一种细胞培养血清替代物及其应用的制作方法

1.本发明涉及体外细胞培养技术领域，特别涉及一种细胞培养血清替代物及其应用。


背景技术：

2.通常情况下，动物细胞的培养采用添加有血清的培养基，因为血清中含有维持动物细胞生长所必需的成分，比如维生素、激素、生长因子、结合蛋白、脂质和其他微量元素等，并能促进细胞dna合成，这对细胞增殖有很大影响。但是，哺乳动物的血清价格昂贵，特别是fbs，使用10％浓度就将占用培养液成本的90％以上，而且不适合大规模的工业生产。更重要的是，血清的存在带来了很多问题，首先，动物来源的血清易受细菌、支原体、病毒等污染，受污染的血清往往会导致细胞生长缓慢，蛋白质产生减少，甚至死亡。其次，血清成分复杂，有一部分组成尚不清楚，血清的质量、各种因子的组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件、饲养条件、生产工艺和质量把控等的不同而不同，导致血清批次与批次之间不稳定，这些不确定的因素，为进一步深入研究带来困难。此外，血清中还存在大量杂蛋白，增加了下游分离纯化的难度和成本，并有可能使产品质量下降。因此，寻找成分明确，价格经济的血清替代物成为细胞培养的一种重要需求。


