白介素-4受体结合融合蛋白及其应用的制作方法

白介素
‑
4受体结合融合蛋白及其应用
1.本专利申请是申请号为201480062148.6(国际申请号为 pct/ca2014/050916)、申请人为“梅迪塞纳医疗股份有限公司”和“由国务 卿代表的美国卫生与公众服务部、发明名称为“白介素
‑
4受体结合融合蛋白 及其应用”的专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及白介素
‑
4受体结合融合蛋白。更具体地说，本发明部分地提 供了包含结合至抗凋亡bcl
‑
2家族成员蛋白部分的白介素
‑
4或者白介素
‑
13 蛋白部分的融合蛋白。


背景技术：

3.白介素
‑
4(il
‑
4)是由激活t细胞产生的多效性细胞因子，并且是所述 il
‑
4受体(il
‑
4r)的配体，其还可以结合至白介素
‑
13(il
‑
13)。和很多细 胞因子一样，白介素
‑
4首先接合至高度亲和性受体链(称为“α”)，然后il
‑4‑
α 链复合物与第二低亲和力受体链(称为“γc”)结合。因此，il
‑
4的初次结合 链是il
‑
4受体α(il
‑
4rα)，其以高亲和力(k
d
＝～10
‑
10
m)结合。所述 il
‑
4/il
‑
4rα复合物然后能够以相对较低的亲和力结合il
‑
4受体的第二组分， γc(i型受体)。另外，il
‑
4/il
‑
4rα复合物还能够结合白介素
‑
13(il
‑
13)受 体α1(il
‑
13r α1)(ii型受体)。
4.不同的细胞类型表达不同量的i型和ii型受体链。例如，il
‑
4rα存在于 大多数细胞上，而γc一般在造血细胞上表达，并且il
‑
13r αl一般在非造血 细胞上表达。因此，在t细胞、自然杀伤(nk)细胞、嗜碱性细胞、肥大 细胞以及大多数的小鼠b细胞(大多数人类b细胞表达γc和il
‑
13r α1两 者)上见到的是γc而不是il
‑
13r αl。
5.一些骨髓源性细胞，包括巨噬细胞和树突状细胞，表达γc和il
‑
13r α1 两者，并因此响应il
‑
4和il
‑
13两者。在大多数非骨髓源性细胞包括平滑肌 细胞和表皮细胞上见到il
‑
13r α1，但是几乎没有或者没有见到γc。
6.已经提出过对i型和ii型受体具有不同选择性的变体型il
‑
4分子 (junttila等nature chemical biology 8：990
‑
998，2012.)。
7.环状排列(circularly permuted)的分子是线性分子(例如配体)的末端 已经直接或者经由接头连接在一起从而产生环状分子的那些分子，此后所述 环状分子在另一个位置打开从而产生新的带有不同于原先分子的末端的末 端的线性分子。il
‑
4的环状排列变体已经在例如于2000年1月4日授权给 pastan等的美国专利no.6,011,002中有描述。
8.程序化细胞死亡或者“凋亡”是一种在动物细胞发育中常见的现象，并且 受到主动调节和被动调节这两者调节。除了其参与神经元和淋巴样系统发育 和整个细胞群稳态之外，凋亡还在由凋亡途径的异常调节引起的各种疾病和 损伤中发挥重要的作用。例如，由凋亡引起的神经元细胞死亡的异常激活应 参与了很多神经退行性疾病和症状，例如阿尔茨海默氏症(barinaga，science 281：1303
‑
1304)、亨廷顿氏舞蹈症、脊髓性肌肉萎缩症、中风过程中导致 的神经元破坏(在rubin，british med.bulle.，53(3)：617
‑
631，1997中有 综述；以及barinaga，science 281：1302
‑
1303)、暂时性缺血性神经元损伤 (例如，脊髓损
伤)等。相反，凋亡的异常抑制能够导致细胞的过度增殖， 从而导致癌症和其他类型的过度增殖性紊乱。
9.凋亡受到很多蛋白的调节，这些蛋白包括bcl
‑
2家族的成员。bcl
‑
2是被 鉴定为调节凋亡的第一批蛋白之一(cleary等，cell 47：19
‑
28，1986；tsujimoto 和croce，proc.natl.acad.sci.usa 83：5214
‑
5218，1986)。由于它的发现， 已经有若干个bcl
‑
2相关蛋白(“bcl
‑
2家族蛋白”或者“bcl
‑
2家族成员”) 被鉴定为凋亡的调节因子(white，genes dev.10：1
‑
15，1996；yang等， 细胞80：285
‑
291，1995)。
