密点麻蜥水提物在制备治疗肝纤维化的药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及密点麻蜥水提物在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。


背景技术：

2.肝纤维化(hepatic fibrosis，hf)是存在于大多数慢性肝脏疾病过程中的病理变化，主要表现为肝组织内细胞外基质(extracellular matrix，ecm)过度增生与沉积，从而导致肝脏组织结构异常改变，并影响其正常生理功能
1.。而ecm的合成、降解与基质金属蛋白酶
‑
13(mmp
‑
13)和基质金属蛋白酶抑制剂
‑
1(timp
‑
1)密切相关，mmp
‑
13促进ecm降解，timp
‑
1通过抑制 mmp
‑
13的活性而抑制ecm降解，从而加剧hf的形成
2.。目前缺少一种能够有效提高肝组织中mmp
‑
13的表达量以及显著降低肝组织中timp
‑
1的表达量来治疗hf的药物。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供密点麻蜥水提物在制备治疗肝纤维化的药物中的应用，密点麻蜥能够显著提高动物肝组织中mmp
‑
13的表达量以及显著降低timp
‑
1的表达量，从而促进ecm降解，减轻hf的程度。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了密点麻蜥水提物在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。
6.本发明还提供了密点麻蜥在制备提高动物肝脏中mmp
‑
13表达量同时降低动物肝脏中timp
‑
1表达量的药物中的应用。
7.优选的，所述药物的剂型包括口服制剂。
8.优选的，所述口服制剂包括汤剂。
9.优选的，所述汤剂的制备方法，包括以下步骤：
10.将密点麻蜥和水混合，进行煎煮，得到治疗肝纤维化的药物。
11.优选的，所述密点麻蜥和水的质量比为4～5：100。
12.优选的，所述煎煮后，还包括对煎煮液进行浓缩，所述浓缩的比例为 (112.5～450)：1000。
13.优选的，所述煎煮的温度为90～100℃；所述煎煮的时间为30～40min。
14.本发明提供了密点麻蜥水提物在制备治疗肝纤维化的药物中的应用，密点麻蜥水体物能够显著提高动物肝组织中mmp
‑
13的表达量以及显著降低 timp
‑
1的表达量，从而促进ecm降解，减轻hf的程度。动物实验显示，经密点麻蜥灌胃给药(密点麻蜥水提物)后，肝纤维化模型小鼠血清中ha、 ln、pc
‑ⅲ
、c
‑ⅳ
及tgf
‑
β1水平均显著降低；肝组织结构损伤逐渐改善，肝细胞水肿、脂肪样病变和炎性细胞浸润程度明显降低，纤维沉积、汇管区或中央静脉纤维间隔与模型组相比明显变薄，结缔组织增生明显减少；小鼠肝组织中mmp
‑
13表达显著升高(p＜0.01)，timp
‑
1表达显著降低(p＜0.01)。
附图说明
15.图1为光镜下各组小鼠肝组织病理学变化(he
×
200)；其中，a为空白组；b为模型组；c为安络化纤组；d为密点麻蜥低剂量组；e为密点麻蜥中剂量组；f为密点麻蜥高剂量组。
具体实施方式
16.本发明提供了密点麻蜥水提物在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。
17.本发明还提供了密点麻蜥在制备提高动物肝脏中mmp
‑
13表达量的药物中的应用。
18.本发明还提供了密点麻蜥在制备降低动物肝脏中timp
‑
1表达量的药物中的应用。
19.在本发明中，所述密点麻蜥来源于常规市售，本发明具体实施过程中，所述密点麻蜥购于宁夏医科大学附属回医中医医院门诊。
20.在本发明中，所述药物的剂型优选的包括口服制剂；所述口服制剂优选的包括汤剂。
21.在本发明中，所述汤剂的制备方法，优选的包括以下步骤：
22.将密点麻蜥和水混合，进行煎煮，得到治疗肝纤维化的药物。
23.在本发明中，所述密点麻蜥和水的质量比优选为4～5：100。
24.在本发明中，所述煎煮后，优选的还包括对煎煮液进行浓缩，所述浓缩的比例优选为(112.5～450)：1000，更优选为225：1000。
