个氨基酸取代来改变抗体固定补体的能力(参见bodmer等人的pct公开号wo 94/29351)。
[0223]
在某些实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段具有减小的效应功能，并且在选自由以下组成的群组的位置处在igg1中包括一个或多个氨基酸取代：234、235、237和238、268、297、309、330和331。在某些实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段具有igg1同种型并且包括一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：n297a、n297q、n297g、l235e、l234a、l235a、l234f、l235e、p331s和其任何组合。在某些实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段具有igg2同种型，并且包括一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：h268q、v309l、a330s、p331s、v234a、g237a、p238s、h268a和其任何组合(例如h268q/v309l/a330s/p331s、v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s)。在某些实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段具有igg4同种型并且包括一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：n297a、n297q、n297g、l235e、l234a、l235a和其任何组合。在某些实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段具有igg2/igg4交叉同种型。igg2/igg4交叉同种型的实例描述于rother rp等人,《自然
·
生物技术(nat biotechnol)》25:1256
‑
1264(2007)中。
[0224]
在某些实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段具有igg1同种型并且在234、235和331的一个或多个点处包括一个或多个氨基酸取代。在某些实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段具有igg1同种型并且在fc区中包括三重突变l234f/l235e/p331s。在某些实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段包括包含seq id no:62序列的变体fc区。
[0225]
在某些实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗体和抗原结合片段已增加adcc和/或增加对于fcγ受体的亲和力，并且在以下位置中的一处或多处包括一个或多个氨基酸取代：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439(参见presta的wo 00/42072)。在位置
256、290、298、333、334和339处的特定突变显示可改善与fcγriii的结合。另外，以下组合突变体显示可改善fcγriii结合：t256a/s298a、s298a/e333a、s298a/k224a和s298a/e333a/k334a。
[0226]
在某些实施方式中，抗ifnar1抗体或其抗原结合片段包括一个或多个改进与新生fc受体(fcrn)的ph依赖性结合的氨基酸取代。此类变体可具有延长的药物动力学半衰期，因为其在酸性ph下与fcrn结合，使其避免在溶酶体中降解，并且接着转位并从细胞释放出来。对抗体和其抗原结合片段进行工程改造以提高与fcrn的结合亲和力的方法是本领域中众所周知的，参见例如vaughn,d.等人,《结构(structure)》,6(1):63
‑
73,1998；kontermann,r.等人,《抗体工程(antibody engineering)》,第1卷,第27章:提高pk的fc区工程改造(engineering of the fc region for improved pk),springer出版,2010；yeung,y.等人,《癌症研究(cancer research)》,70:3269
‑
3277(2010)；和hinton,p.等人,《免疫学杂志》,176:346
‑
356(2006)。
[0227]
在某些实施方式中，抗ifnar1抗体或其抗原结合片段在fc区的界面中包括一个或多个氨基酸取代以有助于和/或促进杂二聚化。这些修饰包括将突起引入到第一fc多肽中和将空腔引入到第二fc多肽中，其中突起可以定位在空腔中以便促进第一fc多肽和第二fc多肽的相互作用以形成杂二聚体或复合物。产生具有这些修饰的抗体的方法为本领域中已知的，例如如美国专利第5,731,168号中所描述。
[0228]
抗原结合片段
[0229]
本文还提供了抗ifnar1抗原结合片段。各种类型的抗原结合片段是本领域中已知的，并且可以基于本文所提供的抗ifnar1抗体进行开发，包括例如cdr序列和可变序列示于表1和2中的示例性抗体和其不同的变体(如亲和力变体、糖基化变体、fc变体、半胱氨酸工程改造变体等)。
[0230]
在某些实施方式中，本文所提供的抗ifnar1抗原结合片段是骆驼化单结构域抗体、双功能抗体、单链fv片段(scfv)、scfv二聚体、bsfv、dsfv、(dsfv)2、dsfv
‑
dsfv'、fv片段、fab、fab'、f(ab')2、双特异性抗体、ds双功能抗体、纳米抗体、结构域抗体、单一结构域抗体或二价结构域抗体。
[0231]
各种技术可用于制造此类抗原结合片段。说明性方法包含：酶促消化完整抗体(参见例如morimoto等人,《生物化学与生物物理学方法杂志(journal of biochemical and biophysical methods)》24:107
‑
117(1992)；和brennan等人,《科学》,229:81(1985))、通过宿主细胞(如大肠杆菌(e.coli))重组表达(例如针对fab、fv和scfv抗体片段)、从如上文所论述的噬菌体展示文库筛选(例如针对scfv)和化学偶合两个fab'
‑
sh片段以形成f(ab')2片段(carter等人,《生物技术(bio/technology)》10:163
‑
167(1992))。用于产生抗体片段的其它技术对于熟练技术人员将是显而易见的。
[0232]
在某些实施方式中，抗原结合片段是scfv。scfv的生成描述于例如wo 93/16185；美国专利第5,571,894号和第5,587,458号中。scfv可以在氨基或羧基端与效应蛋白融合以提供融合蛋白(参见例如《抗体工程(antibody engineering)》,borrebaeck编)。
[0233]
在某些实施方式中，抗ifnar1抗体和其抗原结合片段是双特异性的。在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步连接到具有与所述ifnar1抗体或其抗原结合片段不同的结合特异性的第二功能部分。
[0234]
结合物
[0235]
在一些实施方式中，抗ifnar1抗体和其抗原结合片段进一步包括结合部分。结合部分可与抗体和其抗原结合片段连接。结合部分是可与抗体或其抗原结合片段连接的部分。经考虑，多种结合部分可与本文所提供的抗体或其抗原结合片段连接(参见例如“结合疫苗(conjugate vaccines)”,对微生物学与免疫学的贡献(contributions to microbiology and immunology),j.m.cruse和r.e.lewis,jr.(编),纽约(new york)的卡格出版社(carger press),(1989))。这些结合部分可通过共价结合、亲和力结合、嵌入、配位结合、复合、结合(association)、掺合(blending)或添加以及其它方法与抗体或其抗原结合片段连接。
[0236]
