用于对虾肝肠孢虫荧光定量PCR检测的引物及方法与流程

技术特征：
1.一种用于快速检测对虾肝肠孢虫的荧光定量pcr法的特异性引物，其特征在于，该引物包含引物ehp146f和引物ehp146r，所述的引物ehp146f的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述的引物ehp146r的核苷酸序列如seq id no.2所示；其扩增序列146bp。2.一种用于检测对虾肝肠孢虫swp基因的标准品试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含swp标准质粒以及权利要求1所述的特异性引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，阴性质控品为含pmd19t空质粒的克隆菌株菌悬液，阳性质控品为swp克隆菌株的菌悬液。4.一种检测对虾肝肠孢虫的荧光定量pcr方法，其特征在于，所述方法采用权利要求2或3所述的标准品试剂盒，所述方法包括以下步骤：步骤1：样本的采集及提取，幼体、仔虾及小于2cm的幼虾取完整个体，大于2cm的幼虾、亚成年虾及成虾取肝胰腺；样品采集10～50mg，采用qiagendnaminikit试剂盒提取样品总dna；步骤2：将提取的待检样品和标准质粒置于荧光定量pcr反应体系中进行pcr扩增及荧光信号监测；所述pcr反应体系包括所述引物及takara tb green premix ex taqtm ii试剂；同时设置阳性质控品、阴性质控品对照和无模板对照；步骤3：根据标准质粒扩增的cq值，绘制标准曲线；步骤4：根据标准曲线及待检样品扩增的cq值，计算目标样品所含ehp拷贝数；其中：样品cq<35且有明显s型扩增曲线，结果为阳性，并可根据cq值和标准曲线计算拷贝数；样本cq本准曲且无明显s型扩增曲线，结果为阴性；阳性质控品cq值<35且有明显s型扩增曲线，同时阴性质控品和无模板对照cq模板对且无明显s型扩增曲线，判断结果有效。阳性质控品cq值≥35或阴性质控品和无模板对照cq值<35，判断结果无效。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量pcr反应体系总体积为25ul，包括tb green premix ex taq ii(tlirnaseh plus)(2*)12.5ul，所述的引物ehp146f和引物ehp146r各1.25ul，待检样品dna或标准质粒1ul，灭菌水9ul。6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量pcr扩增反应程序为95℃30s；40个循环，95℃5s，51℃30s。

技术总结
本发明涉及一种用于检测对虾肝肠孢虫的荧光定量PCR方法，该方法包括一对以虾肝肠孢虫孢壁蛋白SWP为靶基因的特异性引物，以及SWP标准品试剂盒。标准品试剂盒包括10倍梯度稀释的SWP标准质粒以及SWP标准菌株的菌悬液。本发明采用TBGreen荧光染料法，通过检测虾肝肠孢虫孢壁蛋白SWP,来定量检测养殖对虾肝肠孢虫感染，具有较高的灵敏度和特异性，可用于虾肝肠孢虫的快速检测和诊断，为虾肝肠孢虫感染的监测和早期防控奠定基础。监测和早期防控奠定基础。监测和早期防控奠定基础。


技术研发人员：叶键 许婷 施礼科 姜路辛 陈凡 郭水荣 王力 蒋静 陈喆
受保护的技术使用者：杭州市农业技术推广中心
技术研发日：2021.08.12
技术公布日：2021/10/19