增强单子叶植物产率的多穗系统的制作方法

增强单子叶植物产率的多穗系统
1.本技术是申请日为2016年7月15日、申请号为201680046066.1、发明名称为“增强单子叶植物产率的多穗系统”的发明专利申请的分案申请。
2.背景
3.植物的进化和驯化大体上遵循将作物与其野生前身区分开的共同模式或“驯化综合征”。作物间的一种共同的训化综合征特征由对于增加的顶端优势的长期选择产生，所述顶端优势的特征在于与侧茎和腋芽的生长相比，中心茎及其芽和花的生长相对更稳健，这引起每株植物更少且更大的果实。对于顶端优势的选择在许多物种中被认为是驯化的重要征兆，所述物种包括稻、小麦、大麦和玉米的谷类作物以及果实作物像番茄。
4.作物植物的驯化期间的关键挑战是提高与其前身相比的作物的收获率。在不利的环境中，野生植物经常快速开花和成熟；从而产生较小数量的分枝、花序、花和种子以便增加产生至少一个后代以继续生命周期的可能性。在有利的环境中，野生植物通过随时间依次产生更多分枝、花序、花和种子来使成功生殖的可能性最大化。后一种策略对于作物不是最佳的，因为收获在植物之间同步成熟的更少但是更大果实或花序(这允许在果实或花序成熟的最佳时间的单一收获)是更高效的。因此，多种不同的作物已被选择来在主茎上产生较小数量的较大种子、果实或花序作为提供收获率的手段。
5.植物构造中可能最引人注目并充分研究的改变通过玉米的驯化开始。通过选择提高产率和机械收获率的性状，人类已将玉米的前身从具有顶端为雄性或雌性花序的多个伸长侧向分枝的茂密灌木状原型转化为包括仅具有两个或三个相对缩短的侧向分枝、每个侧向分枝以单一雌花(穗)终止的单一直立主茎的今天的作物。今天公认的是，选择玉米的顶端优势不仅提高理想生长条件中的总体产率，它还使在品系与品系之间协调开花时间的组织工作更简单并且实现流水线田间维护和机械收获率。
6.玉米的顶端优势的机制涉及调节激素，诸如生长素，其由顶端分生组织产生。随着初生穗开始成熟，顶端分生组织产生更大量的生长素。生长素从顶端分生组织沿植物向下运载并且抑制下部穗的发育，从而引起较不可能配出良好后代或产生有活力的种子的次生穗。
7.用于受控环境或苗圃中的自花授粉玉米的方法过去涉及去除分蘖和共优势穗，因为认为这些结构与初生穗竞争资源或在激素方面干扰初生穗并且因此引起籽粒产率降低。此途径可能追溯到20世纪30年代，当时玉米分蘖被称为吸根(suckers)，因为认为它们从主植物
‘
吸收’营养物质和糖。最近田间环境的研究显示分蘖对于玉米是无性产生的。然而，农民仍然更倾向于并且选择即使在高生长环境中也不分蘖的玉米品系。田间和温室植物密度两者均通常围绕产生具有单穗的植物来设计，并且分蘖和穗生产力经常在这些密度下被抑制。本领域中仍然存在对于增加单子叶作物植物的种子或籽粒产率的需要。除广泛英亩产率之外，增加产率的能力可应用到育种和增加的种子产生。
8.概述
9.本文提供的是用于使用赤霉酸抑制剂(ga抑制剂)处理单子叶植物的方法。通常，目的在于增加单子叶植物的种子产率。在某些实施方案中，所述ga抑制剂通过在形成可视
生殖结构之前将植物与ga抑制剂接触来施用到植物。在某些实施方案中，所述ga抑制剂通过接触植物的根部来施用。在某些实施方案中，所述处理降低植物高度。
10.在某些实施方案中，所述植物是近交v1至v13阶段植物或杂交v1至v15阶段植物。在某些实施方案中，所述ga抑制剂在v1阶段至最后雄穗分枝从轮生体出现(vt)前约10天[vt
–
10天]和穗丝出现前2
‑
3天施用到植物。在某些实施方案中，所述ga抑制剂在发芽之后约5天至发芽之后约40天施用。在某些实施方案中，所述植物是小麦植物并且所述ga抑制剂在feekes阶段6之前施用。在某些实施方案中，所述植物在v1阶段、v2阶段、v3阶段、v4阶段、或v5阶段处进行处理并且/或者所述植物在发芽之后约5天至发芽之后约20天进行处理。在某些实施方案中，所述处理诱导分蘖形成和/或增加雄穗数量。在某些实施方案中，所述植物在v6阶段、v7阶段、v8阶段、或v9阶段处进行处理并且/或者所述植物在发芽之后约21天至发芽之后约35天进行处理。在某些实施方案中，所述植物是玉米植物，并且所述处理在主茎上诱导共优势穗。在某些实施方案中，所述植物在v10阶段、v11阶段、或v12阶段处进行处理并且/或者所述植物在发芽之后约35天至发芽之后约40天进行处理。在某些实施方案中，所述植物是玉米植物，并且所述处理压缩高于初生穗的苤节。在某些实施方案中，所述植物：i)首先在v1阶段、v2阶段、v3阶段、v4阶段、或v5阶段处进行处理和/或在发芽之后约5天至发芽之后约20天进行处理，并且然后ii)在v6阶段、v7阶段、v8阶段、或v9阶段处再次进行处理和/或在发芽之后约21天至发芽之后约35天再次进行处理。在某些实施方案中，所述植物iii)在v10阶段、v11阶段、或v12阶段进一步进行处理和/或在发芽之后约35天至发芽之后约40天进一步进行处理。在某些实施方案中，所述植物i)首先在v1阶段、v2阶段、v3阶段、v4阶段或v5阶段处进行处理和/或在发芽之后约5天至发芽之后约20天进行处理，并且然后ii)在v10阶段、v11阶段、或v12阶段处再次进行处理和/或在发芽之后约35天至发芽之后约40天再次进行处理。在某些实施方案中，所述植物i)首先在v6阶段、v7阶段、v8阶段、或v9阶段处进行处理和/或在发芽之后约21天至发芽之后约35天进行处理，并且然后ii)在v10阶段、v11阶段、或v12阶段处再次进行处理和/或在发芽之后约35天至发芽之后约40天再次进行处理。
[0011]
在某些实施方案中，所述ga抑制剂是三唑。三唑ga抑制剂的例示性实例包括但不限于多效唑、烯效唑和呋嘧醇。在某些实施方案中，所述ga抑制剂在至少1.0mg/植物的比率下施用。在某些实施方案中，所述ga抑制剂在约1.0mg/植物至约75mg/植物、约1.0mg/植物至约50mg/植物、或约1.0至约32mg/植物的比率下施用。在某些实施方案中，所述植物在v1阶段、v2阶段、v3阶段、v4阶段、或v5阶段处进行处理并且/或者所述植物在发芽之后约5天至发芽之后约20天进行处理，并且所述ga抑制剂在约1.0mg/植物至约8.0mg/植物或约1.5mg/植物至约5.0mg/植物的比率下施用。在某些实施方案中，所述植物在v6阶段、v7阶段、v8阶段、v9阶段、v10阶段、v11阶段、或v12阶段处进行处理并且/或者所述植物在发芽之后约21天至发芽之后约40天进行处理，并且所述ga抑制剂在约8.0mg/植物至约50mg/植物或约8.0mg/植物至约75mg/植物的比率下施用。
[0012]
在某些实施方案中，所述单子叶植物是玉米、小麦、稻、高粱、或甘蔗。在某些实施方案中，所述单子叶植物是玉米或小麦。
[0013]
在某些实施方案中，所述单子叶植物是玉米植物，并且所述处理在所处理的植物上引起1个、2个、3个、4个、5个、6个、或7个分蘖。在某些实施方案中，所述分蘖延迟雌性化并
且增加雄柱。在某些实施方案中，使用ga抑制剂进行的处理增加花粉散落持续时间。在某些实施方案中，ga抑制剂处理的植物比未与ga抑制剂接触的对照植物产生至少1个、2个、3个、4个、或5个、或更多个分蘖。在某些实施方案中，所述单子叶植物是小麦植物，并且ga抑制剂处理比未与ga抑制剂接触的对照植物产生至少4个或更多个分蘖。在某些实施方案中，所述方法还包括选择具有分蘖的ga抑制剂处理的植物。在某些实施方案中，其中所处理的植物是玉米植物，所述方法还包括将所选植物的分蘖与主杆分离并且单独地再种植分蘖。在某些实施方案中，所再种植的分蘖中的一个或多个使用ga抑制剂处理。在某些实施方案中，所再种植的分蘖与未与主杆分离的对照分蘖相比产生更多谷粒。
[0014]
在某些实施方案中，所述单子叶植物是玉米植物并且所述ga抑制剂处理引起：来自所处理的植物的至少约250个谷粒；来自所处理的植物的约250个谷粒至约600个谷粒；来自所处理的植物的至少约600个谷粒；来自所处理的植物的约600个谷粒至约2000个谷粒，来自所处理的植物的约600个谷粒至约1000个谷粒，或来自所处理的植物的至少约1000个谷粒。在某些实施方案中，所述单子叶植物是小麦植物，并且所述处理引起从所处理的植物产生至少约400个种子。在某些实施方案中，所述单子叶植物是小麦植物，并且所述处理引起与未处理对照植物相比的种子数量的至少约20％增加。在某些实施方案中，所述方法还包括收获产生至少约250个谷粒的玉米植物的种子或收获产生至少约400个种子的小麦植物的种子。在某些实施方案中，所述方法还包括基因型分析收获的种子或收获的种子的群体。在某些实施方案中，所述方法还包括在育种程序中使用收获的种子或收获的种子的群体。
[0015]
在某些实施方案中，所处理的植物在受控条件下生长。在某些实施方案中，所处理的植物在温室中生长。在某些实施方案中，所处理的植物在开放田间生长。在某些实施方案中，对商业种植的植物的群体进行处理，并且所述处理与未处理对照植物的群体相比增加产率。
[0016]
本公开还提供对玉米植物进行授粉的方法，其中所述方法包括根据本文所述的ga抑制剂处理的任何实施方案处理玉米植物并且使用授粉袋覆盖玉米植物的至少一部分，包括植物的顶部和至少一个穗。在某些实施方案中，被授粉袋覆盖的植物是高度降低的植物。在某些实施方案中，所述授粉袋具有约75至约450微米的孔径。
[0017]
本公开还提供对玉米植物进行授粉的方法，其中所述方法包括使用同一个授粉袋覆盖至少两株植物，其中所述至少一株植物已根据本文所述的ga抑制剂处理的任何实施方案进行处理。在某些实施方案中，至少一株植物将其一个或多个雄穗去除并且至少一株植物具有一个或多个雄穗。
[0018]
本公开还提供通过本文所述的ga抑制剂处理的任何实施方案产生的单子叶植物。本公开还提供通过本文所述的ga抑制剂处理的任何实施方案产生的单子叶植物和/或由通过本文所述的ga抑制剂处理的任何实施方案产生的任何植物产生的单子叶植物种子。
[0019]
附图简述
[0020]
图1示出通过群体谱系(a
‑
d)、玉米杆上的位置和它们产生的dh1种子的数量分类的穗。
[0021]
图2示出从使用植物生长调节剂处理的单株植物生长的八个编号的玉米共优势穗。
[0022]
图3示出从来源于经受分蘖诱导处理的同一母本植物的分蘖产生的种子的平均总数量。
[0023]
图4示出对于谷粒的总数量/所述处理的植物的单向统计分析。
[0024]
图5是小麦植物上的分蘖发育和位置的图示。
[0025]
图6示出对照植物和paczol处理植物(v3阶段处15ml或v8阶段处30ml)中处理之后20天总分蘖/植物的单向分析。
[0026]
图7a
‑
图7d示出使用paczol对小麦幼苗进行的化学处理改善生殖性状，诸位叶球数量/植物(a)、种子数量/植物(b)、种子量/植物(种子克数/植物，c)以及总干物质/植物(d)。
[0027]
图8示出在v3阶段或v8阶段处使用paczol处理并且然后人工授粉或通过套袋自交(自动授粉)的个体植物上的花粉散落持续时间和雄穗数量。
[0028]
图9a和图9b示出使用a开放授粉或b人工授粉方法的主茎(“母本”)、分蘖和总计的谷粒/植物计数。
[0029]
图10示出跨独特的种质(a
‑
k)移植之后14天或移植之后28天在未处理或处理的种质中的平均主茎高度(cm)。
[0030]
图11示出跨独特的种质(a
‑
k)的平均谷粒/植物/处理。
[0031]
图12示出早期和晚期ga抑制剂处理之间的比较和苤节压缩的结果。
[0032]
图13示出使用ga抑制剂处理的植物产生每株植物更多种子。
[0033]
图14示出ga抑制剂处理的植物跨品系产生每株植物更多种子。
[0034]
详细描述
[0035]
本文提供的是诱导或促进作物植物中的腋生分生组织或额外的侧枝或额外的花序的发育的方法。在某些方面，这样做是出于增加产率，诸如由单子叶植物产生的种子/籽粒的数量(“种子产率”)的目的。所提供的方法可增加单株植物的产率或施加到植物群体时可增加植物群体的产率(诸如增加商业收获的产率)。
[0036]
应注意，术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”实体是指此实体中的一个/种或多个/种；例如，“一株植物”应理解为表示一株或多株植物。因此，术语“一个/种(a)”(或“一个/种(an)”)、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可互换使用。
[0037]
此外，在本文中使用时将“和/或”视为对两个指定特征或组分中的每一个具有或不具有另一者的具体公开内容。因此，如本文中诸如“a和/或b”的词组中所使用的术语和/或”意图包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)和“b”(单独)。同样，如诸如“a、b和/或c”的词组中所使用的术语“和/或”意图涵盖以下实施方案中的每个：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；以及c(单独)。
[0038]