在某些实施方式中，本文所公开的抗体和抗原结合片段可以经工程改造以含有可以用于与一个或多个结合部分结合的表位结合部分外的特定位点。举例来说，此类位点可以包含一个或多个反应性氨基酸残基，如例如半胱氨酸或组氨酸残基，以便于与结合部分共价连接。
[0237]
在某些实施方式中，抗体可以间接或通过另一结合部分与结合部分连接。举例来说，抗体或其抗原结合片段可以与生物素结合，接着间接结合于与抗生物素蛋白结合的第二结合物。结合物可以是清除调节剂、毒素(例如化学治疗剂)、可检测标记(例如放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记或酶
‑
底物标记)或纯化部分。
[0238]“毒素”可为对细胞有害或可破坏或杀死细胞的任何药剂。毒素的实例包含但不限于紫杉醇(taxol)、细胞松弛素b(cytochalasin b)、短杆菌肽d(gramicidin d)、溴化乙锭、吐根素(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、特诺波赛(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、mmae、mmaf、dm1、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)、道诺比星(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放射菌素d(actinomycin d)、1
‑
去氢睪固酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)、嘌呤霉素(puromycin)和其类似物、抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6
‑
巯基嘌呤、6
‑
硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5
‑
氟尿嘧啶达卡巴嗪(5
‑
fluorouracil decarbazine))、烷基化剂(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(bsnu)和洛莫司汀(lomustine)(ccnu)、环硫磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链佐霉素(streptozotocin)、丝裂霉素c(mitomycin c)和顺
‑
二氯二胺铂(ii)(ddp)、顺铂)、蒽环霉素(anthracycline)(例如道诺比星(原名柔红霉素(daunomycin))和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(dactinomycin)(原名放射菌素(actinomycin))、博莱霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)和安曲霉素(anthramycin)(amc))、抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)、拓扑异构酶抑制剂和微管蛋白结合剂。
[0239]
可检测标记的实例可包括荧光标记(例如荧光素、若丹明、丹磺酰基、藻红蛋白或德克萨斯红(texas red))、酶
‑
底物标记(例如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β
‑
d
‑
半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如
123
i、
124
i、
125
i、
131
i、
35
s、3h、
111
in、
112
in、
14
c、
64
cu、
67
cu、
86
y、
88
y、
90
y、
177
lu、
211
at、
186
re、
188
re、
153
sm、
212
bi和
32
p、其它镧系元素)、发光标记、发色部分、地高辛(digoxigenin)、生物素/抗生物素蛋白、dna分子或金标
记用于检测。
[0240]
在某些实施方式中，结合部分可以是有助于增加抗体半衰期的清除调节剂。说明性实例包含水溶性聚合物，如peg、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇的共聚物等。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链或非支链的。与抗体连接的聚合物的数目可以变化，并且如果连接超过一个聚合物，那么其可以是相同或不同的分子。
[0241]
在某些实施方式中，结合部分可以是纯化部分，如磁珠。
[0242]
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段用作结合物的基底。
[0243]
多核苷酸和重组方法
[0244]
本公开提供编码抗ifnar1抗体和其抗原结合片段的分离的多核苷酸。如本文所用，术语“核酸”或“多核苷酸”是指单股或双股形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)和其聚合物。在某些实施方式中，分离的多核苷酸包括如seq id no:11、12、13和14中所示的一个或多个核苷酸序列，和/或其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的同源序列，和/或其仅具有简并取代的变体，并且编码本文所提供的示例性抗体的可变区。除非另外指示，否则特定多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、snp和互补序列，以及明确指示的序列。确切地说，简并密码子取代可以通过产生以下序列来实现，在所述序列中，一个或多个选定(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见batzer等人,《核酸研究》19:5081(1991)；ohtsuka等人,《生物化学杂志(j.biol.chem.)》260:2605
‑
2608(1985)；以及rossolini等人,《分子与细胞探针(mol.cell.probes)》8:91
‑
98(1994))。
[0245]
编码单克隆抗体的dna使用常规程序(例如，通过使用能够特异性地与编码抗体的重链和轻链的基因结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。编码dna还可以通过合成方法获得。
[0246]
编码抗ifnar1抗体和其抗原结合片段的分离的多核苷酸(例如包含如表3中所示的序列)可使用本领域中已知的重组技术插入载体中以便进一步克隆(dna扩增)或表达。许多载体可供使用。载体组分一般包含但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子(例如sv40、cmv、ef
‑
1α)和转录终止序列。
[0247]
本公开提供表达载体，其包括本文所提供的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，本文所提供的多核苷酸编码抗体或其抗原结合片段、可操作地连接到核酸序列的至少一个启动子(例如sv40、cmv、ef
‑
1α)和至少一个选择标记。载体的实例包含但不限于逆转录病毒(包含慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如sv40)、λ噬菌体和m13噬菌体、质粒pcdna3.3、pmd18
‑
t、poptivec、pcmv、pegfp、pires、pqd
‑
hyg
‑
gseu、palter、pbad、pcdna、pcal、pl、pet、pgemex、pgex、pci、pegft、psv2、pfuse、pvitro、pvivo、pmal、pmono、pselect、puno、pduo、psg5l、pbabe、pwpxl、pbi、p15tv
‑
l、ppro18、ptd、prs10、plexa、pact2.2、pcmv
‑
script.rtm.、pcdm8、pcdna1.1/amp、pcdna3.1、prc/rsv、pcr 2.1、pef
‑