10.已经探索了用于治疗神经退行性疾病、癌症等的若干种治疗性试剂，但 是这些治疗性试剂表现出限制了它们在临床中的应用的多种局限性。例如， 很多化学治疗性试剂通过诱导正在增殖的赘生性细胞中的凋亡来发挥作用， 但是它们的治疗价值受到它们对正常细胞具有毒性的程度的限制。使用标准 凋亡抑制性分子例如肽类半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspases)抑制剂(例 如devd类)进行的治疗已经证明由于这些抑制剂具有低的膜渗透性而无法 满意地用于临床工作。
11.已经提出靶向免疫毒素(在有毒分子例如细菌毒素和通常衍生自抗体分 子的靶向域之间的遗传融合或者生物化学融合)以尝试选择性地消除癌症分 子。例如，已经生成白喉毒素(dt)变体并且测试了它们选择性地杀灭癌 症细胞的能力(thorpe等，nature 271：752
‑
755，1978；laske等，naturemedicine 3：1362
‑
1368，1997)。类似地，已经研究了假单胞菌(pseudomonas) 外毒素(pe)融合蛋白作为潜在的癌症疗法(kreitman和pastan，blood 90： 252
‑
259，1997；shimamura等cancer res.67：9903
‑
9912；2007)。已经测 试了dt
‑
bclxl融合蛋白在各种细胞类型中阻断由星形孢菌素、γ射线辐射和 脊髓灰质炎病毒诱导的凋亡的能力(youle等，proc natl acad sci. 96:9563
‑
9567)。粒细胞
‑
巨噬细胞菌落刺激因子bclxl(gm
‑
csf
‑
bclxl)融 合蛋白已经显示出增强人类单核细胞增殖并保护细胞以防细胞被诱导死亡 (youle等，jbc 282(15):11246
‑
11254)。


技术实现要素：

12.本发明涉及白介素
‑
4融合蛋白。更具体地说，本发明部分地提供了包含 结合至抗凋亡bcl
‑
2家族成员蛋白部分的白介素
‑
4受体结合蛋白部分例如白 介素
‑
4或者白介素
‑
13的融合蛋白及其应用。
13.在一个方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含白介素
‑
4 (il
‑
4)受体结合蛋白和bcl
‑
2家族多肽。
14.在一些实施方式中，所述il
‑
4受体结合蛋白可以是环状排列的(cp)。
15.在一些实施方式中，所述bcl
‑
2家族多肽可以是抗凋亡bcl
‑
2家族多肽 (例如bcl
‑
x
l
、bcl
‑
w或者bcl
‑
2)。所述融合蛋白可能能够促使表达il
‑
4r 的靶细胞的细胞成熟、促进细胞存活、抑制细胞死亡或者凋亡，保护细胞以 防细胞死亡、或者增加细胞活化作用。
16.在一些实施方式中，所述il
‑
4受体结合蛋白可以是对与i型或ii型il
‑
4 受体(il
‑
4r)的结合具有选择性的突变型il
‑
4或者il
‑
13。对与ii型il
‑
4r 的结合具有选择性的所述突变型il
‑
4可以包括kfr变体或者kf变体。对 与i型il
‑
4r的结合具有选择性的所述突变型il
‑
4可以包括rga变体。突 变型il
‑
13可以是a11变体或者dn变体。
17.在一些实施方式中，所述融合蛋白可以进一步包含接头。所述接头可以 具有序列
gs或者是泛素或者泛素变体分子。
18.在一些方面，提供了编码本文所述的融合蛋白的核酸分子、或者包含所 述核酸分子的载体、或者包含所述载体的宿主细胞。
19.在一些方面，提供了包含本文所述的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核 酸分子、或者包含所述核酸分子的载体、或者包含所述载体的宿主细胞的药 物组合物。
20.在一些方面，提供了一种刺激细胞增殖、促进细胞存活、抑制细胞死亡 或者凋亡，保护细胞以防细胞死亡、增加细胞活化作用或者促使细胞成熟的 方法，所述方法通过如下方式来进行：向需要的受试者施用包含抗凋亡bcl
‑
2 家族多肽的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的 载体、或者包含所述载体的宿主细胞。
21.在一些方面，提供了一种刺激细胞增殖、促进细胞存活、抑制细胞死亡 或者凋亡，保护细胞以防细胞死亡、增加细胞活化作用或者促使细胞成熟的 方法，所述方法通过如下方式来进行：使表达il
‑
4r的靶细胞与包含抗凋亡 bcl
‑
2家族多肽的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、或者包含所述 核酸分子的载体接触。
22.在一些方面，提供了一种增强免疫应答的方法，所述方法通过如下方式 来进行：向需要的受试者施用包含抗凋亡bcl