除非另外定义，否则本文所使用的技术和科学术语均具有与本公开涉及的领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。单位、前缀和符号均以其国际单位制(si)接受的形式来表示。数字范围包括限定所述范围的数字。
[0039]
本文提供的标题仅为了易于参考并且不是对本公开的各种方面或方面的限制，这些方面或方面可通过参考整个说明书来获得。因此，即将在以下定义的术语通过参考整个说明书而得到更充分地定义。
[0040]
定义
[0041]
如本文所用，“植物”是指整株单子叶植物、其任何部分、或来源于单子叶植物的细胞或组织培养物，其包括以下中的任一个：整株植物、植物组分或器官(例如，叶、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞、和/或其子代。植物细胞是植物的生物细胞，其取自单子叶植物或通过从取自单子叶植物的细胞培养衍生。
[0042]
如本文所用，“植物的群体”或“植物群体”是指多株植物。通常，所述术语涉及植物的育种群体，从其选择成员并且进行杂交以在育种程序中产生子代。在此类情况下，植物的群体可以是相对小的，例如像可容纳在温室中。所述术语还可指代用于商业或种子生产目的的诸如在开放田间种植的多株植物。在此类情况下，植物的群体可以是非常大的，诸如在数百或数千英亩土地上种植。在某些实施方案中，多株可以是100株或更多株、500株或更多株、或1000株或更多株个体植物。
[0043]
植物的群体可包括单个育种杂交种或多个育种杂交种的子代。所述群体成员不需要与选择用于随后的分析循环的群体成员或最后选择来获得最终子代植物的那些群体成员相同。植物群体经常来源于单个成对杂交种，但是也可来源于相同或不同亲本之间的两个或更多个杂交种。
[0044]
如本文所用，术语“遗传因子”是指插入到玉米基因组中的重组dna构建体(通常称为“转基因”)、核苷酸序列或植物基因组的遗传基因座。
[0045]
如本文所用，术语“促进”和“诱导”可互换使用以意指促进(例如，促进腋芽从先前存在的芽发育)或诱导(例如，诱导腋芽从新形成)。
[0046]
如本文所用，术语“非天然存在的”物质、组合物、实体、和/或物质、组合物、或实体的任何组合、或其任何语法变体是明确地排除但是仅排除所述物质、组合物、实体、和/或物质、组合物、或实体的任何组合的由本领域的普通技术人员良好理解的如“天然存在的”或者是或可以是在任何时间由法官或行政或司法机关确定或解释为“天然存在的”那些形式。
[0047]
如本文所用，术语“花”和“花序”可互换使用。
[0048]
如本文所用，术语“玉米(maize)”和“玉米(corn)”可互换使用。
[0049]
如本文所用，术语“分蘖”当指代玉米植物分蘖时是来自、在或低于支柱根的分枝。
[0050]“近交”植物通过自花授粉或回交产生的植物，通常重复至少约七次以产生纯系育种菌株。这意味着如果近交体是自花授粉，则所有子代将与彼此或与近交亲本在遗传上相同或几乎相同。
[0051]“杂交”植物通过将两株不同的亲本植物杂交来发育。通过将从不同的但是相等生产性的开放授粉品种发育的两个近交体杂交产生的杂交体通常比通过将来自相同开放授粉品种的两个近交体杂交产生的杂交体产生更具活力的杂交体。
[0052]
如本文所用，术语“原种”、“原种植物”和类似术语描述由针对优异农艺性能进行的人类指导的育种和选择产生的至少一种作物植物的组、种质或群体。“原种群体”是在给定作物物种(诸如玉米)的农学上优异的基因型方面可用于表示现有技术水平的原种个体或品系的分类。相似地，“原种种质”或“原种种质菌株”是农学上优异的种质，其通常来源于和/或能够得到具有优异农艺性能的植物，诸如现有的或新发展的玉米原种品系。相比之下，“外来植物”、“外来品系”或“外来种质”是来源于不属于可获得的原种种质品系或菌株的植物的植物、品系或种质。在两种种质的植物或品系之间的杂交种的环境中，外来种质不通过血统与其所杂交的原种种质紧密相关。最通常地，外来种质不来源于任何已知的作物
原种品系，而是选择来将遗传因子(通常是所需的等位基因)引入到育种程序中。
[0053]
种子生产或种子制造是指诸如来自特定品系或种质的种子的扩增，使得获得足够的种子以用于出售给客户和种植者或其他大规模种植。
[0054]
玉米植物往往产生发育最快且最完全的单一的占优势穗或初生穗。额外的穗有时沿杆在优势穗下部形成(次生穗是在初生穗下部的下一个穗，第三穗是下一个最下部的穗，并且以此类推
‑
其全部可总体上称为次生穗)，但是其发育通常相对于优势穗被延迟。因为额外的或非优势穗的发育通常被延迟，所以优势穗通常是配出良好后代唯一的穗。
[0055]
如本文所用，术语“共优势穗”是指玉米上的在相似速率/时间下成熟、使得它们在重叠时间表中产生穗丝、接受花粉发芽的穗。具有共优势穗的植物具有至少两个共优势穗。共优势穗可通过它们在杆上的位置来编号，即顶部共优势穗是第一共优势穗，在第一个下部的下一个共优势穗是第二共优势穗，第三共优势穗是下一个最下部的穗，并且以此类推。
[0056]
如本文所用，对照植物(例如，单子叶对照植物、玉米对照植物等)是识别为具有代表性表型(例如，花序数量、分蘖数量、穗数量、谷粒/种子数量、高度、生物质等)的植物(或植物群体)或未使用植物生长调节剂处理但是在其他方面(诸如基因构成和生长条件)与使用植物生长调节剂处理的植物相当的植物。例如，本领域的普通技术人员将理解，对照植物具有以下属性中的一种或多种：由来源于相同诱导杂交种的种子产生；具有与所处理的植物相同的至少一个亲本；在十二代内与所处理的植物共享共同的原型；与所处理的植物共享足够的共同遗传性，使得植物育种领域的普通技术人员将对照植物识别为用于建立施加植物生长调节剂与所得的表型之间的关联的有效比较；和/或具有一个优势穗并且没有共优势穗(玉米)。本领域的普通技术人员将认识到，由于偶然(例如，统计异常)、由于某一其他类型的操纵或其他原因而包括不同于未处理植物的代表性表型的未处理植物将不是适当的对照植物。
[0057]
化学诱导的产率增加
[0058]
本文提供的是通过使用植物生长调节剂(pgr)处理单子叶植物来增加单子叶植物的产率的方法。产率的增加可以是种子数量(种子产率)的增加和/或其他产率参数包括但不限于粒重和植物生物质的增加。如本文所用，“增加(increase)”、“增加(increasing)”或类似增加(或其他比较性参数，诸如降低的高度)参考如本文其他地方定义的对照植物或对照植物群体而言。
[0059]
在一些实施方案中，产率的增加是单子叶植物的种子产率的增加。增加由甚至一株植物产生的种子的数量对于植物育种人员而言诸如在减少育种程序的周期时间方面可以是有利的。均匀性通常是育种程序的目标，并且因此在某些实施方案中，所处理的植物在受控条件下(诸如在温室或其他封闭的或部分封闭的结构中)生长持续所述时间的至少一部分。可控制的条件包括灌溉、湿度、温度、土壤体积、光强度、昼/夜长度等。
[0060]
在某些实施方案中，所处理的植物暴露于周围的天然环境(诸如在开放田间)种植和生长或移植和生长。商业作物(广泛英亩耕种)和种子生产程序通常在开放田间生长包括大数量植物的植物群体。然而，应理解，甚至在开放田间，一些参数(例如灌溉)可在至少一定程度上得到控制。预期根据本发明实施方案使用pgr处理植物的群体(诸如开放田间)引起植物群体的产率增加。此增加的产率可引起制造种子以用于种子生产目的的商业输出增加或种子扩增增加。
[0061]
已发现，操纵单子叶植物的某些性状(包括增加的产率)可通过控制特定化学、比率、时间、和施加方法中的一种或多种来实现。这些性状包括：降低的植物高度；增加的分蘖数量；增加的分蘖大小和活力；增加的总植物生物质；分蘖上的增加的腋生花序(穗)数量；主茎上的增加的腋生花序(穗)数量；主茎上的更快的腋生花序(穗)发育；分蘖顶生花序的增加的雄性(更多正常的雄穗)；增加的花粉散落持续时间(被认为来自在不同的时间段内散落的多个雄穗的存在；增加的单株植物种子/谷粒数量和粒重；增加可视的根群；增加的茎直径；改善的总体植物健康。认为以上处理诱导的性状的组合有助于增加产率。具体地，如本文其他地方所述的，增加的分蘖数量、降低的高度和增加的花粉散落持续时间中的一种或多种可具体地与增加产率相关。
[0062]
在某些实施方案中，单子叶植物通过向植物施用赤霉酸抑制剂(ga抑制剂)来处理以增加产率。在某些实施方案中，所述ga抑制剂是三唑。三唑ga抑制剂的代表性实例包括：多效唑
‑
(
±
)
‑
(r*,r*)
‑
β
‑
((4
‑
氯苯基)甲基)
‑
α
‑
(1,1
‑
二甲基乙基)
‑
1h
‑
1,2,4,
‑
三唑
‑1‑
乙醇(多效唑或pbz)；烯效唑
‑
(e)
‑1‑4‑
氯苯基)
‑
4,4
‑
二甲基
‑2‑
(1,2,4
‑
三唑
‑1‑
基)戊
‑1‑
烯
‑3‑
醇(烯效唑)；丙环唑
‑1‑
[[2
‑
(2,4
‑
二氯苯基)
‑4‑
丙基
‑
1,3
‑
二氧戊环
‑2‑
基]甲基]
‑
1,2,4
‑
三唑(丙环唑)；呋嘧醇
‑2‑
甲基
‑1‑
嘧啶
‑5‑
基
‑1‑
[4
‑
(三氟代甲氧基)苯基]丙
‑1‑
醇(呋嘧)；烯唑醇
‑
(e,3r)
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)
‑
4,4
‑
二甲基
‑2‑
(1,2,4
‑
三唑
‑1‑
基)戊
‑1‑
烯
‑3‑
醇(烯唑醇)；以及叶菌唑
‑5‑
[(4
‑
氯苯基)甲基]
‑
2,2
‑
二甲基
‑1‑
(1,2,4
‑
三唑
‑1‑
基甲基)环戊烷
‑1‑
醇(叶菌唑)。在某些实施方案中，所述ga抑制剂是多效唑、烯效唑或呋嘧醇。
[0063]
在某些实施方案中，ga抑制剂向植物的施用通过与植物的根部接触进行。ga抑制剂与植物的根部的接触可通过任何各种方法来实现。例如，植物的暴露根部可浸入到含有ga抑制剂的溶液中或以其他方式与其接触并且然后种植所述植物，含有ga抑制剂的溶液可施加到植物上方和/或附近的土壤，或者含有植物的容器可浸入到含有ga抑制剂的溶液中，使得所述溶液进入容器并且诸如通过浸透容器中的土壤来接触根部。可替代地，ga抑制剂可以是施加到植物的叶、茎或其他地上结构的叶处理或地上处理。
[0064]
已观察到，化学(ga抑制剂)通常耗时12
‑
14天来起作用。因此，处理的时间是关键的。在某些实施方案中，所述植物在形成可视生殖结构之前使用ga抑制剂进行处理。此时间表与在针对近交植物的v1至v13发育阶段处或在针对杂交植物的v1至v15发育阶段处处理植物大体一致，并且因此在某些实施方案中，所述植物在针对近交植物的v1至v13阶段处或在针对杂交植物的v1至v15阶段处使用ga抑制剂进行处理。此时间表还通常与在v1阶段至最后雄穗分枝从轮生体出现(vt)前约10天[vt
–
10天]和穗丝出现前2
‑
3天处理植物大体一致。因此在某些实施方案中，所述植物在v1阶段至最后雄穗分枝从轮生体出现前约10天[vt
–
10天]和穗丝出现前2
‑
3天使用ga抑制剂进行处理。此时间表还与在玉米的情况下在发芽之后约5天至发芽之后约40天处理植物大体一致，并且因此在某些实施方案中，所述植物在发芽之后约5天至发芽之后约40天进行处理。在某些实施方案中，其中所述植物是小麦植物，ga抑制剂在feekes阶段6之前施用。
[0065]
此外，本公开提供用于在形成可视生殖结构之前发生的植物发育阶段/时间的一个或多个子集处使用ga抑制剂处理单子叶植物以增加产率。
[0066]
在某些实施方案中，所述植物在发芽之后约5天至发芽之后约20天进行处理。此时间表与v1阶段、v2阶段、v3阶段、v4阶段、或v5阶段大体一致，并且因此在某些实施方案中，
所述植物在v1阶段、v2阶段、v3阶段、v4阶段、或v5阶段处进行处理。在某些实施方案中，所述植物在v4阶段或v5阶段处进行处理。在这些早期时间/阶段处进行的处理与诱导分蘖形成相关联，从而引起分蘖的数量增加。在玉米中，形成分蘖或更大数量的分蘖可在玉米中导致穗的数量增加，因为分蘖能够形成除植物的主茎上的穗之外的穗。在小麦中，形成额外的穗可导致产生种子的叶球的数量增加。在这些早期时间/阶段处进行的处理还与玉米中的雄性/雄穗形成增加相关联。这些处理诱导的属性的两者均可导致产率增加，包括种子数量增加。
[0067]
在某些实施方案中，所述植物在发芽之后约21天至发芽之后约35天进行处理。此时间表与v6阶段、v7阶段、v8阶段、或v9阶段大体一致，并且因此在某些实施方案中，所述植物在v6阶段、v7阶段、v8阶段、或v9阶段处进行处理。在某些实施方案中，所述植物在v7阶段、v8阶段、或v8阶段处进行处理。这些较晚时间/阶段处进行的处理在玉米中与在植物的主茎上诱导增加的穗(包括共优势穗)相关联。穗数量增加可导致产率增加，包括种子数量增加。
[0068]
在某些实施方案中，所述植物在发芽之后约35天至发芽之后约40天进行处理。此时间表与v10阶段、v11阶段、或v12阶段大体一致，并且因此在某些实施方案中，所述植物在v10阶段、v11阶段、或v12阶段处进行处理。在某些实施方案中，所述植物在v10阶段或v11阶段处进行处理。在这些最晚时间/阶段处进行的处理在玉米与压缩高于初生的苤节相关联。此压缩可引发更靠近雄穗的一个或多个穗，并且因此增加授粉的速率。因此，压缩高于初生穗的苤节可导致产率增加，包括种子数量增加。