1、pfb、psg5、pxt1、pcdef3、psvsport、pef
‑
bos等。
[0248]
包括编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列的载体可以被引入宿主细胞中
进行克隆或基因表达。用于克隆或表达本文载体中的dna的合适宿主细胞是上文所描述的原核生物、酵母或高等真核生物细胞。用于此目的的合适原核生物包含真细菌，如革兰氏阴性(gram
‑
negative)或革兰氏阳性生物体，例如肠内菌科(enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(escherichia)，例如大肠杆菌；肠杆菌属(enterobacter)；欧文氏菌属(erwinia)；克雷伯氏菌属(klebsiella)；变形杆菌属(proteus)；沙门氏菌属(salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(serratia)，例如粘质沙雷氏菌(serratia marcescans)；和志贺杆菌属(shigella)，以及芽孢杆菌属(bacilli)，如枯草芽孢杆菌(b.subtilis)和地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)；假单胞菌属(pseudomonas)，如绿脓杆菌(p.aeruginosa)；和链霉菌属(streptomyces)。
[0249]
除原核生物外，真核微生物，如丝状真菌或酵母是抗ifnar1抗体编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)或常见的烘焙酵母是低级真核宿主微生物中最常用的。然而，多种其它属、种和菌株在本文中是常用且有用的，如粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(kluyveromyces)宿主，如例如乳酸克鲁维酵母(k.lactis)、脆壁克鲁维酵母(k.fragilis)(atcc 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(k.bulgaricus)(atcc 16,045)、威克克鲁维酵母(k.wickeramii)(atcc 24,178)、克鲁维雄酵母(k.waltii)(atcc 56,500)、果蝇克鲁维酵母(k.drosophilarum)(atcc 36,906)、耐热克鲁维酵母(k.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(k.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(ep 402,226)；毕赤酵母(pichia pastoris)(ep 183,070)；假丝酵母属(candida)；瑞氏木霉(trichoderma reesia)(ep 244,234)；粗糙脉孢菌(neurospora crassa)；许旺酵母属(schwanniomyces)，如西方许旺酵母(schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，如例如脉孢菌属(neurospora)、青霉菌属(penicillium)、弯颈霉属(tolypocladium)和曲霉属(aspergillus)宿主，如构巢曲霉(a.nidulans)和黑曲霉(a.niger)。
[0250]
合适的表达本文所提供的糖基化抗体或抗原片段的宿主细胞来源于多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包含植物和昆虫细胞。已经鉴别出多种杆状病毒株和变体以及来自如下宿主的相应容许的昆虫宿主细胞：草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(bombyx mori)。多种用于转染的病毒株是可公开获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(autographa californica)npv的l
‑
1变体和家蚕npv的bm
‑
5病毒株，并且此类病毒可以根据本发明用作本文中的病毒，尤其是用于转染草地贪夜蛾细胞。棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。
[0251]
然而，对脊椎动物细胞的兴趣最大，脊椎动物细胞的培养繁殖(组织培养)已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由sv40转化的猴肾cv1系(cos
‑
7，atcc crl 1651)；人胚肾系(亚克隆以在悬浮培养中生长的293或293细胞；graham等人,《普通病毒学杂志(j.gen virol.)》36:59(1977))；幼小仓鼠肾细胞(bhk，atcc ccl 10)；中国仓鼠卵巢细胞/
‑
dhfr(cho，urlaub等人,《美国国家科学院院刊》77:4216(1980))；小鼠支持细胞(tm4，mather,《生殖生物学(biol.reprod.)》23:243
‑
251(1980))；猴肾细胞(cv1 atcc ccl 70)；非洲绿猴肾细胞(vero
‑
76，atcc crl
‑
1587)；人宫颈癌细胞(hela，atcc ccl 2)；犬肾细胞(mdck，atcc ccl 34)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(brl 3a，atcc crl 1442)；人
肺细胞(w138，atcc ccl 75)；人肝细胞(hep g2，hb 8065)；小鼠乳房肿瘤(mmt 060562，atcc ccl51)；tri细胞(mather等人,《纽约科学院年报(annals n.y.acad.sci.)》383:44
‑
68(1982))；mrc 5细胞；fs4细胞；和人肝瘤系(hep g2)。在一些优选实施方式中，宿主细胞是哺乳动物培养细胞系，如cho、bhk、ns0、293和其衍生物。
[0252]
用上述用于产生抗ifnar1抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在按需要改良的常规营养培养基中培养，以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。在另一个实施方式中，抗体可通过本领域中已知的同源重组产生。在某些实施方式中，宿主细胞能够产生本文所提供的抗体或其抗原结合片段。
[0253]
用于产生本文所提供的抗体或其抗原结合片段的宿主细胞可以在各种培养基中培养。市售培养基，如ham's f10(sigma)、最小必需培养基(mem)(sigma)、rpmi
‑
1640(sigma)和杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(dulbecco's modified eagle's medium)(dmem)，sigma)适用于培养宿主细胞。另外，ham等人,《酶学方法(meth.enz.)》58:44(1979)；barnes等人,《分析生物化学(anal.biochem.)》102:255(1980)；美国专利第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号或第5,122,469号；wo90/03430；wo 87/00195；或美国再颁专利第30,985号中所描述的任何培养基都可以用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任一种都可以视需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙盐、镁盐和磷酸盐)、缓冲剂(如hepes)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如gentamycin
tm
药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。也可以本领域的技术人员已知的适当浓度包含任何其它必需的补充剂。培养条件，如温度、ph等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，并且对普通技术人员来说将是显而易见的。