25.在本发明中，所述煎煮的温度优选为90～100℃；所述煎煮的时间优选为 30～40min。
26.在本发明具体实施过程中，取密点麻蜥45g，蒸馏水1000ml，煎煮至沸腾后浓缩至450ml，滤出药渣，取出100ml即低浓度(0.1g/ml)，其余继续浓缩至225ml，取出100ml即中浓度(0.2g/ml)，其余浓缩至112.5ml，即高浓度(0.4g/ml)。
27.在本发明中，所述治疗肝纤维化的药物的治疗方法为口服给药。
28.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例1
30.1材料
31.1.1动物spf级雄性icr小鼠60只，4周龄，体重(20
±
2)g；由宁夏医科大学实验动物中心提供，许可证号：scxk(宁)2020
‑
0001；所有小鼠于 spf级动物房饲养，自由进水进食，适应性饲养7d后进行试验。
32.1.2药物与试剂单味密点麻蜥，购于宁夏医科大学附属回医中医医院门诊，取密点麻蜥45g，蒸馏水1000ml，煎煮至沸腾后浓缩至450ml，滤出药渣，取出100ml即低浓度(0.1g/ml)，其余继续浓缩至225ml，取出100ml 即中浓度(0.2g/ml)，其余浓缩至112.5ml，即高浓度(0.4g/ml)。用前煎煮成浓度为0.1g/ml，0.2g/ml，0.4g/ml的中药汤剂，
‑
4℃冰箱保存；四氯化碳(规格：500ml，徐州天鸿化工有限公司)；玉米油(规格：500ml，北京索莱宝科技有限公司)；安络化纤丸(规格：6g/袋，森隆药业有限公司)，用前碾成粉末，用蒸馏水配成浓度为0.16g/ml的溶液，
‑
4℃冰箱保存备用。
33.小鼠血清透明质酸(ha)、层黏连蛋白(ln)、ⅲ型前胶原(pc
‑ⅲ
)、ⅳ型胶原(c
‑ⅳ
)及转化生长因子
‑
β1(tgf
‑
β1)酶联免疫分析试剂盒(上海信誉生物科技有限公司)；兔抗timp
‑
1、兔抗mmp13(北京奥博森生物科技有限公司)。
34.1.3仪器包埋机(湖北泰维科技实业有限公司)；切片机(徕卡显微系统有限公司)；酶标仪(芬兰labsystems multiskan ms公司)；洗板机(芬兰thermo labsystems公司)；微量高速离心机(国产)；化学发光分析仪 (上海天能公司)。
35.2方法
36.2.1分组与造模将60只4周龄icr小鼠适应性饲养7d后，随机分为空白组(10只)和模型组(50只)。造模方法参考文献
3.，模型组小鼠腹腔注射体积分数为10％的四氯化碳溶液(按照体积比为四氯化碳：玉米油＝1： 9配制而成)，每次注射剂量5ml/kg，每周两次，持续8周，制造肝纤维化模型。空白组小鼠腹腔注射等体积0.9％生理盐水，每周两次，持续8周。8 周后，每组随机抽取3只小鼠处死，对其进行肝纤四项和肝组织he染色检验，显示建立ccl4诱导小鼠肝纤维化模型成功。将造模成功小鼠随机分为模型组、水飞蓟宾组和密点麻蜥低、中、高剂量组。
37.2.2给药给药剂量按照成人日用量与小鼠体表面积折算成等效剂量
4.，单味密点麻蜥低剂量1g
·
kg
‑1·
d
‑1，中剂量2g
·
kg
‑1·
d
‑1，高剂量4g
·
kg
‑1·
d
‑1，安络化纤100mg
·
kg
‑1·
d
‑1，各给药组每天灌胃一次，每次5ml/kg，连续给药四周。空白组和模型组给予等体积0.9％的生理盐水，每日一次，连续四周。
38.2.3动物一般状态实验过程中每日观察并记录各组小鼠的体重、皮毛、精神、活动、饮食等情况。
39.2.4小鼠肝组织形态学变化末次灌胃给药24h后，取小鼠肝脏部分以 4％多聚甲醛固定24h，乙醇脱水后经过浸蜡、包埋、切片、展片、捞片、烤片。进行he染色观察肝组织病理学变化。
40.2.5免疫组化法检测肝组织中mmp
‑
13及timp
‑
1的含量将实验所用切片于4℃冰箱过夜，经过脱水、热修复、封闭、一抗孵育，二抗孵育，dab 显色、苏木素复染、封片后，显微镜下观察拍照。使用image j软件，在200 倍镜下对mmp
‑
13及timp
‑
1阳性结果进行半定量分析。每个标本随机观察 6个视野，以阳性产物面积/视野面积表示该抗原的相对含量，并取其平均值。