[0069]
在某些实施方案中，植物可在多个时间/阶段处进行处理以组合可增加产率的各种处理诱导的属性。
[0070]
在某些实施方案中，植物首先在v1阶段、v2阶段、v3阶段、v4阶段、或v5阶段处进行处理和/或在发芽之后约5天至发芽之后约20天进行处理。所述植物然后在v6阶段、v7阶段、v8阶段、或v9阶段处再次进行处理和/或在发芽之后约21天至发芽之后约35天再次进行处理。在某些实施方案中，所述植物在v10阶段、v11阶段、或v12阶段进一步进行处理和/或在发芽之后约35天至发芽之后约40天进一步进行处理。
[0071]
在某些实施方案中，植物首先在v1阶段、v2阶段、v3阶段、v4阶段、或v5阶段处进行处理和/或在发芽之后约5天至发芽之后约20天进行处理。所述植物然后在v10阶段、v11阶段、或v12阶段处再次进行处理和/或在发芽之后约35天至发芽之后约40天再次进行处理。
[0072]
在某些实施方案中，植物首先在v6阶段、v7阶段、v8阶段、或v9阶段处进行处理和/或在发芽之后约21天至发芽之后约35天进行处理。所述植物然后在v10阶段、v11阶段、或v12阶段处再次进行处理和/或在发芽之后约35天至发芽之后约40天再次进行处理。
[0073]
ga抑制剂可以任意种形式施用到植物。在某些实施方案中，ga抑制剂呈溶液的形式，其中仅某一百分比的溶液是ga抑制剂。因此，可确定所施加的溶液或其他介质的量以向植物提供某一量或比率的ga抑制剂。在某些实施方案中，向植物施加有效量的ga抑制剂。有效量是在本文所公开的方法中的至少一种中增加产率的量。在某些实施方案中，ga抑制剂在至少1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、或10mg/植物的比率下施用。在某些实施方案中，ga抑制剂在不超过32mg/植物或不超过50mg/植物的比率下施用。在某些实施方案中，ga抑制剂在约1.0mg/植物或约1.5mg/植物至约5.0mg/植物、8.0mg/植物、10mg/植物、20mg/植物、32mg/植
物、40mg/植物、50mg/植物、或75mg/植物中任一个的比率下施用。在某些实施方案中，ga抑制剂在约8.0mg/植物至约10mg/植物、20mg/植物、32mg/植物、40mg/植物、50mg/植物、或75mg/植物中的任一个的比率下施用。
[0074]
在某些实施方案中，在早期时间/阶段处进行的处理发挥作用需要较少ga抑制剂。在某些实施方案中，所述植物在v1阶段、v2阶段、v3阶段、v4阶段、或v5阶段处进行处理并且/或者所述植物在发芽之后约5天至发芽之后约20天进行处理，并且ga抑制剂在约1.0mg/植物或约1.5mg/植物至约5.0mg/植物、约8.0mg/植物、或约10mg/植物中的任一个的比率下施用。
[0075]
在某些实施方案中，在较晚时间/阶段处进行处理发挥作用需要较多ga抑制剂。在某些实施方案中，所述植物在v6阶段、v7阶段、v8阶段、v9阶段、v10阶段、v11阶段、或v12阶段处进行处理并且/或者所述植物在发芽之后约21天至发芽之后约40天进行处理，并且ga抑制剂在约8.0mg/植物、约10mg/植物、或约15mg/植物至约20mg/植物、32mg/植物、40mg/植物、50mg/植物、或75mg/植物中的任一个的比率下施用。
[0076]
在某些实施方案中，产率增加(诸如种子数量增加)可至少部分地归因于分蘖诱导。在某些实施方案中，使用ga抑制剂进行的处理诱导分蘖形成。在某些实施方案中，使用ga抑制剂进行的处理增加与未处理对照相比的处理植物上的分蘖的数量。在某些实施方案中，处理引起具有比未处理对照多至少1个、2个、3个、4个、或5个分蘖的处理植物。在某些实施方案中，其中所述植物是玉米植物，处理引起具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、或7个分蘖的玉米植物。在某些实施方案中，其中所述植物是小麦植物，处理引起具有至少14个分蘖的小麦植物。
[0077]
因为发现用于产率增加的潜力，在某些实施方案中，选择具有分蘖的ga抑制剂处理的植物。所选植物可在分蘖连接到主杆的情况下生长。然而，在某些实施方案中，分蘖与主杆分离。这些分离的分蘖可再种植。这些再种植的分蘖可生长以便产生种子。在玉米的情况下已发现，当去除并且单独生长时，来自主杆和单独生长的分蘖的玉米谷粒的数量可大于在分蘖保持连接的情况下由植物主杆和分蘖产生的组合谷粒的数量。还发现，当去除并且单独生长时，来自单独生长的分蘖的组合的玉米谷粒的数量可大于在分蘖保持连接到主杆的情况下由分蘖产生的组合谷粒的数量。在某些实施方案中，再种植的分蘖可使用ga抑制剂进行处理，以便进一步增加来自与未处理分蘖相比的此分蘖的产率。
[0078]
种子数量增加在植物发育和育种程序中对于增加筛选容量和/或产生足够的种子来提供统计上显著的研究结果是有益的。在某些实施方案中，收获ga抑制剂处理的植物的种子。在某些实施方案中，所收获的种子以某种方式进行筛选例如以确定基因型或表型。在某些实施方案中，对所收获的种子进行基因型分析。在某些实施方案中，种植所收获的种子。在某些实施方案中，从所收获的种子生长的植物在没有ga抑制剂处理的情况下生长。因为ga抑制剂处理不改变植物的基因型，所以ga抑制剂处理的植物的后代将不表现出处理植物的分蘖产生增加、高度降低、种子数量增加等的属性。在某些实施方案中，从所收获的种子生长的植物也使用如本文所述的ga抑制剂进行处理。
[0079]
在某些实施方案中，产率增加可至少部分地归因于处理的玉米植物上的穗数量增加。穗数量的此增加可来自产生穗的分蘖的诱导、主杆上多个穗(诸如共优势穗)的诱导、或两者。虽然例如在空间精确地受控的田间种植的玉米中分蘖形成通常是不期望的，但是预
期根据本公开的方法处理植物的群体也可用于通过分蘖诱导和/或多个主杆穗诱导增加商业广泛英亩产率或增加种子制造中的种子生产。因此，在某些实施方案中，田间的植物群体(诸如商业种植的植物或用于种子生产的植物)使用如本文所述的ga抑制剂进行处理以增加与未处理对照群体相比的处理群体的产率。
[0080]
在某些实施方案中，产率增加可至少部分地归因于处理的植物的植物高度降低。例如，通常玉米是高植物。玉米植物上穗与雄穗之间的物理距离本身可造成授粉障碍。通过降低植物高度，此距离减小，并且因此可增加自花授粉的速率。此外，正常玉米植物的大小使得覆盖植物是有挑战性的。通过降低植物高度，一些或所有植物可容易地被覆盖以用于增加自花授粉的目的。在某些实施方案中，植物的至少一部分使用授粉袋覆盖。在某些实施方案中，所述袋涵盖植物的顶端并且覆盖最低的穗苤节。在某些实施方案中，所述袋覆盖植物的顶端和至少一个穗。在某些实施方案中，所述袋覆盖高于地面的整株植物。
[0081]
在某些实施方案中，所述袋可具有以下属性中的一种或多种：它是高密度和低密度聚乙烯热塑性片材的共混物(例如，来自tredegar plastics的vispore(x
‑
6606产品编号))；其按重量计的厚度＝1.75mm；其压印厚度＝23密耳；其以毫米为单位的孔大小＝18；其以微米为单位的孔大小＝75至450；纤维是透明的并且允许空气和光穿过。
[0082]
在某些实施方案中，植物使用如本文所述的ga抑制剂进行处理以降低植物高度。在花粉即将散落之前，自花授粉袋放置在植物的至少一部分上或整株植物上(整株植物套袋法)。当包括任何相邻植物的区域中花粉散落完成之后，去除袋。剧烈的空气运动和植物和袋的摇动可增加结实率。
[0083]
自花授粉袋还可放置在相同或不同容器中或在田间靠近生长(称为“自动杂交化”)的两株或更多株植物(诸如雄性近交玉米植物和雌性近交玉米植物)的至少一部分上。在某些实施方案中，在花粉即将散落之前覆盖植物。此方法可允许例如在花粉散落的时间内在更连续的基础上在两个近交玉米种质品系之间进行杂交化。此自交袋/自动自交杂交化方法的优点包括减少对于时间和劳动力的需要而增加效率。在某些实施方案中，所述方法包括使用同一个授粉袋覆盖至少两株植物，其中至少一株植物已根据本发明实施方案中的至少一个的ga抑制剂处理的方法进行处理。因为使用ga抑制剂进行的处理可引起高度降低的植物，所以在某些实施方案中，对通过所述袋覆盖的所有植物进行处理以便使其高度大体上一致以用于授粉袋装配。在某些实施方案中，至少一株植物将其一个或多个雄穗去除并且至少一株植物具有一个或多个雄穗以便生成花粉。在某些实施方案中，两株植物使用同一个授粉袋覆盖，并且一株植物将其一个或多个雄穗去除并且一株植物具有一个或多个雄穗。在某些实施方案中，所述一个或多个雄穗在杂交中从雌株去除。
[0084]
在某些实施方案中，使用ga抑制剂进行的处理在播种之后35
‑
40天处(或相当的发育阶段)进行，从而引起高于初生穗的压缩苤节。这引发靠近穗丝的雄穗。晚期处理允许仅对植物的上部进行套袋，不同于较早处理，其不压缩上部苤节并且因此适用于整株植物套袋。早期处理和较晚处理与雄穗和穗丝的靠近性之间的此相关性在图12中示出。
[0085]
在某些实施方案中，处理植物的最小种子量通常大于从未处理植物获得的种子数量。例如在玉米中，田间苗圃产率可以是大约100个谷粒/植物(kpp)，并且根据本发明实施方案使用ga抑制剂进行的处理可增加此产率。在某些实施方案中，ga抑制剂处理引起至少约250kpp、至少约600kpp、或至少约1000kpp。在某些实施方案中，ga抑制剂处理引起约
250kpp至约600kpp、约1000kpp、或约2000kpp中的任一个。在某些实施方案中，ga抑制剂处理引起约600kpp至约1000kpp或约2000kpp中的任一个。在某些实施方案中，ga抑制剂处理引起约1000kpp至约2000kpp。
[0086]
所提供的方法还增加小麦产率。在某些实施方案中，小麦植物的ga抑制剂处理引起从所处理的植物产生至少约400个种子。在某些实施方案中，小麦植物的ga抑制剂处理引起与未处理对照植物相比的种子数量的至少约20％增加。
[0087]
一般来讲，使用ga抑制剂的较早处理引起产率和/或种子数量的较大增加。在玉米中，这可能是部分地因为较早处理可诱导分蘖形成并且因此诱导较大数量的穗的潜力。较早处理还可与较晚处理组合。然而，仅较晚处理仍然可引起产率增加并且可向诸如植物形态学(诸如对于控制授粉是所希望的)提供优点。
[0088]
在某些实施方案中，收获来自具有某一数量的种子的ga抑制剂处理的植物的种子，诸如用于育种程序或种子生产操作。在某些实施方案中，采集、收获等产生至少约200个谷粒、至少约600个谷粒、至少约1000个谷粒、或至少约2000个谷粒的玉米植物的种子。在某些实施方案中，采集、收获等产生至少约400个种子的小麦植物的种子。此种子可诸如通过基因型分析针对基因型或表型性状进行筛选，以用于例如育种程序。此种子还可用于商业种植或用于诸如种子生产程序中的额外种子的扩增。
[0089]
某些实施方案提供通过本文所公开的本发明方法中的任一种产生的单子叶植物，包括具有增加的产率、增加的种子产率、增加的分蘖数量、增加的穗数量、和/或指定数量的分蘖、穗和/或谷粒/种子等的植物。某些实施方案提供通过本文所公开的本发明方法中的任一种产生的单子叶植物的群体，包括具有增加的产率、增加的种子产率、增加的分蘖数量、增加的穗数量、和/或指定数量的分蘖、穗和/或谷粒/种子等的群体。
[0090]
某些实施方案提供通过本文所公开的本发明方法中的任一种产生的单子叶植物种子，包括来自具有增加的产率、增加的种子产率、增加的分蘖数量、增加的穗数量、和/或指定数量的分蘖、穗和/或谷粒/种子等植物的种子。
[0091]
倍增效率
[0092]
单倍体孢子体植物含有配子染色体数(n)并且可自发地或通过人工诱导起源。单倍体往往比具有合子染色体数(2n)的相似基因型的孢子体活力更差且能育性更差，并且对于寻求改善植物遗传学的研究人员的有限直接益处也更少。
[0093]
虽然自发染色体倍增确实发生，但是频率很低(通常小于5％)，使得试图创造双单倍体植物(“dh植物”)的研究人员经常将单倍体植物经受促进染色体倍增的处理。经受染色体倍增处理的单倍体植物幼苗可产生单倍体卵和/或精子，并且如果这些植物成功地自交，则合子染色体数可在后代中恢复，从而复原2n孢子体所期待的活力和能育性。
[0094]
在染色体倍增期间，每个同系物被复制以创造原物的基本上相同的拷贝，并且因此dh植物的整个基因组通常被认为在每个基因座处是纯合的。此过程比传统回交可在较少代中创造完全纯合的和同源的品系，从而提高选择效力、减少育种周期的数量和长度并且消耗较少的资源。
[0095]
然而，使用本领域当前已知的方法从给定单倍体植物生成大数量的双单倍体后代的可能性是很低的，使得这严重减少将其大规模引入竞争性育种程序中的优点。早在20世纪50年代，研究人员已试图提高植物的倍增率并且已发展了针对超过250种作物物种的技