[0254]
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌至培养基中。如果在细胞内产生抗体，那么作为第一步，例如通过离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。carter等人,《生物技术(bio/technology)》10:163
‑
167(1992)描述了一种用于分离分泌到大肠杆菌的周质空间的抗体的程序。简单说来，在乙酸钠(ph 3.5)、edta和苯甲基磺酰氟(pmsf)的存在下，在约30分钟内将细胞糊解冻。细胞碎片可以通过离心去除。在抗体被分泌至培养基中的情况下，一般先使用市售的蛋白质浓缩过滤器，例如艾米康(amicon)或密理博(millipore)pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。可在前述任一步骤中包含蛋白酶抑制剂，如pmsf，以抑制蛋白水解，且可以包含抗生素以防止外来污染物的生长。
[0255]
由细胞制备的抗ifnar1抗体和其抗原结合片段可以使用例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析、deae
‑
纤维素离子交换色谱法、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱法纯化，其中亲和色谱法是优选的纯化技术。
[0256]
在某些实施方式中，固定在固相上的蛋白质a用于抗体和其抗原结合片段的免疫亲和纯化。蛋白质a作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白fc结构域的物种和同种型。蛋白质a可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(lindmark等人,《免疫学方法杂志(j.immunol.meth.)》62:1
‑
13(1983))。蛋白质g推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(guss等人,《欧洲分子生物学杂志(embo j.)》5:1567 1575(1986))。亲和配体所附接的基质最通常是琼脂糖，但其它基质也是可用的。机械上稳定的基质，如受控孔玻璃或聚
(苯乙烯二乙烯基)苯，允许比琼脂糖可以实现的更快的流速和更短的处理时间。当抗体包括ch3结构域时，bakerbond abx
tm
树脂(新泽西州菲利普斯堡(phillipsburg,n.j.)j.t.baker)可用于纯化。用于蛋白质纯化的其它技术，如离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相hplc、二氧化硅上的色谱、肝素sepharose
tm
上的色谱、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的色谱、色谱焦聚、sds
‑
page以及硫酸铵沉淀也是可用的，取决于待回收的抗体。
[0257]
在任何初步纯化步骤之后，可使用ph值在约2.5
‑
4.5之间的洗脱缓冲液对包含所关注的抗体和污染物的混合物进行低ph值疏水相互作用色谱，优选在低盐浓度下进行(例如约0
‑
0.25m盐)。
[0258]
药物组合物
[0259]
本公开进一步提供包括抗ifnar1抗体或其抗原结合片段和一或多种药学上可接受的载体的药物组合物。
[0260]
用于本文所公开的药物组合物的药学上可接受的载体可包含例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮/分散剂、螯合剂(sequestering/chelating agent)、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、本领域中已知的其它组分或其各种组合。
[0261]
合适的组分可包含例如抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。合适抗氧化剂可包含例如甲硫氨酸、抗坏血酸、edta、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、硫代乙醇酸、硫代山梨糖醇、丁基化羟基苯甲醚(butylated hydroxanisol)、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本文所公开，在如本文所提供的包含抗体或抗原结合片段和结合物的组合物中包含一种或多种抗氧化剂，如甲硫氨酸，减少抗体或抗原结合片段的氧化。此氧化减少防止或减少结合亲和力的损失，由此提高抗体稳定性并使保存期最大化。因此，在某些实施方式中，提供了包括一种或多种如本文所公开的抗体或其抗原结合片段和一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的组合物。还提供了通过将抗体或抗原结合片段与一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸混合来防止如本文所提供的抗体或抗原结合片段的氧化、延长其保存期和/或提高其功效的方法。
[0262]
为了进一步说明，药学上可接受的载体可包含例如水性媒剂，如氯化钠注射液、林格氏注射液(ringer's injection)、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、或右旋糖和乳酸林格氏注射液；非水性媒剂，如植物来源的非挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油；抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂；等渗剂，如氯化钠或右旋糖；缓冲剂，如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；抗氧化剂，如硫酸氢钠；局部麻醉剂，如盐酸普鲁卡因(procaine hydrochloride)；悬浮剂和分散剂，如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；乳化剂，如聚山梨醇酯80(tween
‑
80)；螯合剂，如乙二胺四乙酸(edta)或乙二醇四乙酸(egta)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。用作载体的抗微生物剂可添加至多剂量容器中的药物组合物中，所述抗微生物剂包含苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)和苄索氯铵(benzethonium chloride)。合适的赋形剂可包含例如水、生理盐水、右旋糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可包含例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂、稳定剂、
溶解性增强剂或如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。
[0263]
药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、丸剂、胶囊、片剂、持续释放制剂或散剂。口服制剂可包含标准载体，如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
[0264]
在某些实施方式中，药物组合物被配制成可注射组合物。可注射的药物组合物可以任何常规形式制备，如例如液体溶液、悬浮液、乳液或适合产生液体溶液、悬浮液或乳液的固体形式。注射用制剂可包含可立即用于注射的无菌和/或无热原质溶液；仅在使用之前准备与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品，如冻干粉，包含皮下用片剂；可立即用于注射的无菌悬浮液；仅在使用之前准备与媒剂组合的无菌干燥不溶性产品；以及无菌和/或无热原质乳液。溶液可以是水性或非水性的。