‑
2家族多肽的融合蛋白、编码 所述融合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、或者包含所述载体的 宿主细胞。
23.在一些方面，提供了一种增强免疫应答的方法，所述方法通过如下方式 来进行：使表达il
‑
4r的靶细胞与包含抗凋亡bcl
‑
2家族多肽的融合蛋白、 编码所述融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分子的载体接触。
24.在一些方面，提供了一种治疗神经紊乱或者病症或者自身免疫性紊乱的 方法，所述方法通过如下方式来进行：向需要的受试者施用包含抗凋亡bcl
‑
2 家族多肽的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的 载体、或者包含所述载体的宿主细胞。
25.在一些方面，提供了一种治疗神经紊乱或者病症的方法，所述方法通过 如下方式来进行：使表达il
‑
4r的神经元细胞或者干细胞与包含抗凋亡bcl
‑
2 家族多肽的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分 子的载体接触。
26.在一些方面，提供了一种包含融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含抗 凋亡bcl
‑
2家族多肽的融合蛋白，并且所述组合物进一步包含gm
‑
csf
‑
bcl
‑
x
l
融合蛋白。
27.在一些方面，提供了一种通过进一步施用gm
‑
csf
‑
bcl
‑
x
l
融合蛋白或者 使细胞与gm
‑
csf
‑
bcl
‑
x
l
融合蛋白接触来刺激细胞增殖的方法。
28.在一些方面，提供了包含抗凋亡bcl
‑
2家族多肽的融合蛋白、编码所述 融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分子的载体用于治疗需要的受试者 中的神经紊乱或者自身免疫性紊乱、刺激细胞增殖、或者增强细胞免疫应答 的应用。
29.在另外可选的方面的各个实施方式中，所述受试者可以是人类。
30.在一些方面，提供了一种繁殖或者扩大培养用于在过继性细胞转移疗法 或者嵌合抗原受体(car)疗法中使用的经改造的t细胞的方法，所述方法 通过如下方式进行：使所述经改造的t细胞与包含抗凋亡bcl
‑
2家族多肽的 融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分子的载体接 触。
31.本发明内容部分不一定描述本发明的所有特征。
附图说明
32.根据下文的其中参考附图的说明可以使本发明的这些和其他特征更加 清楚，其中：
33.图1是显示cpil
‑4‑
ub
‑
bclxl或者rhil
‑
4在使用gsno损伤(insult)之 后对神经细胞(sh
‑
sy5y)存活的影响的柱状图。
34.图2是显示了cpil
‑4‑
ub
‑
bclxl或者rhil
‑
4在使用sts损伤之后对神经 细胞(sh
‑
sy5y)存活的影响的柱状图。
35.图3a
‑
e是显示gm
‑
csf
‑
bcl
‑
xl和cpil
‑4‑
bcl
‑
xl对人类树突状细胞衍 生(derivation)的影响的图。
36.图4a
‑
d显示了cpil4
‑
bclxl(a
‑
b)和cpil4
‑
ub
‑
bclxl(c
‑
d)融合构 建体的核酸序列(seq id no:30和31)和氨基酸序列(seq id no:18和 20)。
具体实施方式
37.本发明部分地提供了包含结合至抗凋亡bcl
‑
2家族蛋白的il
‑
4r结合蛋 白的融合蛋白及其应用。
38.il
‑
4r结合蛋白
39.il
‑
4r结合蛋白包括il
‑
4和il
‑
13。
40.il
‑
4蛋白或者il
‑
4“蛋白部分”包括天然的il
‑
4蛋白以及变体型il
‑
4 蛋白。本文使用的“天然的”或“野生型”il
‑
4序列是指人类il
‑
4序列， 不管是从天然来源纯化还是使用重组技术制得，并且包含如下氨基酸序列 (在n末端带有额外的甲硫氨酸)：
[0041][0042]
另外可选的人类il
‑
4序列包含如下氨基酸序列(在n末端带有额外的 甲硫氨酸)：
[0043][0044]
在一些实施方式中，可以在本公开内容的所述融合蛋白中使用的il
‑
4 蛋白是变体型il
‑
4蛋白，该变体型il
‑
4蛋白对γc(i型受体)具有比对il
‑
13r αl(ii型受体)的选择性高的选择性，或者反之亦然，例如在junttila等(naturechemical biology 8：990