术。然而，甚至所描述的最好的方法可靠地得到仅12％或更小的倍增率，并且通常依赖于施加抗微管药物秋水仙碱，它在所需要的浓度下对于植物是有毒的。所述效果也是高度基因型特异性的。
[0096]
此外，当前的倍增方法是劳动密集型的并且经常需要在处理期间对植物进行若干次处理，这降低其存活率。单倍体植物经常在秋水仙碱处理期间变得很脆弱，使得即使它们经过了处理并且成功地倍增，它们也无法从将其移植到田间、温室或其他生长条件(其中它们可恢复并且最终生长而产生种子)所必需的随后的处理和下游处理步骤存活。因此，当将一种倍增方法的总体有效性与另一种进行比较时，植物育种人员和研究人员通常使用表征单倍体植物倍增的可能性以及植物存活下来以产生双单倍体种子的可能性两者的标准。
[0097]
通过与染色体倍增剂接触而经受染色体倍增处理的单倍体植物(或在某些实施方案中待经受染色体倍增处理的单倍体植物)(称为dh0植物)可产生单倍体卵和/或精子，并且如果dh0植物成功地自交，则合子染色体数可在后代(称为dh1种子、植物等)中恢复，从而复原2n孢子体所期待的活力和能育性。“倍增效率”(de)是通过将产生dh1种子的命名为dh0植物的数量除以经受染色体倍增处理的此命名的dh0植物的总数量计算的倍增成功的总体标准。
[0098]
虽然回收单个dh1种子可在技术上计为一个成功倍增事件，但是植物育种人员通常需要至少若干株植物的群体以便生成从其遗传和统计测试得出可信结论所必需的统计能力。例如，仅产生一个或很少dh1种子的倍增处理在竞争性育种程序中具有有限用途，因为需要种植、生长、授粉和收获的至少一个额外的代来生成用于准确统计测试的足够的群体大小，尤其是计划跨多个环境进行比较时。在相对大的育种程序中，此种子“增量”步骤将此群体的测试推后整个季节，这通常使商业产品的释放推迟至少一年。
[0099]
为了更好地定量倍增处理效力，可在计算de的过程期间应用最小产率约束，使得给定dh0植物必需至少产生最小数量的dh1种子，之后将其计数在成功倍增事件的部分中，即用于分子中。下标可用于表明最小产率约束，使得当产生至少20个dh1种子的仅dh0植物除以经受倍增处理的dh0植物的总数量时，de
20
是所计算的倍增效率。当产生至少30个dh1种子的仅dh0植物除以经受倍增处理的dh0植物的总数量时，de
30
表示de。相似地，当产生至少50个dh1种子的仅dh0植物除以经受倍增处理的dh0植物的总数量时，de
50
表示de，并且以此类推。
[0100]
腋芽诱导和促进
[0101]
本文所描述的是现在可能明显地增加从dh0单子叶植物在单代中回收靶标数量的种子的可能性的发现。方法包括诱导或促进单子叶植物发育可得到额外花序的各种不同类型的腋芽中的至少一种。在不同生长阶段处进行的控制发育的腋芽类型的腋芽诱导和/或处理植物的不同实施方案是可能的。非限制性实例包括多芽、分蘖和共优势穗，其在本文中详细定义。
[0102]
单子叶植物中的腋芽诱导减轻通常抑制侧枝和/或次生花或花序的发育的顶端优势。在某些实施方案中，使用者致使母本植物产生比植物育种和作物培养的当前方法更大数量的分蘖雌性花序和能育性雌卵，所述当前方法聚焦于使单一雌性花序的发育最大化。
[0103]
虽然已知有时自发出现和发育，但是玉米中的腋芽的形成或发育目前是出于本文所述的多种原因从育种程序消除的不合需要的性状。在这些中的是负责维持顶端优势的激素抑制腋芽花的发育的想法，所以如果所述植物不浪费使其或支持其的营养结构发育的资
源，则这是更高效的。这在现代玉米杂交体中是尤其明显的，其中产率通常通过生长选择来将其资源集中于发育配出良好后代的单个性能极好的穗并且使任何腋芽或次生花序的发育最小化的杂交体而在良好环境中最大化。
[0104]
然而，已发现，通过在植物生命周期的许多可能的点中的一个或多个处将单子叶植物经受若干可能的腋芽诱导处理中的至少一种，可能释放针对植物育种人员选择的较大顶端优势的发育编程。在某些实施方案中，使用者将单子叶植物经受促进至少一个先前存在或原始的腋芽的发育的处理，使得其在玉米植物的主茎上形成侧向侧枝(例如，分蘖)或次生(或第三或第四等)花序。使用者可使玉米植物上的至少一个腋芽的发育与玉米植物上的其他腋芽的发育同步，以实现植物上的表现出共优势穗所期待的性状(包括在同一时间接受授粉)的至少两个穗(例如，共优势穗)的同时且协调的发育。本文中的描述和实施例使使用者能够从广泛范围的选项选择和/或发展诱导处理参数的适当组合以适应特定需要。某些实施方案包括将植物经受重置主茎的苤节区域中的至少一个细胞的发育程序的处理，使得其得到发育为能够产生分蘖花序(例如，多芽)的新侧向分枝的至少一个新侧向枝分生组织。
[0105]
因此，在某些实施方案中，使用者可通过诱导dh0单子叶植物从腋芽形成额外的花、对这些花进行授粉并且然后收获从这些额外的花形成的种子直至获得靶标数量的种子来确信地从dh0单子叶植物回收靶标数量的种子。通过组合由被诱导而形成额外的腋芽的植物产生的所有种子，可增加在单代中从单株母本植物产生所需数量的种子的机会。
[0106]
配出后代
[0107]
在玉米中，成功的谷粒形成需要支持受精所必需的雌性结构完全发挥功能的时间表和花粉是有活力的并且从雄穗释放的时间表的重叠。良好地配出后代描述这些时间表的重叠足以使穗上的可获得的卵巢的大部分(如果不是所有的话)受精的情况。因为花粉对于干燥、热和其他环境因子可能是敏感的，所以良好地配出后代的时间表经常限于若干天或甚至几周。如果花粉释放过快，使得在雌花接受授粉时大部分或所有花粉不是有活力的，则配出后代较差，从而导致许多未受精的卵和较差结实率。当花粉释放很晚，使得穗丝死亡或者雌花另外地不再接受受精和/或不再能够支持受精，则也期待配出后代较差。在正常生长条件下，次生穗的发育通常被抑制并且延迟，使得初生穗通常是其发育足以与雄穗的发育匹配以用于发生良好地配出后代的唯一的穗。
[0108]
配出后代在玉米生命周期中发挥关键连接作用，所以商业生产者和玉米育种人员等花费大量资源用于确保此连接作用。并不少见的是，竞争性或工业育种程序淘汰以其他方式表现出极佳的性能但是未配出良好后代并且因此其维持变得不经济的品系。例如，dh0植物的群体可表现处非常高的倍增率并且包含极佳的遗传特征，但是如果它配出后代很差，使得难以产生足够的种子来自交和/或维持或者需要多于一代来产生足够的种子用于性能测试，则它可能仍然被消除而不用于进一步的发展。
[0109]
植物处理剂
[0110]
在本文提供的某些实施方案中，植物可与广泛种类的“植物处理剂”接触。因此，如本文所用，“植物处理剂”、或“处理剂”、或“剂”可指代可引入到植物的表面并且迁移到植物组织中的任何外源性提供的化合物。在一些实施方案中，植物处理剂在植物组织内在细胞外起作用，诸如与外细胞表面上的受体相互作用。在一些实施方案中，植物处理剂进入到组
织内的细胞中。在一些实施方案中，植物处理剂包含在液体内。此类液体包括但不限于溶液、悬浮液、乳液、以及分散体。
[0111]
将植物与处理剂接触可在施加其他物质之前、期间或之后发生。在某些实施方案中，植物与处理剂之间的接触通过将植物浸入、浸没或以其他方式插入到含有植物处理剂的液体的储器中来实现。将植物与处理剂接触的其他方法包括使用含有植物处理剂的溶液对植物进行喷涂或喷雾，或者将植物在含有植物处理剂的溶液中进行搅拌或翻转。在某些实施方案中，植物与处理剂之间的接触通过土壤浸液实现，其包括将液体处理剂添加到植物生长的根部附近的土壤或生长介质。
[0112]
在某些实施方案中，液体具有含水性质。在某些实施方案中，含水液体可包含水溶性组分。在某些实施方案中，含水液体可包含水溶性组分，可包含通过添加表面活性剂而使得在水中可溶的不溶性组分，或可包含可溶性组分、不溶性组分和表面活性剂的任何组合。
[0113]“植物处理溶液”或“处理溶液”可指代含有植物处理剂的任何液体溶液。在某些实施方案中，植物处理溶液含有植物处理剂并且两个术语可经常同义地使用。例如，将含有植物处理剂秋水仙碱的植物处理溶液递送到植物分生组织与将含有秋水仙碱的植物处理剂递送到植物分生组织是基本上同义的。
[0114]
植物处理剂包括但不限于大分子包括多核苷酸(包括核酸(例如，dna和/或rna))、多肽、多糖、聚酮化合物等。多核苷酸可以是单链或双链，并且可包括反义分子和干扰rna。多核苷酸可包括本领域熟知的诸如对于其主链的突变和/或各种其他修饰。多核苷酸包括“遗传因子”，其包括插入到植物基因组中的重组dna构建体(通常称为“转基因”)、或核苷酸序列或植物基因组的遗传基因座。因此，在某些实施方案中，此发明的使用者可将dna或rna的序列递送到靶向组织中以改变植物性状的表达或遗传，例如以便通过将遗传因子插入到其基因组中来有效地“转化”植物。
[0115]
植物处理剂还可包括各种植物激素、植物激素激动剂、植物激素拮抗剂、或刺激或抑制植物激素获取、信号传导或合成的剂。在某些实施方案中，植物处理剂包括植物生长调节剂(pgr)。pgr是影响植物或植物部分的细胞过程、生长、发育或行为的一类化合物。在一些实施方案中，pgr负责加速或迟缓生长或成熟速率或以其他方式改变植物或植物部分的行为。在一些实施方案中，pgr是天然存在的植物激素。在一些实施方案中，pgr是改变开花、结间长度、顶端优势、熟化、根部构造、或结果的化学品，包括影响单子叶植物的生长、发育、行为、或生殖的任何物质。植物生长调节剂包括生长素(例如，iaa)和生长素抑制剂、细胞分裂素(例如，bap)和细胞分裂素抑制剂、可刺激乙烯产生的化合物(即，acc等)和可抑制乙烯产生的化合物(avg等)、以及抑制乙烯获取的化合物(银等)。植物生长调节剂还包括调节植物获取、信号传导和/或行为的化合物，诸如赤霉素及其抑制剂(本文中还称为赤霉酸抑制剂(ga抑制剂))、脱落酸及其抑制剂、和茉莉酮酸及其抑制剂。其他实例包括肽类激素，例如系统素、植物硫酸肽、快速碱化因子等。
[0116]
iaa是吲哚
‑3‑
乙酸，并且iba是吲哚
‑3‑
丁酸。两者均是称为生长素的一类植物激素的天然存在形式。可使用生物素的其他变型，包括合成生长素，诸如2,4
‑
d(2,4
‑
二氯苯氧乙酸和α
‑
naa(α
‑
萘乙酸)。
[0117]
bap是6
‑
苄氨基嘌呤、n
‑
(苯基甲基)
‑
7h
‑
嘌呤
‑6‑
胺，还写为c12h11n5。iaa是吲哚
‑3‑
乙酸，并且iba是吲哚
‑3‑
丁酸。两者均是称为生长素的一类植物激素的天然存在形式。生
长素的其他变型可与本发明一起使用，包括合成生长素，诸如2,4
‑
d(2,4
‑
二氯苯氧乙酸)和1
‑
naa(1
‑
萘乙酸)。
[0118]
一般来讲，本文所用的植物处理剂是水溶性剂。然而，在某些实施方案中，具有高、中、低或可忽略不计的水溶性的植物处理剂的用途可通过使用还含有各种转移剂或调理剂的液体组合物来促进。转移剂或调理剂可包括有利于植物处理剂迁移到植物(例如，植物细胞)和/或有利于植入摄入植物处理剂的任何剂。转移剂或调理剂包括但不限于(a)表面活性剂、(b)有机溶剂或含水溶液或有机溶剂的含水混合物、(c)氧化剂、(d)酸、(e)碱、(f)油、(g)酶、或其组合。在某些实施方案中，方法可任选地包括孵育步骤、中和步骤(例如，中和酸、碱、或氧化剂，或使酶失活)、冲洗步骤、或其组合，通过所述方法，所述液体和其中所含的植物处理剂在递送到植物之前或之后进行处理。转移剂或调理剂因此包括但不限于乳液、反相乳液、脂质体、以及其他胶束状组合物。可用的佐剂的实例包括表面活性剂和其中所含的有效分子，其包括脂肪酸(诸如牛脂或牛脂胺或磷脂)的钠盐或锂盐。转移剂或调理剂可含有盐，包括但不限于钠盐、铵盐、钙盐、锂盐、镁盐、氯盐、硫盐、以及硫酸盐。本文提供的方法的某些实施方案使用已知与植物处理剂缔合的反离子或其他分子。对于某些带负电的植物处理剂诸如多核苷酸，可使用阳离子诸如无机铵离子、烷基铵离子、锂离子、多胺诸如精胺、亚精胺、或腐胺等。可用于调理植物细胞而使某些植物处理剂(包括但不限于多核苷酸)透过的有机溶剂是溶剂，诸如dmso、dmf、吡啶、n
‑
吡咯烷、六甲基磷酰胺、乙腈、二氧六环、聚丙二醇、或可与水混溶的其他溶剂。可使用具有或不具有表面活性剂或乳化剂的天然衍生的油或合成的油，例如可使用植物来源的油、作物油(诸如在“herbicide.adjuvants.com”处在万维网(因特网)上可公开获得的第9版compendium of herbicide adjuvants中列出的那些)。可用于在本文提供的方法中使用的某些液体组合物的油包括但不限于石蜡油、多元醇脂肪酸酯、或具有使用胺或多胺(诸如聚乙烯亚胺)或n
‑
吡咯烷修饰的短链分子的油。
[0119]
在某些实施方案中，植物处理剂可以是染色体倍增剂。染色体倍增剂用于生成双单倍体植物细胞和双单倍体植物。染色体倍增剂可包括导致染色体倍增的各种有丝分裂抑制剂。在某些实施方案中，染色体倍增剂可以是化合物，诸如秋水仙碱、甲基胺草磷、氟乐灵、氨磺乐灵、炔苯酰草胺、或氯苯胺灵。在又其他实施方案中，染色体倍增剂可以是低哺乳动物毒性染色体倍增剂。可使用的各种低哺乳动物毒性染色体倍增剂包括但不限于化合物，诸如：i)1,2,3
‑
三甲氧基
‑4‑
((1s,6r)
‑6‑
硝基
‑
环己