[0265]
在某些实施方式中，单位剂量的肠胃外制剂被包装在安瓿、小瓶或带针头的注射器中。用于肠胃外施用的所有制剂都应是无菌且无热原质的，正如本领域中已知和实践的那样。
[0266]
在某些实施方式中，无菌冻干粉是通过将如本文中所公开的抗体或抗原结合片段溶解于合适溶剂中制备。溶剂可含有改善粉末或由粉末制备的复原溶液的稳定性或其它药理学组分的赋形剂。可使用的赋形剂包含但不限于水、右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适的试剂。溶剂可以含有缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾、或本领域的技术人员已知的其它此类缓冲剂，在一个实施方式中，缓冲剂呈约中性ph。随后在本领域技术人员已知的标准条件下对溶液进行无菌过滤，之后进行冻干，得到所需制剂。在一个实施方式中，将所得溶液分配到小瓶中进行冻干。每个小瓶可以含有单剂量或多剂量的抗ifnar1抗体或其抗原结合片段或其组合物。小瓶过填充超出一次剂量或一组剂量所需的较少量(例如约10％)是可接受的，以便于抽取准确的样品且准确给药。冻干粉末可在适当条件下储存，如在约4℃至室温下。
[0267]
用注射用水复原冻干粉提供了用于肠胃外施用的配制物。在一个实施方式中，为进行复原，将无菌和/或无热原质水或其它液态合适载体添加至冻干粉中。精确量取决于所给出的所选疗法，且可凭经验确定。
[0268]
使用方法
[0269]
本公开还提供治疗受试者的i型ifn相关疾病或病况的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所提供的抗体或其抗原结合片段或本文所提供的药物组合物。在某些实施方式中，i型ifn相关疾病或病况为ifnα和/或ifnω相关疾病或病况。
[0270]
在一些实施方式中，i型ifn相关疾病或病况的特征在于表达或过度表达i型干扰素(ifn)和/或i型ifn标签基因。
[0271]
如本文所用，术语“标签基因”或“基因标签”或“基因表达标签”是指由于改变的或不变的生物过程或病原性医疗病况(如自身免疫疾病)而发生的具有基因表达的独特特征模式的细胞中的单一或组合的基因群组。理论上可以由基因表达标签定义的表型范围介于预测患有疾病的个体的存活或预后的表型，用于区分疾病的不同亚型的表型到预测特定路径的活化的表型。基因标签可以理想地用于选择对于特定治疗将有效的患者群组。
[0272]
在某些实施方式中，特定疾病中i型干扰素标签基因可以使用本领域中已知的方法获得，所述方法如微阵列(参见例如li等人,《临床实验免疫学(clin exp immunol.)》
2010年3月；159(3):281
‑
291；和harman等人,《血液(blood)》2011 118:298
‑
308)。
[0273]
ifn
‑
i或i型ifn标签基因的过度表达已在数种自身免疫疾病中证实，包含全身性红斑狼疮(sle)、肌炎、干燥综合征、类风湿性关节炎、全身性硬化症、硬皮病、多发性硬化症(ms)、特发性炎性肌病(iim)和类风湿性关节炎(ra)(psarras a,等人,《风湿病学(rheumatology)》(牛津(oxford))56:1662
‑
1675(2017).，lee
‑
kirsch ma等人,《医学年评(annu rev med)》68:297
‑
315(2017))。阻断针对ifn
‑
i(khamashta met等人《风湿病年鉴(ann rheum dis.)》；75(11):1909
‑
1916(2016))或ifnar1(furie ret等人,《关节炎和风湿病学(arthritis rheumatol)》69:376
‑
386(2017).)的抗体证明在治疗患有活跃中度至重度sle的患者方面有效。
[0274]
在某些实施方式中，i型ifn相关疾病或病况包含但不限于hiv感染或后天免疫缺乏症候群(aids，其为具有自身免疫性组成部分的病毒性疾病)、炎性肠病(ibd)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森病(autoimmune addison's disease)、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(aied)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(alps)、自身免疫性血小板减少性紫癜(atp)、白塞氏病(behcet's disease)、心肌病、乳糜泻
‑
疱疹样皮炎；慢性疲劳免疫功能紊乱综合征(cfids)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(cipd)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、克雷斯综合征(crest syndrome)、克罗恩氏病(crohn's disease)、德戈斯氏病(degos'disease)、幼年型皮肌炎、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛
‑
纤维肌炎、牛皮癣、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性原发性甲状腺功能减退、格雷夫斯氏病、吉兰
‑
巴雷综合征(guillain
‑
barre syndrome)、桥本氏甲状腺炎、破坏性甲状腺炎伴有甲状腺功能减退、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(itp)、特发性炎性肌病(iim)、iga肾病、igm多发性神经病、胰岛素依赖型糖尿病(iddm)、青少年慢性关节炎(斯提耳氏病(still's disease))、梅尼尔氏病(meniere'sdisease)、混合性结缔组织病、多发性硬化症(ms)、重症肌无力、雷诺氏综合征、掌跖脓疱病(ppp)、糜烂型扁平苔癣、大疱性天疱疮、大疱性表皮松懈、接触性皮炎和特应性皮炎、多发性神经根炎、恶性贫血(pemacious anemia)、结节性多动脉炎、多软骨炎、多内分泌腺综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣性关节炎、雷诺现象(raynaud's phenomena)、莱特尔氏综合征(reiter's syndrome)、风湿热、类风湿性关节炎(ra)、青少年类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性全身性硬化症(pss)，又称为全身性硬化症(ss))、僵人综合征、全身性红斑狼疮(sle)、肌炎、干燥综合征、高安氏动脉炎(takayasu arteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、乳糜泻、慢性阻塞性肺病(copd)、葡萄膜炎、白癜风和韦格纳氏肉牙肿病(wegener's granulomatosis)。
[0275]
在某些实施方式中，ifnβ介导的ifnar1活化在本文所提供的治疗方法中未抑制。如本文所用，“未抑制”意指对ifnβ介导的ifnar1活化水平的小于20％的抑制。在某些实施方式中，治疗方法进一步包括施用治疗有效量的ifnβ。认为ifnβ施用进一步恢复ifnβ介导的ifnar1活化的至少一部分。
[0276]
如本文所提供的抗体或抗原结合片段的治疗有效量将取决于本领域中已知的各种因素，如例如受试者的体重、年龄、既往病史、目前的药物治疗、健康状况和交叉反应的可能性、过敏性、敏感性和不良副作用，以及施用途径和疾病发展的程度。如由这些和其它情况或要求所指示，本领域普通技术人员(例如医生或兽医)可以按比例减少或增加剂量。
[0277]
在某些实施方式中，如本文所提供的抗体或抗原结合片段可以约0.01mg/kg至约100mg/kg的治疗有效剂量施用。在某些实施方式中，施用剂量可在治疗过程中改变。例如，在某些实施方式中，初始施用剂量可以高于后续施用剂量。在某些实施方式中，取决于受试者的反应，施用剂量可在治疗过程中改变。
[0278]
可以调整给药方案以提供最优的所需反应(例如治疗反应)。例如，可施用单次剂量，或可随时间推移施用若干分次剂量。