技术实现要素：

3.为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种细胞培养血清替代物及其应用。
4.为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
5.第一方面，本发明提供了一种细胞培养血清替代物，所述细胞培养血清替代物包括mrjp1蛋白、转铁蛋、egf、胆固醇、胰岛素、亚麻酸、亚油酸、花生四烯酸、柠檬酸铵铁，所述各成分添加到常规培养基中的最终浓度为：
6.mrjp1蛋白：10
‑
50mg/l，转铁蛋白：5
‑
20mg/l，egf：10
‑
30μg/l，胆固醇：10
‑
20mg/l，胰岛素：5
‑
15mg/l，亚麻酸：0.5
‑
10mg/l，亚油酸：0.5
‑
10mg/l，花生四烯酸：0.5
‑
10mg/l，柠檬酸铵铁：1
‑
2mg/l。
7.进一步地，所述细胞培养血清替代物还包括青霉素和链霉素。
8.进一步地，所述青霉素和链霉素的浓度均为100μg/ml。
9.第二方面，本发明还提供一种细胞培养基，所述培养基为dmem培养基，包含所述细胞培养血清替代物。
10.进一步地，所述dmem培养基还包括nahco3和hepes。
11.第三方面，本发明还提供一种细胞培养血清替代物在细胞培养中的应用。
12.进一步地，所述细胞培养血清替代物作为胎牛血清替代物用于培养人非小细胞肺癌细胞a549、人非小细胞肺癌细胞h1650、人肺腺癌细胞pc
‑
9或人胃癌细胞hgc
‑
27。
13.进一步地，所述培养是在无菌、5％co2和37℃的条件下进行的。
14.本发明的有益效果为：
15.本发明提供的细胞培养血清替代物可以维持贴壁培养的肿瘤细胞的正常生长和增殖，cck8结果显示，相较于血清培养组，肿瘤细胞在本发明提供的血清替代物中生长和增殖能力甚至更强，说明本发明的血清替代物对胎牛血清培养基的替代是可行的。此外，本发明提供的细胞培养血清替代物组分明确，可以添加到不同的基础培养基中，用于肿瘤细胞的体外培养，且来源丰富、成本低廉，具有良好的应用前景。
附图说明
16.利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
17.图1是本发明不同培养条件下a549细胞形态图；
18.图2是本发明不同培养条件下a549细胞生长状况图；
19.图3是本发明不同培养条件下h1650细胞形态图；
20.图4是本发明不同培养条件下h1650细胞生长状况图；
21.图5是本发明不同培养条件下pc
‑
9细胞形态图；
22.图6是本发明不同培养条件下pc
‑
9细胞生长状况图；
23.图7是本发明不同培养条件下hgc
‑
27细胞形态图；
24.图8是本发明不同培养条件下hgc
‑
27细胞生长状况图；
25.图9是本发明不同培养条件下pc
‑
9细胞生长曲线图；
26.图10是本发明不同培养条件下hgc
‑
27细胞生长曲线图。
具体实施方式
27.为了更清楚的说明本发明，对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
28.研究发现，蜂王浆有促进细胞生长、抗肿瘤、抗疲劳等生理功能。虽然从王浆中提取的粗蛋白(rjcp，crude protein from rj)能够促进昆虫tn
‑
5b1
‑
4细胞生长，每mg补充蛋白细胞数量比对照组多6.5倍，而用胎牛血清只增加了2.55倍。此外，提取的王浆粗蛋白也可影响细胞形态，刺激细胞粘附，但是，王浆粗蛋白(rjcp)对肿瘤细胞有毒性：使用rjcp培养肿瘤细胞7天，细胞数量减少了2.5倍。
29.而mrjps是蜂王浆的重要营养成分和活性物质，有大量基本氨基酸和必需氨基酸，mrjps属黄蛋白家族，共9个成员：包括mrjp1～mrjp9，mrjpl是mrjps家族中含量最为丰富的糖蛋白，约占mrjps总量的48％，mrjp1蛋白含量丰富且表达稳定。
30.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定，此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
31.下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。
32.实施例1
33.采用超高速离心法提取mrjp1蛋白，步骤如下：
34.取5g新鲜蜂王浆与等质量超纯水混合，充分溶解后过滤，将所得滤液经141000
×
g，4℃，离心2h，得到的产物为上、中、下三层的混合物，其中，上层为浅黄色的透明液体，中间层为浅黄色的软固体，下层为黄色固体，取中间层和下层的沉淀，充分溶解于2倍体积的超纯水中，经25000
×
g，4℃，离心40min，所得产物为上清液与沉淀，再取上清液，经141000
×
g，4℃，离心2h，得到的沉淀为浅黄色胶状物质，即为mrjp1蛋白。
35.将所得mrjp1蛋白经过sds
‑
page鉴定，可以得到分子量约为55kda的单一条带，与mrjp1蛋白的理论分子量相符。
36.将经过鉴定的mrjp1蛋白用bradford方法测定浓度，
‑
20℃保存备用。
37.实施例2
38.一种细胞培养血清替代物组合1，其各种成分的最终浓度为：
39.mrjp1蛋白：20mg/l，转铁蛋白：10mg/l，egf：10μg/l，胆固醇：10mg/l，胰岛素：10mg/l，亚麻酸：0.5mg/l，亚油酸：0.5mg/l，花生四烯酸：0.5mg/l，柠檬酸铵铁：1.5mg/l，青霉素：100μg/ml，链霉素：100μg/ml。
40.一种细胞培养血清替代物组合2，其各种成分的最终浓度为：
41.mrjp1蛋白：30mg/l，转铁蛋白：10mg/l，egf：10μg/l，胆固醇：10mg/l，胰岛素：10mg/l，亚麻酸：0.5mg/l，亚油酸：0.5mg/l，花生四烯酸：0.5mg/l，柠檬酸铵铁：1.5mg/l，青霉素：100μg/ml，链霉素：100μg/ml。
42.一种细胞培养血清替代物组合3，其各种成分的最终浓度为：
43.mrjp1蛋白：30mg/l，转铁蛋白：15mg/l，egf：15μg/l，胆固醇：10mg/l，胰岛素：10mg/l，亚麻酸：0.5mg/l，亚油酸：0.5mg/l，花生四烯酸：0.5mg/l，柠檬酸铵铁：1.5mg/l，青霉素：100μg/ml，链霉素：100μg/ml。