‑3‑
烯基)
‑
苯和在美国专利申请公布2010/0169999中所公开的其他相关化合物；以及ii)授予michelotti等人的美国专利号5,866,513中所公开的化合物。美国专利申请公布2010/0169999和美国专利号5,866,513以引用的方式整体并入本文。具体地，美国专利号5,866,513的3
‑
4栏、5
‑
6栏和7
‑
8栏上的表i和表1a中公开的76种化合物各自以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，染色体倍增剂是多核苷酸。
[0120]
在某些实施方案中，广泛范围的化学浓度和投配方案可与这些方法结合使用，并且本领域的普通技术人员可优化施用到给定基因型的剂量以便使共优势穗形成最大化和/或在共优势穗之间使配出后代和/或受精最大化。
[0121]
植物类型
[0122]
除非另外指明，否则本公开不限于任何特定类型的单子叶植物。例如，在某些实施
方案中，单子叶植物是禾本科的成员、小麦植物、玉米植物、甜玉米植物、稻植物、野生稻植物、大麦植物、黑麦、小米植物、高粱植物、甘蔗植物、草坪草植物、竹植物、燕麦植物、菠萝草植物、芒属植物、阿根廷草原草植物、柳枝稷(黍属)植物、和/或玉米草植物，或者是葱科的成员、洋葱植物、韭葱植物、大蒜植物。
[0123]
除非另外指明，否则如本文所用，植物可以是任何全单子叶植物、或单子叶植物的一部分、或来源于单子叶植物的组织培养物、或单子叶植物种子；具有植物处理剂可递送到的组织。植物可具有各种染色体含量，诸如单倍体、二倍体、三倍体、四倍体等。多倍性通常指代具有大于三倍体的倍数性水平的状态。在某些实施方案中，在组织培养物中生长的植物组织与非组织培养物植物之间进行区别。
[0124]
除非另外指明，否则如本文所用，植物的表面是指在不牵拉、切割等植物以使额外的区域暴露的情况下通常暴露于植物周围的外部环境的表面。例如，如果植物完全浸没在溶液中，植物的表面通常是植物的将与溶液接触的部分。
[0125]
植物组织可以是任何植物组织。在某些实施方案中，植物组织可包括功能性分生组织或能够形成功能性分生组织的细胞的分组。功能性分生组织定义为具有得到新植物组织或器官的能力的多能细胞的中心。在某些实施方案中，植物组织包括分生组织，诸如根顶端分生组织或枝顶端分生组织。
[0126]
在某些实施方案中，植物处理剂递送到靶向的或选择的植物组织。植物组织可基于组织对于植物处理剂的应答和/或所寻求实现的对植物生长、特征、遗传学、产率等的影响来靶向或选择。例如，枝顶端分生组织，具体地dh0植物的枝顶端分生组织可选择用于染色体倍增剂的递送。所选组织可位于植物的表面处，并且/或者它可位于植物表面下或植物表面的一部分下。因此，在某些实施方案中，其中甚至植物的整个表面诸如通过完全浸没植物而被含有植物处理剂的溶液接触，所选组织的至少一部分可不被溶液接触。
[0127]
在某些实施方案中，在发芽之前，植物或植物的繁殖体与植物处理剂接触以便将处理剂递送到植物的至少一个所选组织。在某些实施方案中，本领域已知的胚胎拯救技术用于在种子发芽之前从种子切下胚胎以便使胚胎更好地接触处理剂。在切下之后，胚胎可体外培养或以其他方式在促进其存活并发育为幼苗的条件中生长。因此，在发芽之前植物处理剂递送到植物的所选组织可使用本领域当前已知的各种技术(包括胚胎拯救技术)来改善，从而允许胚胎被植物处理剂接触。在某些实施方案中，这些方法用于将倍增剂递送到单倍体胚胎的分生组织，以便创造能够产生功能性单倍体配子的至少一种双单倍体生殖组织。
[0128]
用于本文所述的方法的单子叶植物可处于各种发育阶段中的任一个处。例如，玉米植物可通过其营养生长和生殖阶段描述，并且如本文所用，玉米谷粒发育阶段(leaf collar法：v1
‑
vn、vt、r1
‑
r6等)如在abendroth、l.j.、r.w.elmore、m.j.boyer、以及s.k.marlay，2011，corn growth and development，pmr 1009，iowa state university extension，ames，iowa中所描述的。例如，小麦植物可根据幼苗发育的以下图表进行描述(表a)：
[0129]
表a.
[0130][0131]
在某些实施方案中，单子叶植物是玉米植物。在某些实施方案中，单子叶植物是玉米植物并且植物组织是分生组织。在某些实施方案中，单子叶植物是玉米植物并且植物组织包括枝顶端分生组织(sam)。在某些实施方案中，单子叶植物是玉米植物，植物组织包括枝顶端分生组织，并且玉米植物在种子内或在发芽或处于ve、v1、v2、v3、v4、v5、v6、v7、v8、v9、v10、v11、或v12营养生长阶段处或处于其之间。在某些实施方案中，单子叶植物是单倍体玉米植物，植物组织包括枝顶端分生组织，玉米植物在种子内或在发芽或处于ve、v1、v2、v3、v4、v5、v6、v7、v8、v9、v10、v11、或v12营养生长阶段处或处于其之间。
[0132]
本文所述的方法不被植物发育的某些阶段限制。预期延长或以其他方式修改生长阶段的持续时间的技术可与本发明结合使用以扩展使用者施加pgr以便诱导额外的枝顶端分生组织和/或腋芽和/或共优势穗的发育的时机的选择。
[0133]
用于产生双单倍体植物的方法
[0134]
本文所述的某些实施方案提供本领域的普通技术人员数十年难以解决的问题的解决方案。此问题是如何确保基本上任何双dh0植物在单代中产生所需数量的dh1种子。在某些实施方案中，从dh0植物回收至少最小数量的dh1种子(例如，至少一个dh1种子、至少四个dh1种子、至少二十个dh1种子等)的可能性可通过诱导或促进dh0植物发育至少一个额外的腋芽来提高。此过程可与其他腋芽同时和/或依次重复，直至生成靶标数量的种子为止。通过将由至少一个腋芽产生的种子与由至少另一个腋芽产生的种子和/或由dh0母本植物的初生芽产生的种子组合，这些方法可提高从单株dh0植物回收数打、数百个或甚至数千个dh1种子的可能性。
[0135]
基于秋水仙碱的染色体倍增方案通常建议若干分钟至若干小时的暴露并且依赖于以下希望：在此时间期间，不仅秋水仙碱特异性地接触得到生殖器官的枝顶端分生组织的细胞，而且所述接触在细胞周期的染色体倍增发生所必需的特定时间段期间发生。此方案的不确定性转变为低玉米倍增可预测性的问题和植物育种人员许多年难以解决的效率问题。
[0136]
在某些实施方案中，当前dh方法的不可预测性可通过增加每个单株母本dh0玉米
植物具有的达到产生双单倍体花序所必需的条件的机会的次数来降低。已发现，现在可诱导单株单倍体玉米植物来在远远更大的频率和可靠性的情况下产生靶标数量的dh1后代。可诱导单倍体植物将多个腋生分生组织形成为能育的结果结构来产生与未以此方式诱导的对照植物相比更大数量的dh1种子。
[0137]
用于获得双单倍体植物、种子和/或细胞的单倍体单子叶植物可通过任何方法获取。在某些实施方案中，单倍体玉米植物或来源于其的单倍体穗可通过将诱导物品系(雄性)与所需品系(如雌性)杂交以在雌性品系中诱导单倍体植物细胞形成来获得。玉米的示例性诱导物品系包括但不限于stock 6、rws、kems、krasnodar单倍体诱导物(khi)、kms或zms、包含不定配子体(ig)突变的品系及其衍生物。在其他实施方案中，广泛杂交化杂交可用于产生单倍体。广泛杂交化杂交的示例性描述可见于kasha和kao，1970，nature225:874
‑
876。单倍体诱导的任何其他方法也可与这些方法一起使用，包括基于分子或转基因的途径，例如，涉及cenh3改变的那些或其他基于基因组降解的方法。
[0138]
某些实施方案提供获得双单倍体玉米植物细胞的方法，所述方法包括将玉米植物与含有植物处理剂的溶液接触(其中所述植物处理剂是染色体倍增剂)以及允许倍增剂导致至少一个双单倍体植物细胞的形成。本文还提供的是获得双单倍体玉米植物细胞的方法，所述方法包括从包含双单倍体植物细胞的种子收获双单倍体植物细胞。在某些实施方案中，当从种子收获植物细胞时，种子在玉米的穗上。
[0139]
某些实施方案提供获得双单倍体玉米植物的方法，所述方法包括获得通过本文提供的方法中的任一种衍生的双单倍体玉米胚胎以及向胚胎供应足够的营养物质以实现胚胎发育为双单倍体玉米植物种子。双单倍体玉米胚胎可通过包括执行将含有植物处理剂的溶液递送到枝顶端分生组织中(其中所述植物处理剂是染色体倍增剂)以及允许倍增剂诱导染色体倍增的前述方法中的任一种的方法来形成。
[0140]
在这些方法的某些实施方案中，双单倍体玉米植物细胞从第三方获得。换言之，导致双单倍体玉米植物细胞的形成的一方不一定是供应营养物质以允许植物细胞发育为双单倍体玉米植物的一方。
[0141]
本文还提供的是获得包含双单倍体玉米植物细胞的种子的方法，所述方法包括收获包含通过获得双单倍体玉米植物细胞的方法获得双单倍体植物细胞的种子。双单倍体玉米植物细胞可通过包括执行将含有植物处理剂的溶液递送到植物中(其中所述植物处理剂是染色体倍增剂)以及允许倍增剂诱导种子中的至少一个中的至少一个双单倍体植物细胞的形成的前述方法中的任一种的方法来获得。在某些实施方案中，所收获的种子是生理上成熟的种子。
[0142]
本文还提供的是获得双单倍体玉米植物的方法，所述方法包括播散通过获得包含双单倍体玉米植物细胞的种子的方法获得的包含双单倍体玉米植物细胞的种子以及允许所播散的种子发育为双单倍体玉米植物。在某些实施方案中，包含双单倍体玉米植物细胞的种子从第三方获得。换言之，收获种子的一方不一定是播散包含双单倍体植物细胞的种子并且允许所播散的种子发育为双单倍体玉米植物的一方。
[0143]
在某些实施方案中，双单倍体植物细胞可通过从在通过本文提供的方法使用染色体倍增剂处理的dh0植物上形成的dh玉米穗收获dh1种子来获得。可收获来源于dh0母本植物上的dh穗的生理上成熟的dh1种子来获得包含在种子中的双单倍体植物细胞。还可播散来
自处理的dh穗dh0植物的生理上成熟的dh1种子，并且允许发芽以获得双单倍体玉米植物。
[0144]
在某些实施方案中，单倍体植物细胞可通过从穗上的谷粒拯救植物细胞来从使用染色体倍增剂处理的玉米穗回收。植物细胞拯救可通过从穗取出处理的植物细胞、将植物细胞放置在提供用于植物细胞和/或植物发育的培养基中、并且允许植物细胞和/或植物发育发生来执行。在某些实施方案中，提供用于植物细胞和/或植物发育的培养基可包含一种或多种植物激素、盐和/或糖。用于植物细胞拯救的各种培养基和技术描述于matthys
‑
rochon等人，journal of experimental botany，第49卷，第322号，第839
–
845页，1998中。
[0145]
这些方法可针对广泛范围的参数进行调整以便使在植物的基本上任何基因型的共优势穗之间配出后代最大化。本领域的普通技术人员可针对与这些方法结合的已知影响植物发育的任何数量的变量调整这些方法，包括改变种植密度、剂量、化学处理方法或在多种不同范围的植物基因型或种质中改善配出后代和/或受精和/或种子产生的时间。在某些实施方案中，植物可在不同密度下种植以影响共优势穗形成。在某些实施方案中，植物可使用许多可能的化学剂(例如，影响穗形成的剂，像ga抑制剂)中的至少一种、使用在基本上任何基因型或基因型集中在至少两个共优势穗之间优化形成和配出后代的许多可能的剂量水平中的至少一个来处理。在一些实施方案中，可提供本领域已知的影响植物发育的一些其他处理以便优化共优势穗形成。在一些实施方案中，可使用以上的组合来优化共优势穗形成。在一些实施方案中，对于不同的基因型可使用不同的处理以便优化总体共优势穗形成。
[0146]
植物育种
[0147]
本文提供的方法可用于通过增加给定母本植物在单代中产生的重组后代的数量来增加单子叶植物中的植物育种的效率。此实现对于植物育种具有明显且广泛的应用，因为它增加单株单子叶植物产生包含遗传因子的统计上不太可能但是优异的组合的后代的可能性。采用这些方法来将某些dna序列、基因型和/或表型性状整合到靶标种质和/或基因组中的植物育种人员将能够比使用本领域已知的当前方法的育种人员使用更少的母本植物和使用更少资源来创造包含含有特定遗传因子集的dna序列的配子。这部分地由于本文所述的方法有效地使使用者能够诱导母本植物产生每株植物更多的种子，这相当于每株植物具有更多减数分裂，这相当于每株植物具有发生所需遗传重组的更多机会。每株植物具有更多重组机会因此转变为需要更少的植物(和更少的资源)来达到实现回收具有遗传因子的所需组合的至少一株植物的高可能性所必需的有效群体大小。
[0148]
例如，当植物育种人员使用轮回选择来将所需遗传因子渗入到靶标种质中时，他们依赖于在基因座(侧接所需遗传基因座的基因组)中的靶标种质与供体种质的同源染色体之间发生遗传重组。这些方法的使用者具有更大可能性生成具有包含仅通过赋予所需遗传因子所必需的供体基因组的序列修饰的靶标种质的基因组的母本植物，因为这些方法生成每株植物更多的重组事件，并且因此使用者比其他性状整合方法的使用者具有更大可能性创造包含并入到其基因组中的遗传因子的所需布置的植物。
[0149]