[0279]
本文所公开的抗体和抗原结合片段可通过本领域中已知的任何途径施用，如例如肠胃外(例如皮下、腹膜内、静脉内(包括静脉内输注)、肌肉内或皮内注射)或非肠胃外(例如口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部)途径。
[0280]
在一些实施方式中，本文所公开的抗体或其抗原结合片段可以单独施用或与一种或多种额外治疗手段或药剂组合施用。举例来说，本文所公开的抗体或其抗原结合片段可以与另一种治疗剂组合施用，另一种治疗剂例如ifn
‑
β、抗ifnα抗体、抗ifn
‑
β抗体、抗tnf抗体、抗tnf受体抗体或可溶tnf受体。
[0281]
在这些实施方式中的某些实施方式中，与一种或多种额外治疗剂组合施用的如本文所公开的抗体或抗原结合片段可以与所述一种或多种额外治疗剂同时施用，并且在这些实施例中的某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段和所述额外治疗剂可以作为同一药物组合物的一部分施用。然而，与另一种治疗剂“组合”施用的抗体或抗原结合片段不必与所述药剂同时施用或以同一组合物施用。在另一种药剂之前或之后施用的抗体或抗原结合片段被认为与所述药剂“组合”施用，如本文中所使用的短语，即使抗体或抗原结合片段和第二药剂是通过不同途径施用的。当可能时，根据额外治疗剂的产品信息表单中列出的时间表或根据主治医师案头参考2003(physicians'desk reference 2003)(主治医师案头参考(physicians'desk reference),第57版；医学经济学公司(medical economics company)；isbn:1563634457；第57版(2002年11月))或本领域中熟知的方案，施用与本文中所公开的抗体或其抗原结合片段组合施用的额外治疗剂。
[0282]
本公开还提供抑制表达或过度表达ifnα和/或ifnω的细胞的生物活性的方法，其包括使所述细胞与本文所提供的抗体或其抗原结合片段接触。
[0283]
在一些实施方式中，本公开提供检测样品中ifnar1的存在或水平的方法，其包括使样品与本文所提供的抗体或其抗原结合片段接触。
[0284]
在一些实施方式中，本公开提供检测或治疗性试剂盒，其包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段和任选地与可检测部分结合的使用说明书。试剂盒可以适用于检测ifnar1或用于i型ifn相关疾病或病况的治疗用途。
[0285]
在一些实施方式中，本公开还提供本文所提供的抗体或其抗原结合片段用于制造治疗受试者的i型ifn相关疾病或病况的药剂，用于制造诊断i型ifn相关疾病或病况的诊断试剂的用途。
[0286]
提供以下实施例是为了更好地说明要求保护的发明，而不应理解为限制本发明的范围。下述所有特定组合物、材料和方法完全或部分地落入本发明的范围内。这些具体组合物、材料和方法并非旨在限制本发明，而仅为了说明落入本发明范围内的具体实施方式。在不脱离本发明范围的情况下，本领域的技术人员无需履行发明能力即可开发出等效组合物、材料和方法。应理解，可以在本文所述的程序中进行许多变化，同时仍保持在本发明的
范围内。本发明人希望此类变化形式纳入本发明的范围内。
[0287]
实施例：
[0288]
材料
[0289]
脂染胺2000购自英杰公司(invitrogen inc)。同种型对照购自百进生技公司(biolegend inc)。hek293t细胞系为购自atcc的产品。人ifnα2b为购自cedarlane公司的产品。十二种不同ifnα亚型购自pbl分析科学(pbl assay science)。人ifnω为购自r&d公司的产品。人ifnβ购自派普泰克(peprotech)。
[0290]
如下制备pbs溶液：将0.27g kh2po4、1.42g na2hpo4、8g nacl和0.2g kcl溶解于适当量的水中，将ph调节至7.2
‑
7.4。用水将最终体积补至1l。
[0291]
facs缓冲液为含有2％(v/v)胎牛血清和2mm edta的pbs溶液。
[0292]
根据pct公开号wo2018/010140中的公开内容制备ifnar1单克隆抗体10c2和10c9。
[0293]
制造ifnar1单克隆抗体的方法参考约翰
·
威利父子(john wiley&sons)公司1995年的《当代免疫学实验手册(current protocol in immunology)》。
[0294]
实施例1：ifnar1单克隆抗体7g4和10c5的产生
[0295]
使用常规杂交瘤方法产生抗体7g4和10c5。一般来说，用人ifnar1抗原使小鼠免疫，并且获取脾细胞并与永生细胞系融合以产生杂交瘤细胞系。针对与人ifnar1的结合亲和力筛选由杂交瘤细胞分泌的抗体，并且鉴别表达7g4和10c5抗体的杂交瘤细胞系。
[0296]
按照制造商说明书，使用trizol(英杰公司)裂解杂交瘤细胞系7g4和10c5以提取杂交瘤细胞系的rna。使用oligo dt(英杰公司)将所获得的rna溶液逆转录为cdna。使用所获得的cdna作为模板，使用重链引物对(包含重链引物f和重链引物r)和轻链引物对(包含轻链引物f和轻链引物r)进行pcr扩增，参见下表5。
[0297]
表5
[0298]
引物名称序列重链引物f5'
‑
sar gtn mag ctg sag sag tc
‑
3'(seq id no:29)重链引物r5'
‑
cttgaccaggcatcctagagtca
‑
3'(seq id no:30)轻链引物f5'
‑
gayattgtgmtsacmcarwctmca
‑
3'(seq id no:31)轻链引物r5'
‑
ggatacagttggtgcagcatc
‑
3'(seq id no:32)
[0299]
注：以上两个正向引物为简并引物。s为c或g；r为a或g；n为a、c、g或t；m为a或c；y为c或t；w为a或t。
[0300]
依序获得和测序编码重链的片段和编码轻链的片段。
[0301]
抗体7g4的重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列示于图6中，其中相应地标记cdr1(氨基酸残基31
‑
35)、cdr2(氨基酸残基50
‑
66)和cdr3(氨基酸残基99
‑
112)的序列。
[0302]
抗体7g4的轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列示于图7中，其中相应地标记cdr1(氨基酸残基24
‑
34)、cdr2(氨基酸残基50
‑
56残基)和cdr3(氨基酸残基89
‑
97)的序列。
[0303]
抗体10c5的重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列示于图8中，其中相应地标记cdr1(氨基酸残基31
‑
35)、cdr2(氨基酸残基50
‑
66)和cdr3(氨基酸残基99
‑
112)的序列。
[0304]
抗体10c5的轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列示于图9中，其中相应地标记cdr1(氨基酸残基24
‑
34)、cdr2(氨基酸残基50
‑
56)和cdr3(氨基酸残基89
‑
97)的序列。
[0305]
4.抗体序列的分析
[0306]
使用igblast工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)分析抗体7g4和10c5的核酸片段。使用kabat编号系统划定v结构域。结果如下。
[0307]
编码抗体7g4和10c5的重链的v基因、d基因和j基因分别对应于小鼠ighv1
‑
69基因、ighd2
‑
4基因和ighj4基因。抗体7g4(seq id no:7)和抗体10c5(seq id no:9)的重链可变区、小鼠v区(seq id no:15)的氨基酸序列之间的比对结果示于图10中。编码抗体7g4和10c5的轻链的v基因和j基因分别对应于小鼠igkv13
‑
84基因和igkj4基因。抗体7g4(seq id no:8)和抗体10c5(seq id no:10)的轻链可变区、小鼠v区(seq id no:16)的氨基酸序列之间的比对结果示于图11中。
[0308]