‑
998，2012)中所述。在一些实施方式中，对γc(i 型受体)具有高的选择性的变体型il
‑
4蛋白是相对于天然人类il
‑
4(例如 seq id no：1)的序列或者另外可选的il
‑
4序列(例如，seq id no：2) 而言包含如下突变的il
‑
4蛋白(编号排除了在n末端的甲硫氨酸)： r121q/y124w/s125f(“rga”或者“super
‑
4”或者“s4”变体)，如在例 如junttila等(nature chemical biology 8：990
‑
998，2012)中所述。
[0045]
在一些实施方式中，对il
‑
13rα1(ii型受体)具有高的选择性的变体 型il
‑
4蛋白是相对于天然人类il
‑
4(例如，seq id no：1)或者另外可选 的il
‑
4序列(例如，seq id no：2)而言包含如下突变的il
‑
4蛋白(编号 排除了在n末端的甲硫氨酸)：r121k/y124f/s125r(“kfr”或者“kfr4
”ꢀ
变体)或者r121k/y124f(“kf”变体)。
[0046]
在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的il
‑
4蛋白是环状排列的(circularlypermuted，cp)，如在例如在2000年1月4日授予pastan等的美国专利no.6,011,002中所述。在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的cpil
‑
4蛋白包括其中使用ggngg接头和起始的甲硫氨酸残基将另外可选的il
‑
4序列(例如，seqidno：2)或者天然人类il
‑
4(例如，seqidno：1)的残基38
‑
129结合至残基1
‑
37的如下il
‑
4蛋白(编号排除了在n末端的甲硫氨酸)：
[0047][0048]
在一些另外可选的实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的cpil
‑
4蛋白包括其中在“rga”或者“super
‑
4”或者“s4”变体的情况中使用ggngg接头和起始的甲硫氨酸残基将另外可选的il
‑
4序列(例如，seqidn0：2)或者天然人类il
‑
4(例如，seqidno：1)的残基38
‑
129结合至残基1
‑
37的如下il
‑
4蛋白(编号排除了在n末端的甲硫氨酸)：
[0049][0050]
在一些另外可选的实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的cpil
‑
4蛋白包括其中在“kfr”变体的情况中使用ggngg接头和起始的甲硫氨酸残基将另外可选的il
‑
4序列(例如，seqidn0：2)或者天然人类il
‑
4(例如，seqidno：1)的残基38
‑
129结合至残基1
‑
37的如下il
‑
4蛋白(编号排除了在n末端的甲硫氨酸)：
[0051][0052]
在一些另外可选的实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的cpil
‑
4蛋白包括其中在“kf”变体的情况下使用ggngg接头和起始的甲硫氨酸残基将另外可选的il
‑
4序列(例如，seqidn0：2)或者天然人类il
‑
4(例如，seqidno：1)的残基38
‑
129结合至残基1
‑
37的如下il
‑
4蛋白(编号排除了在n末端的甲硫氨酸)：
[0053][0054]
在一些另外可选的实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的cpil
‑
4蛋白包括其中使用ggngg接头和起始的甲硫氨酸残基将另外可选的il
‑
4序列(例如，seqidn0：2)或者天然人类il
‑
4(例如，seqidno：1)的残基105
‑
129结合至残基1
‑
104的il
‑
4蛋白(编号排除了在n末端的甲硫氨酸)，如在例如在2000年1月4日授予pastan等的美国专利no.6,011,002中所述。
[0055]
能够在本公开内容的融合蛋白中使用的例示性il
‑
4蛋白包括本文所述的那些il
‑
4蛋白，以及与天然的il
‑
4具有至少80％的序列同一性、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或者甚至是至少99％的序列同一性的序列(“变体型il
‑
4蛋白”)，只要所
述变体型il
‑
4蛋白保持结合il
‑