44.对照组胎牛血清组合物，其各种成分的最终浓度为：胎牛血清：10％，青霉素：100μg/ml，链霉素：100μg/ml。
45.dmem基础培养基的配置：取dmem干粉13.5g，nahco
3 3.7g，hepes 2.38g，用双蒸水溶解后在磁力搅拌器上搅拌均匀并定容至ll，然后用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
46.则四种细胞培养基的配置方法为：
47.替代物1培养基：一种细胞培养血清替代物组合1 dmem基础培养基；
48.替代物2培养基：一种细胞培养血清替代物组合2 dmem基础培养基；
49.替代物3培养基：一种细胞培养血清替代物组合3 dmem基础培养基；
50.胎牛血清培养基：对照组胎牛血清组合物 dmem基础培养基。
51.实施例3
52.将人非小细胞肺癌细胞a549冻存管从液氮中取出，立即置于37℃水浴中迅速融化细胞。用酒精擦拭消毒后将冻存管中的细胞悬液吸入离心管，加入1ml培养液，1000rpm离心5分钟。弃上清，用新鲜培养基将细胞沉淀轻轻吹打混匀，并移入细胞培养瓶中，加入适量培养基，在培养箱中进行培养。
53.当a549细胞生长至融合度为80％
‑
90％时进行传代，首先吸去培养液，用pbs洗涤
细胞2次，再加入0.25％的胰酶消化液，放入37℃培养箱中消化约2
‑
5分钟，用显微镜观察，细胞变圆并开始脱落时，吸去消化液，加入新鲜培养液，将细胞充分吹打并悬浮分散细胞，用血球计数板进行计数，按相同的细胞数接种4份继续培养，分别为采用实施例2中的替代物1培养基、替代物2培养基、替代物3培养基和对照组胎牛血清培养基同时进行培养，实验重复3次。
54.细胞计数，将贴壁的a549细胞用0.25％胰蛋白酶消化液消化后，加入完全培养基终止消化，并制成单细胞悬液，经台盼蓝染色后，用20μl枪头吸取20μl细胞悬液铺满自动细胞计数板。静置片刻，将细胞计数板插入counterstar自动细胞计数仪，即可读出存活细胞浓度、死亡细胞浓度、细胞存活率及结团细胞浓度等参数。
55.以替代物1培养基、替代物2培养基、替代物3培养基和胎牛血清培养基同时培养a549细胞，细胞的生长状况如图2所示，图1a为以胎牛血清培养基培养时a549细胞形态图，图1b为以替代物3培养基培养时a549细胞的形态图，可以看到，以替代物3培养基进行培养时a549细胞的细胞数最多，虽然细胞数仍然低于胎牛血清培养基组，但替代物3培养基培养的a549细胞形态与胎牛血清培养基培养的a549细胞形态相似，说明替代物培养基对胎牛血清培养基的替代是可行的。
56.实施例4
57.将人非小细胞肺癌细胞h1650与实施例3进行同样的实验。以替代物1培养基、替代物2培养基、替代物3培养基和胎牛血清培养基同时培养h1650细胞，细胞的生长状况如图4所示，图3a为以胎牛血清培养基培养时h1650细胞形态图，图3b为以替代物3培养基培养时h1650细胞的形态图，可以看到，以替代物3培养基进行培养时h1650细胞的细胞数最多，虽然细胞数仍然低于胎牛血清组，但替代物3培养基培养的h1650细胞形态与胎牛血清培养基培养的h1650细胞形态相似，说明替代物培养基对胎牛血清培养基的替代是可行的。
58.实施例5
59.将人肺腺癌细胞pc
‑
9与实施例3进行同样的实验。以替代物1培养基、替代物2培养基、替代物3培养基和胎牛血清培养基同时培养pc
‑
9细胞，细胞的生长状况如图6所示，图5a为以胎牛血清培养基培养时pc
‑
9细胞形态图，图5b为以替代物3培养基培养时pc
‑
9细胞的形态图，可以看到，以替代物3培养基进行培养时pc
‑
9细胞的细胞数最多，且高于胎牛血清培养基组，说明替代物培养基对胎牛血清培养基的替代是可行的。
60.实施例6
61.将人胃癌细胞hgc
‑
27与实施例3进行同样的实验，以替代物1培养基、替代物2培养基、替代物3培养基和胎牛血清培养基同时培养hgc
‑
27细胞，细胞的生长状况如图2所示，图1a为以胎牛血清培养基培养时hgc
‑
27细胞形态图，图1b为以替代物3培养基培养时hgc
‑
27细胞的形态图，可以看到，以替代物3培养基进行培养时hgc
‑
27细胞的细胞数最多，且高于胎牛血清培养基组，此外，替代物3培养基培养的a549细胞形态与胎牛血清培养基培养的hgc
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27细胞形态相似，说明替代物培养基对胎牛血清培养基的替代是可行的。
62.实施例7
63.将人非小细胞肺癌细胞a549，人非小细胞肺癌细胞h1650，人肺腺癌细胞pc
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9，人胃癌细胞hgc
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27分别用替代物3培养基和胎牛血清培养基于37℃5％co2的无菌培养箱中培养，当细胞单层长到80％时，用0.25％的胰蛋白酶消化，调整细胞悬液浓度，以1
×
105cells/ml接种到96孔板，每孔200μl，四周用pbs液封，待上述细胞分别培养至24h、48h、72h、96h后，每孔吸取上清100μl并加入10μlcck
‑
8，震荡摇匀，继续培养1h后，用酶标仪测量450nm波长下的od值。
64.图9和图10分别是pc
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9细胞和hgc
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27细胞在不同培养条件下的细胞生长曲线图，可以看到，以替代物3培养基进行培养时pc
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9细胞和hgc
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27细胞的生长速率略快于以胎牛血清培养基进行培养，说明替代物培养基对胎牛血清培养基的替代是可行的。
65.最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。