实施例2：7g4和10c5结合于人ifn
‑
i受体ifnar1。
[0309]
按照下文简要描述的程序，使用流式细胞测量术(facs)测试7g4和10c5抗体的结合。
[0310]
构造全长的人ifnar1的表达载体。根据"分子克隆(molecular cloning)",《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》，美国冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press,u.s.)；第4版,2012中描述的一般程序，人ifnar1全长cds序列(nm_000629)经由限制位点nhei和ecori插入到载体pires2
‑
egfp(购自addgene)中。因此获得构造体质粒pires2
‑
egfp
‑
ifnar1。
[0311]
使用脂染胺2000将质粒pires2
‑
egfp
‑
ifnar1转染到hek293t细胞中。24小时后，将细胞用2mm edta稀释于pbs中以制备单细胞悬浮液，其随后以10,000个细胞/200μl/孔的密度添加到96孔u底板中。在2200rpm下离心3min之后，舍弃上清液并且收集细胞球粒并且再悬浮。
[0312]
将测试抗体(7g4或10c5或同种型抗体)用facs缓冲液稀释到10μg/ml的浓度，且与再悬浮的细胞球粒在4℃下培育30min。在培育之后，使细胞用200μl facs缓冲液离心和再悬浮，之后进行下一次离心和再悬浮。
[0313]
将在facs缓冲液中以1:400稀释的经pe标记的山羊抗小鼠igg抗体(百进生技)添加到各孔中。将细胞再悬浮并且在4℃下于暗处培育30min。在培育之后，将板离心，舍弃上清液，并且如上文所描述洗涤细胞一次并且通过添加200μl facs缓冲液再悬浮。最后，使用流式细胞仪guava(密理博(millipore))针对细胞gfp和pe信号分析再悬浮的细胞。
[0314]
结果显示于图1a和1b中。显示7g4和10c5抗体特异性结合于过度表达人ifnar1的细胞，因为曲线图中的gfp阳性细胞向右移位。
[0315]
实施例3：7g4和10c5与人ifnar1的不同截短形式的结合。
[0316]
构造具有不同长度的人ifnar1变体和截断形式并且在293t细胞上表达。变体包含：ifnar1
‑
aa1
‑
557(即全长)、ifnar1
‑
δaa32
‑
126(即不存在跨越氨基酸残基32至126的子结构域)、ifnar1
‑
δaa127
‑
227(即不存在跨越氨基酸残基127至227的子结构域)、ifnar1
‑
δaa231
‑
329(即不存在跨越氨基酸残基231至329的子结构域)、ifnar1
‑
δaa331
‑
432(即不存在跨越氨基酸残基331至432的子结构域)、ifnar1
‑
δaa32
‑
126,δaa331
‑
432(即不存在跨越氨基酸残基32至126的子结构域和跨越氨基酸残基331至432的子结构域)、ifnar1
‑
δaa231
‑
432(即不存在跨越氨基酸残基231至432的子结构域)和ifnar1
‑
δaa32
‑
227(即不存在跨越氨基酸残基32至227的子结构域)。
[0317]
根据实施例1的程序通过流式细胞测量术检测7g4和10c5抗体与分别过度表达8个
人ifnar1变体的293t细胞的结合。
[0318]
如图2a和图2b中所示，抗体7g4和10c5都显示与8个所测试的人ifnar1变体类似的结合特征。确切地说，其两者都结合于全长ifnar1(即ifnar1
‑
aa1
‑
557)、ifnar1
‑
δaa32
‑
126、ifnar1
‑
δaa331
‑
432和ifnar1
‑
δaa32
‑
126,δaa 331
‑
432，并且对于这些4个变体的结合活性呈现类似。结果还指示两种抗体都不结合于跨越人ifnar1的氨基酸残基32
‑
126或氨基酸残基331
‑
432的片段，因为不存在任何或两种片段似乎不影响两种抗体与人ifnar1截短变体的结合。两种抗体都很好地结合于ifnar1
‑
δaa32
‑
126,δaa331
‑
432,，指示人ifnar1的127
‑
330aa片段足以将7g4和10c5结合于人ifnar1。
[0319]
然而，当跨越氨基酸残基127
‑
227和氨基酸残基231
‑
239的片段中的任一个或两个缺失时，消除抗体7g4和10c5与人ifnar1的结合。这显示两种抗体都结合于人ifnar1的氨基酸残基127
‑
227内的第一结合片段和氨基酸残基231
‑
239内的第二结合片段两者。
[0320]
这证明7g4和10c5的结合表位很可能在人ifnar1的127
‑
329aa片段内。
[0321]
实施例4：7g4和10c5在与10c2和10c9的表位不同的表位处结合于人ifnar1
[0322]
为了进一步研究7g4和10c5的结合表位，并且为了与10c2和10c9的结合表位比较，在293t上构造和表达人/小鼠嵌合ifnar1变体(即ifnar1
‑
m149
‑
214)。ifnar1
‑
m149
‑
214具有seq id no:69的氨基酸序列，即，在野生型人ifnar1中跨越氨基酸残基149
‑
214(seq id no:63)的片段被小鼠ifnar1单应序列(seq id no:64)替换。根据实施例1的程序通过流式细胞测量术检测10c2、10c9、7g4和10c5抗体与过度表达ifnar1
‑
wt和ifnar1
‑
m149
‑
214的293t的结合。抗体稀释到图14a
‑
14d中的指示浓度。
[0323]
如图14a和图14b中所示，10c2和10c9显示未或显著减弱对ifnar1
‑
m149
‑
214的结合，尽管10c2和10c9都显示对野生型ifnar1的浓度依赖性结合。相比之下，7g4和10c5两者显示与野生型ifnar1和ifnar1
‑
m149
‑
214相当的结合(图14c和图14d)。
[0324]
这清楚地显示7g4和10c5在人ifnar1上的结合位点方面不同于10c2和10c9。具体来说，显示跨越人ifnar1的氨基酸残基149
‑
214的片段对于10c2和10c9结合于人ifnar1是必需的。但对于7g4和10c5来说结果不同，指示7g4和10c5与此片段的结合不同于10c2和10c9与此片段的结合。
[0325]
实施例5：抗体7g4和10c5对阻断报告细胞系中的人ifn
‑
i的生物活性的作用。
[0326]
ifn
‑
i报告细胞系如pct公开案wo2018/010140中所描述构造。将报告细胞添加到96孔板(30,000个细胞/200μl/孔)中并且培养24h。去除细胞培养物中的上清液并且用在补充有10％(v/v)fbs的dmem中以10μg/ml的抗体浓度稀释的相应测试抗体(7g4或10c5)处理细胞。将细胞接着在37℃下培育1h，随后用处于100μl dmem中的1ng/ml ifnα2b或50pg/ml人ifnβ处理。还单独地测试不同人ifnα因子，即ifnα2a、ifnα8、ifnα10、ifnα1、ifnα21、ifnα5、ifnα14、ifnα17、ifnα7、ifnα6、ifnα4和ifnα16，但其中的每一者在0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000个单位/ml的连续稀释度下进行测试。ifnω也单独地测试，不同之处在于浓度为50pg/ml。在37℃，5％co2下进一步培养经处理的细胞24小时，随后通过流式细胞测量术分析细胞，以确定抗体对报告细胞中的ifn诱导的gfp表达的阻断作用。
[0327]
阻断作用可以计算为：(对照抗体的gfp阳性率
‑
阻断抗体的gfp阳性率)/(对照抗体的gfp阳性率
‑
空白对照的gfp阳性率)*100％
[0328]
实验结果示于表6和图3中。
[0329]
表6
[0330]
ifn型7g410c510c210c9ifnα2b ifnα2a ifnα8 ifnα10 ifnα1 ifnα21 ifnα5 ifnα14 ifnα17 ifnα7 ifnα6 ifnα4 ifnα16 ifnω ifnβ /
‑
/
‑

[0331]“ ”表示大于80％的阻断作用，
[0332]“ ”表示40％和80％之间的阻断作用，
[0333]“ /
‑”
表示小于10％的阻断作用。
[0334]