4受体的能 力，或者保持对γc(i型受体)比对il
‑
13rαl(ii型受体)高的选择性，或 者反之亦然，例如在junttila等(nature chemical biology 8：990
‑
998，2012) 中所述。
[0056]
应当理解的是，根据本公开内容的il
‑
4蛋白包括可以比天然的129个氨 基酸的il
‑
4蛋白短的片段，只要il
‑
4蛋白片段保持结合il
‑
4受体的能力， 或者保持对γc(i型受体)比对il
‑
13rαl(ii型受体)高的选择性，或者反 之亦然，例如在junttila等(nature chemical biology 8：990
‑
998，2012)中 所述，或者保持所期望的生物学活性，不管是作为天然序列的片段还是为其 cp形式或者片段。
[0057]
还应当理解的是，本公开内容涵盖编码本文所述的或者本领域已知的 il
‑
4蛋白的核酸分子，包括但不限于与本文所述的dna序列对应的rna 序列。
[0058]
例示性的il
‑
4核酸分子包括：
[0059]059]
和
[0060][0061]
il
‑
13蛋白或者il
‑
13“蛋白部分”包括天然的il
‑
13蛋白以及变体型il
‑
13蛋白。本文使用的“天然的”或者“野生型”il
‑
13序列是指人类il
‑
13序列，不管是从天然来源纯化还是使用重组技术制得，并且包含如下氨基酸序列(在n末端带有额外的甲硫氨酸)：
[0062][0063]
在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的il
‑
13蛋白是对il
‑
13rαl(ii型受体)比对野生型il
‑
13蛋白具有更高的选择性的变体型il
‑
13蛋白。例如il
‑
13变体序列可以包含如下氨基酸序列(在n末端带有额外的甲硫氨酸)：
[0064]064]
(所述“a11”变体；seqidno：8)。
[0065]
在一些实施方式中，对il
‑
13rαl(ii型受体)比对野生型il
‑
13蛋白具有更高的选择性的变体型il
‑
13蛋白是相对于天然人类il
‑
13的序列(seqidno：7)包含如下突变的il
‑
13蛋白(编号排除了在n末端的甲硫氨酸)：l10v/e12a/v18i/r65d/d87s/t88s/l101f/k104r/k105t(“dn”变体)。例如，il
‑
13变体序列可以包含如下氨基酸序列(在n末端带有额外的甲硫氨酸)：
[0066][0067]
在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的il
‑
13蛋白是环状排列的(cp)。在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的cpil
‑
13蛋白包括其中使用接头和起始的甲硫氨酸残基将天然人类il
‑
13(seqidno：7)的残基44
‑
114结合至残基1
‑
43的如下il
‑
13蛋白：
[0068][0069]
在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的变体型cpil
‑
13蛋白如下：
[0070][0071]
在一些代替性的实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的 cpil
‑
13蛋白包括在“a11”变体的情况中使用接头和起始的甲硫氨酸残基将 天然人类il
‑
13(seq id no：7)的残基44
‑
114结合至残基1
‑
43的如下il
‑
13 蛋白：
[0072][0073]
在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的变体型 cpil
‑
13蛋白如下：
[0074][0075]
在一些代替性的实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的 cpil
‑
13蛋白包括在“dn”变体的情况中使用接头和起始的甲硫氨酸残基将天 然人类il
‑
13(seq id no：7)的残基44
‑
114结合至残基1
‑
43的如下il
‑
13 蛋白：
[0076][0077]
在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的变体型 cpil
‑
13蛋白如下：
[0078][0079]
能够在本公开内容的融合蛋白中使用的例示性il
‑
13蛋白包括本文所述 的那些il
‑
13蛋白，以及与天然的il
‑