41.2.6酶联免疫法检测小鼠血清中肝纤维化四项及tgf
‑
β1水平取小鼠心尖血1～2ml静置后离心，制备小鼠血清。用酶标仪检测小鼠血清中ha、 ln、pc
‑ⅲ
、c
‑ⅳ
及tgf
‑
β1的含量。
42.2.7统计学方法数据处理采用spss 22.0软件，结果以表示。对数据进行正态分布检验，符合正态分布且方差齐性资料比较采用单因素方差分析(one
‑
way anova)，多个样本均数间的多重比较采用snk
‑
q法检验；不符合正态分布且方差不齐的资料采用秩转换的非参数检验，以p<0.05为差异有统计学意义。
43.3结果
44.3.1一般情况实验中发现空白组小鼠生长状态良好，对外界刺激反应敏锐，双眼有神，毛发光亮，饮食、体重正常逐增，未出现死亡情况；造模组小鼠较空白组小鼠生长缓慢，行动迟缓，双眼无神，皮毛发黄且造模后期大部分小鼠出现炸毛现象，食欲不振，体重较同
时期空白组小鼠轻；药物干预4周后，除模型组外其他各组小鼠的体重逐步恢复增长，食量、饮水也有一定程度增加。
45.3.2各组小鼠血清肝纤维化四项及tgf
‑
β1水平变化情况
46.肝纤维化的主要病理表现是肝胶原纤维的增长，肝细胞外基质(ecm) 的沉积，肝纤四项的ha、ln、pc
‑ⅲ
及
ⅳ‑
c都是细胞外基质的主要组成成分，它们的水平与ecm堆积、胶原交联成纤维的过程密切相关，间接地反映了ecm的累积程度，因此通过检测血清中ha、ln、pc
‑ⅲ
、c
‑ⅳ
含量可以判断肝纤维化程度；转化生长因子(tgf
‑
β)及受体由肝星状细胞(hsc) 分泌，且tgf
‑
β1能够激活hsc合成多种蛋白多糖、胶原蛋白和非胶原糖蛋白等大量的ecm，导致肝脏中ecm的稳态失衡。因此，当肝纤维化发生时，tgf
‑
β1将与ha、ln、pc
‑ⅲ
、c
‑ⅳ
同步升高，反映肝组织纤维化的程度。
47.与空白对照组比较，模型组小鼠血清中ha、ln、pc
‑ⅲ
、c
‑ⅳ
及tgf
‑
β1 水平均显著升高(p＜0.01)；与模型组比较，安络化纤组和密点麻蜥高、中、低剂量组小鼠血清中ha、ln、pc
‑ⅲ
、c
‑ⅳ
及tgf
‑
β1水平均显著降低(p＜0.01)。见表1。
48.表1各组小鼠血清中纤维化四项及tgf
‑
β1含量的检测结果(n＝7，pg/ml)
[0049][0050]
注：与空白组比较，
*
p<0.05，
**
p<0.01；与模型组比较，
△
p<0.05，
△△
p<0.01。下表同。
[0051]
3.3各组小鼠肝组织切片染色结果
[0052]
正常组小鼠肝细胞结构正常，肝小叶结构正常，无纤维增生；模型组小鼠肝细胞出现不同程度水肿、脂肪样病变和炎性细胞浸润，肝小叶结构被破坏，排列紊乱，且出现纤维增生；密点麻蜥处理组，随着剂量升高，肝结构损伤逐渐改善，肝细胞水肿、脂肪样病变和炎性细胞浸润程度明显降低，纤维沉积、汇管区或中央静脉纤维间隔与模型组相比明显变薄，结缔组织增生明显减少。见图1。其中，a为空白组；b为模型组；c为安络化纤组；d 为密点麻蜥水提物低浓度组；e为密点麻蜥水提物中浓度组；f为密点麻蜥水提物高浓度组。
[0053]
3.4各组小鼠肝组织中mmp
‑
13及timp
‑
1表达情况
[0054]
与空白对照组比较，模型组小鼠肝组织中mmp
‑
13表达显著升高(p＜ 0.01)，timp
‑
1表达显著降低(p＜0.01)，与模型组比较，安络化纤组和密点麻蜥高、中、低剂量组小鼠肝组织中mmp
‑
13表达显著升高(p＜0.01)，timp
‑
1 表达显著降低(p＜0.01)。见表2。
[0055]
表2各组小鼠肝组织中mmp
‑
13及timp
‑
1表达情况(n＝6)
[0056][0057]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
[0058]
参考文献：
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‑
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‑
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