当尝试将多种遗传因子渗入到靶标种质中时此方法的益处变得更加明显，因为将额外的遗传因子渗入到靶标种质中所需要的遗传重组事件的数量随着需要并入的额外的遗传因子的数量快速增加。这些方法的使用者将发现他们需要远远更少的母本植物来实现回收所需渗入事件的高可能性，并且因此与使用忽视腋芽和/或不有意诱导腋芽来产生果
实的本领域的当前方法的使用者相比可明显地增加在配子中创造遗传因子的所需布置的效率。
[0150]
此实现在花序单子叶物种(例如，玉米)中是尤其有用的，因为每次诱导形成额外的花序，整个穗就具有潜在的价值(对于最高产的杂交体平均500个谷粒或更多)，每个表示在减数分裂期间发生所需要的遗传重组的机会。因此，与使用忽视腋芽或不有意诱导它们来形成并产生果实的本领域的当前方法的育种人员相比，本领域的普通技术育种人员可使用这些方法明显地增加在配子中创造遗传因子的所需布置的效率。
[0151]
这些方法可与延长配出后代、延长花粉散落、或延长穗接受授粉和受精的时间段的本领域已知的任何方法组合使用。例如，雄穗可经受延长雄穗散落花粉的时间段的处理。可保持散落的t花粉以便延伸能够成功授粉和随后的受精的时间段。也可采用已知改善或延伸配出后代的其他方法。
[0152]
在某些实施方案中，腋芽诱导处理可在ve、v1、v2、v3、v4、v5、v6、v7、v8、v9、v10、v11、或v12生长阶段或其任何组合处施加。
[0153]
多芽
[0154]
诱导的腋芽的一种类型是“多芽”，其通过诱导植物从分化细胞从新形成腋芽来衍生。此方法有效地对植物的一个或多个细胞进行重编程以从新产生分生组织、枝或腋芽。
[0155]
在某些实施方案中，单子叶幼苗或单子叶植物胚胎可在仍然连接到种子时经受腋芽诱导(直接种子法)，或者所述幼苗/胚胎可在发芽之前从种子切除(切除胚胎法)，或者所述幼苗/胚胎可在发芽之后与种子分离(胚轴法)。
[0156]
本文所公开的是单子叶植物中的多芽的若干新型用途的发现，包括通过确保从杂交种或自交种生成靶标数量的种子来提高倍增效率(“dh”)。在某些实施方案中，希望确保由dh0植物在单代中生成至少最小数量的种子的使用者诱导dh0植物形成至少一个双单倍体多芽。在某些实施方案中，这些多芽中的至少一个生长为进行自交以产生dh1种子的成熟单倍体植物。此过程可同时和/或依次重复，直至生成所需靶标数量的种子为止。
[0157]
在某些实施方案中，这些方法可首先通过诱导二倍体亲本植物产生然后生长为成熟二倍体植物的至少两个二倍体多芽来增加回收的双单倍体种子的数量。这些多芽衍生的亲本植物然后可使用诱导物进行授粉以形成至少一个单倍体种子，其可随后生长为幼苗并且经受本领域已知的染色体倍增技术来将单倍体转化为dh0植物的群体。dh0植物然后可生长，直至它们产生花并且然后进行授粉以产生dh1种子为止。
[0158]
在某些实施方案中，单株二倍体植物可经受多芽诱导处理以生成若干二倍体多芽。这些多芽可与母本植物分离并且生长，直至它们产生花为止，此时它们可通过诱导物进行授粉。即使一些多芽衍生的穗产生非常少的种子或不产生种子，仍然期待可依次或同时重复此方法，直至当组合来自多芽衍生的穗的所有种子时生成靶标数量的种子为止。按需要的那样多的这些单倍体植物可经受染色体倍增以产生所需数量的dh植物。
[0159]
从至少一个多芽诱导的穗回收并集中的单倍体种子可经受使用者认为适当的任何方式的分析，以便确定哪些种子包含特定性状。这些分析可包括对种子(包括种子的胚胎和所有其他组织)进行分选以识别并分开单倍体种子，包括描述于美国专利申请14/206,238中的单倍体分选方法，所述专利申请公开为us20140266196a1并且以引用的方式整体并入本文。分析还可包括使用本领域已知的方法对组织进行基因型分析。无论单倍体种子如
何进行分析，可基于任何准则选择群体的子集以便限制经受随后的倍增步骤的植物的数量。因此，这些方法可减少未达到靶标选择阈值的花费资源的倍增植物的量。
[0160]
与产生dh植物的当前方法不同，这些方法的使用者不依赖于产生包含至少靶标数量的单倍体卵的穗所必需的倍增细胞的仅单个机会。相反，使用者能够从单株dh0植物产生多个穗，并且因此组合多个倍增机会来实现靶标数量的单倍体卵。
[0161]
分蘖
[0162]
分蘖是腋芽的一种类型。诱导单子叶植物中的分蘖减轻抑制腋芽的发育的限制，使得腋芽能够形成最终产生雄穗和称为穗的至少一个雌花的伸长的侧枝。虽然已知自发形成，分蘖的形成是出于多种原因而从玉米育种程序消除的不合需要的性状，所述原因包括它们使得保持相邻植物的同一性更困难并且增加不同实验处理的杂交污染的种子的可能性。它们还往往在通常分配给个体植物的区域上过度生长，这打乱种植布置，使得人类和机器获得更困难，并且破坏高效的田间维护、培养和收获。此外，分蘖与母本植物(即，衍生分蘖的主茎)竞争附近的资源，从而降低表型评价的准确度和每单位英亩的总体产率。出于这些和其他原因，分蘖通常从研究计划和商业操作等消除。
[0163]
然而，已发现，通过在植物生命周期的特定时间处将玉米植物经受腋芽诱导处理，可能从单株母本植物生成多个分蘖枝，所述分蘖枝产生与同一个枝的雄穗配出良好后代并且当授粉时产生极佳的结实率的穗。因此，这些方法可通过诱导单株玉米植物形成分蘖、允许这些分蘖产生其自己的穗、以及然后从由分蘖中的至少一个产生的穗中的至少一个收获种子来增加回收由单株玉米植物产生的靶标数量的种子的机会。通过将由至少一个分蘖产生的种子与由至少另一个分蘖产生的种子和/或由母本植物产生的种子组合，这些方法可增加从单株植物回收数打、数百个或甚至数千个种子的机会。
[0164]
在某些实施方案中，方法包括诱导dh0植物形成至少一个双单倍体分蘖。这些分蘖中的至少一个生长为进行自交以产生dh1种子的成熟单倍体植物。所述过程可同时和/或依次重复，直至生成靶标数量的种子为止。通过将由至少一个分蘖产生的种子与由至少另一个分蘖产生的种子和/或由dh0母本植物产生的种子组合，这些方法可增加从单株dh0植物回收数打、数百个或甚至数千个种子的机会。
[0165]
与产生dh植物的当前方法不同，这些方法不限于产生包含至少靶标数量的单倍体卵或花粉的穗或雄穗所必需的倍增细胞的单个机会。相反，它们从单株dh0植物产生多个穗和雄穗，从而组合多个倍增机会以产生包含至少靶标数量的单倍体卵和花粉的穗，并且随后进行授粉和受精，产生靶标数量的dh1种子。
[0166]
共优势穗
[0167]
某些实施方案提供用于产生共优势穗。在某些实施方案中，协调共优势穗的发育，使得至少两个共优势穗在与花粉从同一植物的分蘖散落重叠的时间处接受授粉。在某些实施方案中，协调共优势穗的发育，使得至少两个共优势穗在与花粉从另一个所需种质的分蘖散落重叠的时间处接受授粉。
[0168]
某些实施方案包括在植物生命周期的特定时间处将植物经受腋芽诱导处理。可能在单株植物上生成至少两个共优势穗，协调所述共优势穗的发育，使得所述穗配出良好后代并且当授粉时产生极佳的结实率。这些方法可通过诱导单株亲本植物形成全部在重叠时间表中接受授粉的多个共优势穗来增加从所述亲本植物回收靶标数量的后代种子。
[0169]
在某些实施方案中，种子通过在倍增处理之后诱导dh0植物形成至少两个共优势穗来由dh0植物在单代中生成。与产生dh植物的常规方法不同，这些方不依赖于产生包含至少靶标数量的单倍体卵的穗所必需的倍增细胞的仅单个机会。相反，从单株dh0植物产生多个穗，从而组合多个倍增机会以产生至少靶标数量的单倍体配子，并且随后进行授粉和受精例如以产生靶标数量的dh1种子。
[0170]
意料之外的观察对于dh产生具有相当大的影响。一旦dh0植物使用诱导剂进行处理，就不可完全预测dh0植物上的哪个穗将产生最大数量的dh1种子。在一些情况下，第二穗和/或第三穗具有比第一穗更好的结实率。令人意外地，在一些情况下，第一穗得到很少的种子或不得到种子，而第二穗和/或第三穗得到多产的种子。
[0171]
此外，本文所述的代表性结果揭示哪个穗具有最大的倍增潜力是随机的。证明了不可预测沿着枝的哪些腋生分生组织最可能通过染色体倍增处理倍增，甚至在近交品系的紧密相关的成员之间也是如此。
[0172]
在母本植物上形成许多共优势穗、使得存在不足够的资源来完全支持其发育的情况下，穗可单独培养，例如在体外、在单独的盆中、或以本领域已知的任何其他方式培养。
[0173]
在某些实施方案中，共优势穗诱导处理包括向植物施加植物处理剂。在某些实施方案中，所述植物处理剂是植物激素或植物激素的组合。在某些实施方案中，共优势穗诱导处理包括施加赤霉素抑制剂(ga抑制剂)，诸如pbz、烯效唑、矮壮素
‑
cl、助壮素
‑
cl、amo
‑
1618、矮形磷
‑
cl、tetcylacis、嘧啶醇、氟嘧醇、多效唑、烯效唑
‑
p、抗倒胺、调环酸
‑
ca、抗倒酯、丁酰肼、exo
‑
16、17
‑
、或二氢
‑
ga5‑
13乙酸酯或任何植物处理剂的组合，例如与细胞分裂素组合的ga抑制剂。
[0174]
在某些实施方案中，共优势穗在不同的枝上形成。例如，使用者可使用植物处理剂处理主茎(即，母本植物)以致使主茎形成至少一个分蘖。使用者对处理进行计时以便协调分蘖上的穗(即，分蘖穗)和母本植物上的穗的发育，使得两个穗在基本上重叠的时间表中产生穗丝并且接受授粉。在某些实施方案中，使用者处理母本植物形成至少两个分蘖并且对处理进行计时以便协调从不同分蘖生长的至少两个分蘖穗的发育，使得至少两个分蘖穗在基本上重叠的时间表期间产生穗丝，接受授粉。因此，涉及分蘖的方法和涉及共优势穗的方法不是互相排斥的；可能并入两种类型的腋芽形成方法来在某些情况中实现增强的结果。
实施例
[0175]
包括以下实施例以证明本发明的某些实施方案。本领域的技术人员应理解，在下面的实施例中公开的技术表示本发明者发现的在本发明的实践中起较好作用的技术。然而，根据本公开，本领域的技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可在已公开并仍获得类似或相似结果的特定实施方案中做出许多改变。
[0176]
在以下实施例中，单倍体玉米种子通过使用来自单倍体诱导物品系的花粉对包含所需遗传特征的f1或f2雌株进行授粉来获得。当种子成熟时收获穗，然后对穗去皮，并且然后将种子分选为单倍体相对于二倍体。本文所使用的单倍体玉米植物通过使用来自单倍体诱导物品系的花粉对f1或f2玉米植物进行授粉以形成f1杂交体衍生的单倍体诱导群体来获得。当种子成熟时收获穗，去皮，并且通过本领域的标准方法回收单倍体种子。
[0177]
可用于重复以下实验的单倍体诱导物品系的非限制性实例包括stock 6(coe 1959)、rws(rober等人1005)、kems(deimling等人1997)、kms或zms(chalyk等人3994；chalyk和chebotar 1000)、或来源于这些的其他诱导物品系。诱导物品系还可携带至少一种标记物性状以有利于识别单倍体后代。单倍体池的纯度可制为95％或更大，并且可使用本领域已知的各种方法来验证。
[0178]
实施例1.可操纵玉米穗生产力来跨多种不同的种质产生每株植物多个穗。
[0179]
将两种独特的f1杂交体衍生的单倍体玉米品系(来源于：雌性杂种优势组(种质a)或雄性杂种优势组(种质b))的v1
‑
v3幼苗通过在v1
‑
v3生长阶段处从土壤或生长介质取出幼苗并且将其茎对齐并且将其与若干木制棒缠绕成束并且通过铝箔带(大约箔带尺寸是6英寸x18英寸)保持在一起来经受基于大量秋水仙碱的染色体倍增处理。将成束的植物浸没在离心机容器中的含有1250ppm的秋水仙碱的植物处理溶液中，并且然后将整个样品在50g下离心3分钟，同时枝顶端分生组织(sam)保持浸没在植物处理剂溶液中。
[0180]
在第一次离心之后，滗出植物处理溶液并且将幼苗在335g下经受额外的离心3分钟。在第二次离心期间，棒缠绕束支持幼苗并且防止sam接触在施加离心力期间未被植物吸收的保留的处理剂。
[0181]
在第二次离心之后，从离心容器和棒缠绕束取出植物并且使用水冲洗以去除任何残留的秋水仙碱溶液，并且然后回收并且在光、湿度和温度受控的温室中照料若干天，之后移植到苗圃温室。这些基于离心的处理方法更详细地描述于国际申请号pct/us2015/028955中，其以引用的方式整体并入本文，然而，也可将标准倍增处理施加于本文提及的单倍体倍增步骤中的任一个。
[0182]
在秋水仙碱倍增处理之后，在两种不同的密度下将来自每种种质的15
‑
20株植物种植在盆中；如单株植物/盆(单株)或如两株植物/盆(成对)。
[0183]
接下来，每株植物接受两种不同的pbz剂量中的一种，在水中的50ml(低剂量)或60ml(高剂量)的2.5％pbz溶液(v/v；0.4％的活性成分)。这两种不同剂量在v7或v8生长阶段处通过土壤浸液施加，所述v7或v8生长阶段分别在幼苗经受染色体倍增处理之后发生总计23天或26天。植物的对照组不接受处理溶液，但是在其他方面完全如种植为单株的实验组进行处理。当花粉散落在雄穗处开始时，针对每个剂量、种质和处理时间计数产生穗丝的穗(即，共优势穗)的平均数量，并且将结果汇总在表1中。
[0184]