如表6中所示，抗体7g4和10c5都以大于80％的阻断率阻断由所有13种不同的ifnα因子和ifnω诱导的gfp表达。这与用称为10c2和10c9的抗人ifnar1抗体的对照抗体观察到的结果相当。然而，与10c2和10c9相比，抗体7g4和10c5都显示对由ifnβ诱导的gfp表达的阻断小于10％，并且这比用10c2和10c9观察到的阻断低得多，这对ifnβ诱导的gfp表达的阻断率是40％
‑
80％。
[0335]
类似结果也显示于图3中。gfp阳性细胞的百分比反映包含ifnα、ifnω和ifnβ的ifn
‑
i的活化信号。在不添加任何干扰素(模拟对照)的情况下，背景百分比为约5％。添加1ng/ml人ifnα2b、50pg/ml ifnω和50pg/ml ifnβ都诱导gfp阳性细胞百分比的大于5倍增加(即，大于30％、40％或大于50％)，指示人ifnar1的活化。将如图3b中所示的12种其它ifnα亚型以阈值浓度添加，该浓度提供相对于模拟对照大于5倍的活化。
[0336]
7g4和10c5两者都显著阻断人ifnα2b和ifnω的生物活性，将信号抑制到低于10％或甚至与模拟对照相当(图3a、图3c)。还在12种不同人ifnα亚型上观察到类似阻断作用(图3b)。
[0337]
与对ifnα和ifnω的阻断相反，7g4和10c5都显示对人ifnβ的最小或不可检测的阻断作用(图3d)，并且在7g4和10c5存在下的信号与同种型对照的信号相当(例如大于40％)。此将抗体7g4和10c5与仍阻断人ifnβ介导的活化的现有抗体10c2区分开，且显示约20％的信号，即仅针对7g4和10c5观察到的一半信号。在阻断人ifnβ的作用下，在7g4与10c5之间未观测到显著差异。
[0338]
总之，ifnar1单克隆抗体7g4和10c5可以阻断所有ifnα亚型和ifnω，但并不阻断
ifnβ。
[0339]
实施例6：抗体7g4和10c5在阻断通过ifnα2b和ifnβ的病毒复制的抑制中的作用。
[0340]
简单来说，在ifnα2b或ifnβ或空白(作为模拟对照)存在下，在病毒复制分析中测试抗体。在第1天，在12孔板中制备测试细胞且用聚
‑
l
‑
赖氨酸处理。在第2天，将各别抗ifnar1测试抗体(即，同种型，10c2、7g4或10c5)以10μg/ml添加到细胞中并且培育1h，随后添加ifnα或ifnβ并且相继地接着培育(例如，培育1h或8h)。接着，洗涤孔并且用适当的测试病毒以合适的感染倍率(moi)感染细胞。24或48小时后，测试荧光素酶活性(普洛麦格)。不同测试病毒的分析设置在下表7中列出。
[0341]
表7
[0342]
测试病毒和moi测试细胞ifnαifnβ病毒复制分析sinv
‑
luc；moi：0.01293t细胞200pg/ml50pg/ml荧光素酶活性flu
‑
luc；moi：0.01a549细胞12.5pg/ml12.5pg/ml荧光素酶活性hsv；moi：0.1hela细胞200pg/ml50pg/ml溶菌斑分析
[0343]
如图4a、4c和4e中所示，当存在ifnα时，病毒复制水平被显著抑制(参见同种型的结果)，并且抗体7g4和10c5的存在使病毒复制恢复到与模拟对照(即不存在ifnα)相当的水平。此类结果也在10c2下显示，且可归因于ifnα介导的ifnar1活化的抑制。
[0344]
在同种型的结果中ifnβ还显著抑制病毒复制水平，如图4b、4d和4f中所示。然而，与用ifnα的结果相反，抗体7g4和10c5两者的存在并未改变病毒复制水平，且其保持与用同种型对照观察到的情况一样低。相比之下，抗体10c2显示将病毒复制恢复到显著高于同种型对照的水平的水平。这进一步证明抗体7g4和10c5都不阻断ifnβ介导的病毒复制抑制，并且这将两种抗体与现有抗体(如10c2)区分开。
[0345]
实施例7：抗体7g4和10c5阻断来自sle患者的血清中的ifn
‑
i的作用。
[0346]
按照根据实施例5的相同程序进行所述分析，不同之处在于用来自sle患者的血清替换1ng/ml人ifnα2b。其它步骤保持不变。也就是说，用相应抗体处理ifn
‑
i报告细胞系，之后与来自sle患者的血清一起培育，并且测定gfp阳性细胞的比率。
[0347]
结果示于图5中。同种型抗体显示约15％的gfp阳性细胞百分比，指示ifnar1由来自sle患者的血清中的ifn
‑
i活化。相比之下，所有三种测试抗体10c2、7g4和10c5将百分比抑制了几乎3倍，达到与模拟对照(即不存在sle患者血清)的水平相当的水平。这指示抗体7g4和10c5在抑制sle患者血清中由ifn
‑
i介导的ifnar1活化方面同样有效。
[0348]
实施例8：抗体人源化
[0349]
1.亲本抗体的序列分析
[0350]
将vh/vl cdr残基用kabat编号系统标注(参见图6
‑
9)。序列分析揭露了在cdr内无主要风险热点，包含未配对半胱氨酸残基、n
‑
糖基化位点和脱氨基位点。
[0351]
2.人生殖系受体家族子集的选择
[0352]
基于小鼠抗体与人生殖系构架区之间的序列同源性，选择最佳人生殖系构架接受体ighv1
‑
46*01和igkv1d
‑
39*01用于cdr移植。ighv1
‑
46*01和igkv1d
‑
39*01的经编码氨基酸序列以seq id no:59和60提供。基于最佳序列同源性选择人j
‑
区。
[0353]
3.反向突变设计
[0354]
根据同源模型的3d结构，将cdr的距离内的残基选择为潜在的回复突变位点，
5.0)中20μg/ml的抗人igg fc以10μl/min(目标约10000ru)通过每一通道中的两个流动细胞的活化表面。剩余的活性耦合位点用10分钟注射1m乙醇胺阻断。在2小时内维持低流动速率使固定蛋白质平衡。
[0368]
2.结合动力学的测量：使用fc1作为参考细胞，在通道1及2中的流动细胞fc2中捕获每一抗体，分别为约250ru，之后注射不同浓度的抗原样品。用biacore 8k评估软件计算具有捕获抗体的信号减去无捕获抗体的信号。运行缓冲液为hbs
‑
ep (10mm hepes、150mm nacl、3mm edta、0.05％表面活性剂p20)。
[0369]
抗体
‑
抗原相互作用的结果示于下表9中。
[0370]
表9
[0371][0372]
3.阻断hu7g4变体的活性
[0373]
使用与实施例5中类似的方法测试hu7g4变体对阻断报告细胞系中的人ifn
‑
i的生物活性的作用。所测试的hu7g4变体(hu4
‑
5至hu4
‑
16)维持对ifnα的阻断活性(图13a)，但不抑制ifnβ(参见图13b)。
[0374]
实施例10：人源化7g4抗体在对人ifnar1具有不变的结合能力的cdr序列中容许氨基酸残基取代
[0375]
1.产生针对人ifnar1的人源化单克隆抗体
[0376]
选择人源化抗体hu4
‑
6作为突变的基础。制造三个突变体：mut
‑
1(在hcdr3中的a108g)、mut
‑
2(在lcdr2中的t53s和s56t)和mut
‑
3(在hcdr3中的a108g、在lcdr2中的t53s和s56t)。三个突变体的序列示于表10中。
[0377]
表10
[0378][0379]
将重链和轻链的全长编码区克隆到所选择的人ig主链中以用于抗体表达。用含有重链基因的质粒和含有轻链基因的质粒通过脂染胺2000(赛默飞世尔科技(thermo fisher scientific))以比率1:1共转染100mm盘中的hek 293t细胞。在转染后24小时、48小时和72小时时收集培养物上清液。使用蛋白质a亲和树脂(repligen)从培养物上清液纯化单克隆抗体(mab)。
[0380]
2.突变型抗体与人ifnar1的结合能力
[0381]
为了测试抗人ifnar1抗体与人ifnar1的结合，将抗人ifnar1抗体和同种型对照
mab稀释于图15a
‑
15b中指示浓度下的facs缓冲液中。按照实施例1的程序进行流式细胞测量术。
[0382]
每个样品的pe的中值荧光强度(mfi)用于测定抗体与人ifnar1的结合能力。
[0383]
如图15b中所示，cdr区中的一个或多个氨基酸残基的所有取代都不会影响本文所公开的抗体与人ifnar1的结合效率。
[0384]
虽然已经参照具体实施方式(其中一些是优选实施方式)特别显示和描述了本公开，但本领域的技术人员应理解，在不脱离本文所公开的本公开的精神和范围的情况下，可以在其中进行形式上和细节上的各种改变。