表1.在染色体倍增处理之后、在两个不同的发育阶段中的一个处、在两种不同的pbz剂量中的一个下的处理之后、在两个独特的诱导的单倍体种质(a和b)中每株植物形成的共优势穗的数量。
[0185][0186]
在染色体倍增处理之后发生23天；v8在染色体倍增处理之后
[0187]
发生26天。
[0188]
种质a和种质b的对照植物分别产生1.4ep和1.1ep。
[0189]
这些结果揭示这些方法在不同种植密度中保持可用。当个体在盆中单一地种植时，两种种质均形成更多共优势穗，无论处理时间如何。所有的成对种质b植物比单一种质b植物中的任一个产生更少穗，无论剂量或处理时间如何，并且高剂量v8种质b群体所产生的多于其双对应物的两倍。种质密度对于不同种质的影响的此变化为使用者提供以下认识：可结合这些方法采用的种植密度的最佳范围可在种质与种质之间变化。期待使用者可调整处理时间和其他生长或处理条件来优化使用不同种质的这些方法的用途。
[0190]
这些结果揭示跨剂量、密度和种质的变量，在v7和v8两者处施加的处理一致地比对照针对两种种质均产生更多的共优势穗。因此，这些方法不限于在植物发育的特定点期间施加共优势穗诱导处理。在一个实施方案中，共优势穗诱导处理发生在由使用者选择的提高由使用染色体倍增剂处理的单倍体植物产生的种子数量的时间范围处。
[0191]
所述结果揭示这些方法不限于在特定种质或植物基因型的情况下的用途。此外，两种种质均显示出根据其他变量的不同的提高，所述变量诸如种植密度、处理方案、剂量和其他变量。共优势穗的数量对于两种截然不同的基因型在一系列不同的处理方案上得到提高。预期使用者将在广泛范围的其他种质的情况下使用这些方法并且将能够调整参数，诸如种植密度、穗诱导处理的时间、在穗诱导处理期间所使用的化学品的剂量、以及影响穗发育以使在共优势穗之间配出后代最大化并且提高给定代中产生的种子的数量的其他变量。
[0192]
这些结果揭示这些方法的用途不限于诱导穗形成的特定剂量的化学品。各种不同的穗/植物(ep)提高似乎与剂量相关。一方面，使用高剂量处理的所有植物的平均ep比使用低剂量处理的所有植物的ep高0.31。当仅考虑单株时，此关系甚至更突出(高剂量ep平均值比低剂量高0.55)。此外，经受低剂量的单株仍然产生相对于对照植物的1.2ep的最低增加，从而表明存在甚至在在此测试的范围外的可与这些方法结合使用的剂量效应。
[0193]
实施例2.收获并集中共优势穗的种子改善在单代中回收dh1种子。
[0194]
来源于雌性近交玉米植物种质a的f1杂交体衍生的单倍体诱导群体在土壤中发芽并且在标准温室玉米生长条件中照料大约七天。然后将幼苗经受如以上所述的基于大量秋水仙碱的染色体倍增处理。在处理之后，将幼苗移植到盆中并且在温室中在标准温室玉米生长条件下照料以回收。
[0195]
在秋水仙碱倍增处理之后二十九天，将77株dh0幼苗经受共优势穗诱导处理，包括添加在水中的60ml的2.5％pbz(v/v)，其灌注到每株植物的根部周围的土壤中。然后幼苗在标准温室玉米生长条件中照料，直至它们开花为止，此时产生花粉的每株植物进行自花授粉。在大约3
‑
4周之后，收获穗并且对在处理的dh0植物上形成的谷粒(dh1种子)进行计数以确定倍增效率。
[0196]
根据穗必须产生以便甚至包括在计算中的最小数量，在四种不同的约束下计算倍增效率(de)。de
04
表示当考虑所有穗时产生总计至少四个种子的所有双dh0植物的部分。de
20
表示当考虑所有穗时产生总计至少20个谷粒的所有双dh0植物的部分。相似地，de
30
表示当考虑所有穗时产生总计至少30个谷粒的双dh0植物的部分，并且de
50
表示当考虑所有穗时产生总计至少50个谷粒的双dh0植物的部分。
[0197]
此外，通过仅考虑在每株植物的初生穗(穗1)上形成的谷粒计算以上倍增效率一
次，通过仅考虑在每株植物的初生穗和次生穗(穗2)上形成的谷粒计算以上倍增效率一次，通过仅考虑在每株植物的初生穗、次生穗和第三穗(穗3)上形成的谷粒计算以上倍增效率一次，并且最后通过考虑在每株植物的所有穗(穗
所有
)上形成的所有谷粒计算以上倍增效率。
[0198]
表2.在各种最小谷粒/植物阈值下通过共优势穗诱导产生的倍增效率的比较。下标表示植物必须产生以便被考虑在de计算中的谷粒的最小数量。
[0199][0200]
这些结果揭示无论何时包括共优势穗的谷粒，均获得更大的倍增效率。当施加待包括的穗的最小产率约束时，此关系变得甚至更明显。对于de
20
、de
30
和de
50
，包括由每株植物上的所有穗产生的谷粒在每个情况下使de相对于穗1de大约翻倍。这证明这些方法关于广泛范围的最小产率约束的用途。
[0201]
这些结果揭示这些方法的使用者应经历与本领域当前已知的方法相比的在各种不同的最小产率约束之间的更一致的de。虽然穗1de在de
04
与de
20
之间下降几乎一半(从71％至37％)，包括仅额外一个穗(穗2)引起de
04
与de
20
之间的de的仅22％降低(从76％至59％)。de
04
与de
20
之间的此降低对于穗3和穗
所有
甚至更少。
[0202]
因为de是结有在给定代处从个体植物回收的某一数量的种子的穗的数量因子，这些方法的使用者可期待从给定植物回收更大数量的种子，并且因此比使用本领域现在已知的方法的使用者更可能从任何特定杂交种回收至少最小数量的种子。因此，这些方法的使用者更成功地在单代中从杂交种回收高效地测试此群体以在育种程序中做出准确的改进决定并且更快地将产品引入市场所必需的最小数量的种子。这些方法的使用者还更能够跨不同的最小产率阈值预测de，并且因此更能够预期在来源于至少一个诱导杂交种的群体之间进行资源分配。
[0203]
实施例3.共优势穗的诱导提高多种不同种质的de。
[0204]
在此实验中测试两个f1杂交体衍生的(一个雄性和一个雌性)单倍体群体(本文中称为h1和h2)和两个近交体衍生的单倍体品系(雄性种质b和雌性种质a)。种植之后七天，从土壤取出来自每个组的若干打幼苗，并且经受如以上所述的基于大量秋水仙碱的染色体倍增处理。在染色体倍增处理之后，将幼苗移植到土壤并且在温室中在标准玉米生长条件下照料。当幼苗达到大约v7或v8阶段(在所使用的生长条件下倍增之后大约29天)时，将幼苗经受共优势穗诱导处理，包括向每个茎的基部周围的土壤添加60ml的2.5％pbz。
[0205]
然后幼苗在标准温室玉米生长条件中照料，直至它们开花为止，此时产生花粉的每株植物进行自花授粉并且然后静置以等待受精和谷粒产生。在大约2
‑
3周之后，收获穗并且对在其上形成的谷粒(dh1)进行计数以确定倍增效率。
[0206]
在先前实施例所述的不同约束下计算倍增效率(de)以针对四种基因型中的每个生成de
04
、de
20
、de
30
和de
50
的值。此外，通过仅考虑在每株植物的初生穗(穗1)上形成的谷粒计算以上倍增效率一次，通过仅考虑在每株植物的初生穗和次生穗(穗2)上形成的谷粒计
算以上倍增效率一次，通过仅考虑在每株植物的初生穗、次生穗和第三穗(穗3)上形成的谷粒计算以上倍增效率一次，并且最后通过考虑在每株植物的所有穗(穗
所有
)上形成的所有谷粒计算以上倍增效率。
[0207]
表3.根据仅收获初生穗(穗1)或收获所有穗(穗
所有
)的四种种质的倍增效率。
[0208][0209]
表3揭示这些方法可在广泛种类的种质的情况下使用，包括来自不同杂种优势组的近交品系之间的种质和从来自不同杂种优势组的近交体来源的杂交体之间的种质。它还揭示跨所有种质和最小产率阈值，穗
所有
结果总是优于穗1结果，从而证明这些方法的使用者可期待通过包括由所有额外的共优势穗产生的谷粒来提高de。这些结果表明这些方法适于在玉米的基本上任何基因型或种质的情况下使用。
[0210]
实施例4.共优势穗诱导组合多个腋生分生组织的倍增几率来提高de和结实率。
[0211]
当在实施例3所述的实验中收获dh1穗时，将从每种种质随机选择的四株dh0植物经受进一步的审查，包括记录从每株植物的前3个共优势穗产生的种子的大约数量。图1示出从这四株植物中的每一个收获的前三个穗，并且此图还在以下表4中表示。在表4中，根据穗产生的种子的大约数量，将穗分配到4个类别中的一个：a类穗产生大约50个种子，b类穗产生大约20
‑
49个种子，c类穗产生大约1
‑
20个种子，并且0类穗产生零个种子。两株植物未能产生第三个穗。
[0212]
表4.通过穗产生的dh1种子的数量分类的穗。
“‑“
表示第三个穗未被植物形成的情况。每个植物
‑
种质组合的最高产率的穗以粗体表示以便有利于进行比较。
[0213][0214]
这些结果揭示不同共优势穗具有不同倍增潜力的发现。它还揭示最高产率的穗可能不是第一个穗或甚至第一个穗或第二个穗的令人意外的结果。例如，第二个穗在来自对照a、种质a和种质b种质的植物1上得到最多的种子。对于对照b的植物1和种质a的植物3，第三个穗表现处最大的倍增潜力。
[0215]
此实验还揭示经受共优势穗诱导处理的单倍体植物将更多的资源投入到发育成功地倍增并且能够产生有活力的二倍体后代的穗、无论茎上的穗的相对位置如何的令人意
外的结果。未倍增并且因此不太可能产生种子的单倍体穗的发育似乎停滞。例如，h2种质的植物#2和植物#3上的不产生种子或产生非常少(1
‑
4)种子的穗似乎停滞，而植物清楚地继续将资源投入到发育确实产生种子的穗中。这表明当在dh0植物上生长的诱导的共优势穗的发育停滞时，这是因为穗没有倍增，并且不是因为茎上的穗的位置。因此，从较低苤节生长的诱导的共优势的且成功倍增的穗比未成功倍增的在茎上更高处生长的穗更可能遵循共优势穗所期待的发育方案。
[0216]
实施例5.共优势穗诱导明显地增加二倍体中的种子产生。
[0217]
将玉米近交品系种质a和lh244的种子种植在土壤中、发芽并且然后在大约一周之后移植到10英寸盆，每个盆一株幼苗。在v8阶段处将植物经受共优势穗诱导处理，包括使用50ml的2.5％pbz溶液(v/v；0.4％的活性成分)浸透每株植物的根部周围的土壤。植物在温室中照料，直至性成熟为止，然后它们进行自花授粉。当结种子完成之后，计数每株植物产生的共优势穗的数量和谷粒的总数量。以与处理组相同的方式对每种种质的对照植物进行处理，不同的是对照植物不经受共优势穗诱导处理。
[0218]
表5.从经受共优势穗诱导处理相对于对照处理的两种基因型回收的每株植物的穗的平均数量和每株植物的平均总谷粒。
[0219][0220]
表5揭示可能通过将植物经受共优势穗诱导处理明显地增加从两种不同的近交品系产生的每株植物的平均总谷粒的令人意外的结果。彼此非常不同的两种种质通过使每株植物的平均总谷粒和每株植物的平均穗多于倍增的方式来响应于共优势穗诱导处理。此外，从表5中的处理组记录的所有穗均是共优势的。
[0221]
使用这些方法的处理之后产生8个穗的种质a的代表性实例在图2中示出。
[0222]
虽然对照植物产生多个穗，但是它们产生的不是共优势穗；对照植物上的仅初生穗足以配出良好后代来产生任何种子。
[0223]
实施例6.分蘖诱导明显地增加二倍体中的种子产生。
[0224]
在发芽之后大约一周将共同近交品系的二倍体玉米植物经受分蘖诱导处理，包括使用100ml的2.5％pbz溶液(v/v；0.4％的活性成分)浸透根部周围的土壤，并且然后使其在温室中在10英寸盆中生长至性成熟。对照组的植物在相同的环境下生长，不同的是它们不经受分蘖诱导处理。
[0225]
ga抑制剂引起表达缩短节间的母本植物，并且诱导母本植物产生分蘖。然后根据分蘖形成三个处理组：使“共居”处理的分蘖继续在与母本植物相同的盆中生长；
“‑
母本”处理的那些分蘖也保持在相同的盆中，但是母本植物从盆去除；并且“移植”处理组的那些分蘖从含有母本植物的盆移植到单独的10英寸盆中，每个盆一株植物。使由对照组产生的任何天然存在的分蘖在与母本植物相同的盆中生长，与共居处理相似。使所有植物生长至性成熟并且当穗丝和雄穗形成时进行自花授粉。当结种子完成时，计数由来源于同一母本植物的所有植物产生的种子的平均总数量并且在图3中进行绘制。
[0226]
这些结果揭示可能通过将植物经受分蘖诱导处理来明显地增加每株植物的平均总种子，这通过移植处理组产生多于对照组的两倍数量的种子来证实。它还揭示当分蘖远离母本植物移植时发生种子的最好回收。
[0227]
实施例7.分蘖诱导方法和倍增单倍体植物。
[0228]
将单倍体母本植物经受倍增处理并且之后种植在盆中，根部周围的土壤使用100ml的2.5％多效唑浸透，并入然后在标准玉米温室生长条件中照料若干天。ga抑制剂引起表达缩短的节间和增加的分蘖产生的母本植物。可将所得的子代分蘖植物中的一个与母本植物分离，移植到单独的盆中，并且通过标准温室管理程序生长以最终回收具有正常单倍体形态学的子代植物。此子代植物产生多产的花粉和配出良好后代的稳健的穗，并且当自交时得出若干打dh1种子。
[0229]
预期这些分蘖诱导方法可与dh方法结合使用以明显地增加从给定dh0母本植物回收dh1种子的可能性。预期使用者可诱导dh0植物形成双单倍体分蘖，每个双单倍体分蘖生成与其相应的雄穗配出良好后代的穗以产生数打双单倍体种子。期待可使用这些方法生成获得使用者所需的dh1种子量所必需的那样多的分蘖。
[0230]
实施例8.多芽诱导可与dh方法结合使用以快速生成对于多种性状纯合的植物。
[0231]
对二倍体玉米植物的种子进行表面灭菌(包括使用本领域的方法进行浸渍)并且然后在生长培养基中在体外发芽。在发芽之后两天将所得的幼苗中的一个从其种子切除(胚胎轴法)。然后将切除的轴经受多芽诱导处理，包括转移到含有呈10mg/l bap的形式的细胞分裂素的新鲜多芽诱导培养基。在多芽芽诱导培养基中七天之后，将处理的幼苗转移回到不含激素的再生培养基。
[0232]
在大约二十天之后，可看到诱导的多芽从茎的苤节区域生长。将这些多芽从母本植物切除并且转移到含有iba和iaa的生根培养基。在大约一周之后，将多芽衍生的植物移植到10英寸盆中并且使其在温室中生长，直至每个自主生长的多芽衍生的枝形成配出后代的穗和雄穗是清楚的为止。然后每个穗从在同一盆中生长的雄穗授粉，并且然后使所有植物在温室条件中生长，直至结种子为止。在每个情况下，多芽衍生的植物产生每个结数打种子的穗。
[0233]
此实施例揭示可培养从单株母本植物诱导的多芽以产生配出良好后代的能育的穗和雄穗并且产生极佳的结实率。因此预期这些方法的使用者可使用多芽增加从给定植物回收至少一个种子的可能性。
[0234]
在一个实施方案中，使用者诱导经受染色体倍增的母本单倍体植物进行多芽诱导处理以产生多个双单倍体芽。可培养这些多芽以产生dh种子。
[0235]
在另一个实施方案中，使用者将具有处于杂合状态的至少一种所需性状的二倍体植物经受多芽诱导处理以产生若干二倍体多芽。将这些多芽与母本植物分离并且生长以产生雄穗和穗。接下来，使用者使用母系单倍体诱导物对多芽衍生的二倍体植物进行授粉以生成单倍体后代，所述单倍体后代中的至少一个包含所述性状的所需等位基因。然后可将单倍体后代经受秋水仙碱倍增处理以产生具有处于纯合状态中的所需性状的双单倍体植物。此方法具有明显地增加创造对于多于一种性状是纯合的植物的效率的潜力，因为使用者可诱导从单株母本植物形成许多新花序，从而增加从每株母本植物产生具有处于纯合状态中的所需性状的卵的可能性。一旦生成具有处于纯合状态中的所需性状的单倍体植物，
使用者就将植物经受染色体倍增处理以回收纯合二倍体。
[0236]
实施例9.玉米的单株植物谷粒产率和每株植物的穗的数量的操纵。
[0237]
此实施例描述用于使用施加到玉米植物的根部的化学来操纵玉米的产率的方法。此施加引起诱导每株植物多个分蘖，所述植物在移植并生长至成熟时得出增加数量的具有有活力的种子集的穗和增加的单株植物谷粒收益(产率)。
[0238]
将lh244玉米种子以六个包装单元种植并且使用16小时白昼和8小时夜晚循环和86℉/68℉的温度在标准温室条件下发芽。在发芽之后十天，将总计四十个幼苗移植到八升(l)盆中，并且将所得的植物随机分为两个短行。在发芽之后约十四天(植物处于v3
‑
v4阶段处)，将2.5％(5mg/植物)paczol(活性成分：0.4％多效唑；olympic horticulture)的50ml溶液施加到四十株植物中的三十株至每个盆的基部处的土壤。十株植物(对照组)保持不处理。随后将植物分组为每组十株植物的四个组并且接受不同处理以评估如表6中所述的最高产率潜力。向v3
‑
v4幼苗的根部施加paczol引起产生每株植物若干(1
‑
3)个分蘖。对于第一组10株植物(总体上描述为处理#1)，使主茎和腋生分蘖两者生长并且对主茎和腋生分蘖两者上的所有穗进行授粉，包括主茎与腋生分蘖之间的杂交授粉。在接受处理#2的组中，在paczol施加之后十四天对主茎进行去头处理，并且在主茎不存在的情况下，使腋生分蘖发育并授粉。在接受处理#3的组中，在paczol施加之后三十天取出所有腋生分蘖及其根部并且移植到其自己的单独的盆中。将移植的分蘖放置在湿度罩(humidity dome)中，直至定植为止(大约10
‑
13天)。然后对主茎和分蘖进行授粉。当分蘖产生的花粉不够时，主茎花粉用于对移植的分蘖进行授粉。最后处理由不接受paczol施加的对照组组成。在这种情况下，对所有穗进行授粉，包括分蘖穗(当存在时)。
[0239]
表6.paczol施加之后植物的处理组中每株植物的谷粒数量。
[0240]
[0241]
[0242][0243]
由从主分枝移植腋生分蘖并且独立地对其进行授粉的处理#3引起所产生的最大数量的谷粒。此数据还在图4中示出。
[0244]
实施例10.操纵小麦的营养生长和生殖生长导致收获时与未处理对照相比总叶球数量、种子重量、粒重和总干重质量的增加。
[0245]
此实施例描述用于使用施加到植物的根部的化学来操纵小麦的营养生长和生殖生长的方法。此施加引起诱导每株植物多个分蘖和主分枝的改变的生物质和长度、和腋生分蘖的改变的生物质和长度。
[0246]
将小麦变种samson以六个包装单元种植并且使用16小时白昼和8小时夜晚循环和86℉/68℉的温度在标准温室条件下发芽。在发芽之后十天，将总计三十个幼苗移植到2.7升(l)盆中，并且将所得的植物随机分为两个短行。在发芽之后15天处(小麦幼苗处于v3
‑
v4阶段处)将paczol(活性成分0.4％多效唑，olympic horticulture)的2.5％溶液的一次处理施加到出现的植物的基部处的土壤。在十株植物的组/处理上测试两个处理。还存在未处理对照。第一处理由将所施加的十五毫升(ml)的paczol的2.5％(1.5mg/植物)溶液施加到出现的植物的基部组成。第二处理是施加到出现的植物的基部的30ml的paczol的2.5％(3.0mg/植物)溶液。植物在处理之后四天不浇水。随后对植物进行的手动浇水在必要的基础上发生，其中在浇水之间允许土壤完全干涸。当分蘖变得完全可视或当其最嫩的叶尖如图5中的简图所示超过苞叶的舌叶时认为分蘖出现。在实验结束时，针对分生组织生物质、分生组织长度、分蘖生物质、分蘖数量以及分蘖长度对十株植物/处理进行处理。使十株植物的额外分组达到成熟并且针对总干物质、叶球数量、种子数量和粒重进行评估。分蘖的总数量的结果汇总在表7中。另外，图6提供对通过长度分组的并且在实验结束时(第20天)初生分蘖和次生分蘖的数量的统计分析。图7a
‑
图7d提供对关键生殖性状的分析，诸如叶球数量/植物、种子数量/植物、种子克数/植物以及总干物质/植物，其所有均关于未处理对照显著增加。一般来讲，小麦的paczol处理似乎与未处理对照相比使植物的成熟延迟约五天，具有许多晚出现的分蘖，并且与未处理相比降低处理植物的高度。
[0247]
表7.使用paczol处理的小麦植物的初生分蘖和次生分蘖的数量。
[0248]
[0249][0250]
两个paczol处理分别引起分蘖的47.7％(15ml施加)和31.5％(30ml施加)的平均增加。
[0251]
实施例11.操纵玉米在不同的差别发育阶段处的营养生长和生殖生长导致谷粒数量的增加和处理植物的雄性的提高
[0252]
此实施例示出通过在两个单独的发育阶段处使用化学处理进一步操纵玉米营养生长和生殖生长。此外，此实施例示出使用整株植物袋以有利于自动自交，与人工授粉相对，它是在温室生长玉米中采用的传统方法。
[0253]
玉米幼苗(种质c)使用与实施例1中所述的相同的条件在温室中生长。在移植之后大约14
‑
16天(v3阶段)，使用直接施加到植物基部处的土壤的各自50ml的paczol的2.5％溶液处理二十株玉米幼苗。在移植之后二十八天(v8阶段)，使用100ml的paczol的5％溶液处理额外二十株植物。未处理对照组由十株植物组成，所述十株植物如惯例程序进一步进行人工授粉(穗和雄穗单独套袋并且进行人工授粉)。在v3和v8阶段处接受paczol处理的植物进一步分成两组。每个处理中的一个组进行人工授粉(如在对照组中)。对于每个处理组中的其他植物集，在花粉形成开始时将整株植物袋放置在每株植物上并且使植物自花受精。针对高度、分蘖数量和雄性/雌性发育、腋生分蘖总数量/植物、发育的(主分蘖或腋生分蘖上的)雄穗总数量、花粉散落持续的天数以及最后产生的谷粒的数量监测植物。主要结果汇总在表8中。
[0254]
表8.在v3或v8阶段处使用paczol处理的玉米幼苗中进行的测量
[0255]
[0256][0257]
平均谷粒数量在v3阶段处使用paczol处理的进行人工授粉的植物中增加几乎50％。然而，最显著的是由于具有放置在株冠上的整株植物袋而允许进行自花授粉的那些v3阶段处理的植物的平均谷粒数量增加。这些植物似乎具有更多发育的雄穗以及更多分蘖，并且平均而言使每株植物的谷粒的产率倍增。
[0258]
另外，化学处理的植物似乎具有延伸的花粉散落持续时间。此数据在图8中示出。
[0259]
实施例12.不同玉米种质中的性别、分蘖数量和总产率的操纵
[0260]
以下实施例描述通过使用化学在两个单独的发育阶段(v3和v8)处理十一种不同的玉米近交种质品系。此实施例示出在不同种质中施加化学处理和在人工或套袋授粉之后这些品系的产率结果。
[0261]
将十一种玉米近交种质的种子以六个包装种植并且在如实施例1所概述的标准条件下在温室中生长。在发芽之后十三天，将十一种不同种质的幼苗(20株植物/种质)移植到标准盆中。在发芽之后十五天(v3阶段)，使用2
‑
5％paczol的50ml溶液(4
‑
10mg/植物)处理一部分幼苗，而剩余的幼苗集在v8阶段处(发芽之后二十八天)进行处理。表9示出所使用的不同种质、授粉的类型(人工或通过套袋自动自交)、此实验中处理的植物的比率和数量。
[0262]
表9.种质、处理、使用化学测试十一种种质的植物的比率和数量。
[0263]
[0264]
[0265][0266]
结果汇总在以下表10中。结果还在图10和图11中以图表形式示出。
[0267]
表10.来自主茎的谷粒的平均数量和谷粒总数量(包括分蘖)/植物。
[0268]
[0269]
[0270]
[0271][0272]
化学处理在整个所测试的每种种质中是高度渗透的。平均而言，当植物使用多效唑处理时，观察到约30％
‑
50％的高度降低(图10)。这使得能够进行整株植物套袋并且使穗丝与雄穗之间更靠近。此外，多种不同的种质在v3(14dap)或v8(28dap)阶段处的化学处理导致每株植物谷粒数量的平均增加(图11)。
[0273]
实施例13.使用不同三唑化学操纵玉米谷粒产率
[0274]
以下实施例描述使用施加到发育幼苗的根部的一个比率的sumagic(活性成分0.055％烯效唑；valent usa)化学操纵玉米植物。
[0275]
将玉米幼苗以如实施例1所述的六个包装种植并且在v3阶段处(发芽之后大约14天)使用0.5％sumagic的400ml溶液进行处理。将六个包装直接浸透在含有待施加的化学的斗式壳体(bucket enclosure)中。施加之后大约十二天，将第一分蘖集从母本植物移植。总计有八株植物并且每个主茎移植四个分蘖。移植总计三十六个分蘖。移植的分蘖定植(v7阶段)之后，使用0.5％sumagic对其进行额外一次处理。然后在其整个生长周期中监测植物。使用人工授粉的标准方法在同一植物上的雄穗与穗之间进行授粉。在一些情况下，植物进
行自由授粉。在实验完成时，对谷粒数量/植物(主茎或“母本”和取出的组合四个分蘖/母本植物)进行计数。图9a
‑
图9b示出平均而言，主茎加上通过使用三唑化学诱导产生的分蘖的组合可得出1700
‑
2000之间个谷粒/玉米系谱的结果。
[0276]
实施例14.使用植物生长调节剂多效唑操纵双单倍体群体中的谷粒/植物。
[0277]
使用单倍体倍增剂秋水仙碱处理并且在发芽之后总计七天，将双单倍体幼苗种植到土壤中一天。在种子吸胀之后大约37天(大约v11阶段)使用paczol(等同于0.4％活性成分多效唑的60ml中的2.5％)处理四种不同种质的植物以形成多个共优势穗。对所有的植物连续两天进行人工授粉。在每株植物的两个单独的穗上对具有共优势穗的植物进行人工授粉(初生穗和次生穗均在主茎上)。在实验完成时确定总谷粒数量/植物。以下表11示出每个种质群体中未处理植物和处理植物的结果。
[0278]
表11.双单倍体种质群体的paczol处理。
[0279][0280][0281]
在使用paczol处理之后谷粒数量/植物几乎倍增。参见图13和图14。
[0282]
已经说明并描述这些方法的原理，对于本领域的技术人员应显而易见的是，所述方法可在不背离此类原理的情况下在布置和细节方面进行修改。因为可在不脱离本发明的范围的情况下在本文描述并说明的构造方面进行各种修改，所以意图在前述描述中包括的或在附图中所示的所有内容都应被解释为说明性的而非限制性的。
[0283]
虽然本文所公开的材料和方法关于各种实施方案和说明性实施例描述，但是对于本领域的技术人员将显而易见的是，可在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下对本文所述的材料和方法应用变型。对本领域技术人员显而易见的所有此类相似的替代和修改被认为在如由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。
[0284]
本公开的广度和范围不应受任何上述示例性实施方案限制，而应仅根据以下权利要求书及其等效物限定。