13具有至少80％的序列同一性、至少 85％、至少90％、至少95％、至少98％、或者甚至是至少99％的序列同一性 的序列(“变体型il
‑
13蛋白”)，只要所述变体型il
‑
13蛋白保持结合il
‑
13 受体的能力，或者保持对il
‑
13rαl(ii型受体)比对野生型il
‑
13蛋白具有 更高的选择性，或者保持所期望的生物学活性。
[0080]
应当理解的是，根据本公开内容的il
‑
13蛋白包括可以比天然的114个 氨基酸的il
‑
13蛋白短的片段，只要il
‑
13蛋白片段保持结合il
‑
13受体的 能力，或者保持对il
‑
13rαl(ii型受体)比对野生型il
‑
13蛋白具有更高的 选择性，或者保持所期望的生物学活性。
[0081]
还应当理解的是，本公开内容涵盖编码本文所述的或者本领域已知的 il
‑
13蛋白的核酸分子(包括但不限于rna序列或者dna序列)。
[0082]
bcl
‑
2家族蛋白
[0083]
bcl
‑
2相关蛋白或者多肽((“bcl
‑
2家族蛋白”或者“bcl
‑
2家族成员”) 参与凋亡的调节。bcl
‑
2家族蛋白分为两个明显不同的类别：抑制细胞死亡 的那些bcl
‑
2家族蛋白(“抗
凋亡”bcl
‑
2家族蛋白)和促进细胞死亡的那些 bcl
‑
2家族蛋白(“促凋亡”bcl
‑
2家族蛋白)。bcl
‑
2家族蛋白共同具有1至4 个保守的bcl
‑
2同源(bh)域，它们称为bh1、bh2、bh3和bh4。
[0084]
抗凋亡bcl
‑
2家族蛋白包括bcl
‑
2本身、bcl
‑
x
l
(boise等，cell 74:597
‑
608， 1993；例如genbank登录号no.q07817；genbank登录号no.z23115)、bcl
‑
w 等。在一些实施方式中，能够在根据本公开内容的融合蛋白中使用的bcl
‑
x
l
蛋白包含如下序列：
[0085][0086]
在一些实施方式中，抗凋亡bcl
‑
2家族蛋白包括至少bcl
‑
2家族成员的 片段，其中，所述抗凋亡bcl
‑
2家族蛋白或者片段能够促进细胞存活、促进 细胞增殖或者抑制细胞死亡或者凋亡。“促进细胞存活”是指增加(例如， 至少10％、20％、30％、或者多达50％、75％、85％或者90％或者更多)的 具有细胞死亡风险的细胞将存活的可能性。“促进细胞增殖”是指增加(例 如，至少10％、20％、30％、或者高达50％、75％、85％或者90％或者更多) 的细胞的生长或者增殖。“抑制细胞死亡或者凋亡”是指降低(例如，至少 10％、20％、30％、或者高达50％、75％、85％或者90％或者更多)的具有 细胞死亡风险的细胞将经历凋亡、坏死或者其他任何形式的细胞死亡的可能 性。用于测量细胞存活的促进作用、细胞增殖的促进作用、或者细胞死亡或 者凋亡的抑制作用的适当的分析法在本文中有描述或者在本领域中是已知 的。
[0087]
还应当理解的是，本公开内容涵盖编码编码本文所述或者本领域已知的 抗凋亡bcl
‑
2家族成员蛋白或者其片段的核酸分子。
[0088]
例示性的抗凋亡bcl
‑
2家族成员的核酸分子包括：
[0089][0089]
(变体型 bclxl；seq id no：29)。
[0090]
il
‑
4受体结合蛋白/抗凋亡bcl
‑
2家族融合蛋白
[0091]
根本本公开内容的“融合蛋白”包括利用可选的额外的序列或者部分(例 如接头)结合至抗凋亡bcl
‑
2家族成员的il
‑
4r结合蛋白，例如il
‑
4和il
‑
13， 如本文所述，以及编码
这些融合蛋白的核酸分子。还涵盖的是其中编码融合 蛋白的核酸序列被可操作地连接至启动子的重组核酸分子、包含所述分子的 载体、和包含这种分子的转基因细胞。
[0092]
il
‑
4(包括cpil
‑
4和il
‑
4片段和变体)可以被连接至抗凋亡bcl
‑
2家族 多肽，例如bcl
‑
2、bcl
‑
x
l
或者bcl
‑
w，或者它们的片段或者变体，只要所得 的融合蛋白保持抗凋亡活性。
[0093]
可以使用任何形式的il
‑
4或者其衍生物。例如，可以使用结合至il
‑
4 受体的il
‑
4或者il
‑
4的片段。另外，多个抗凋亡bcl
‑
2家族蛋白或者其片段 或者变体可以被结合至il
‑
4蛋白或者其片段或者变体，或者可以将多个il
‑
4 蛋白或者其片段或者变体结合至抗凋亡bcl
‑
2家族蛋白或者其片段或者变 体，或者可以将多个抗凋亡bcl
‑
2家族蛋白或者其片段或者变体结合至多个 il
‑
4蛋白或者其片段或者变体。
[0094]
il
‑
13(包括il
‑
13片段或者变体)可以被连接至抗凋亡bcl
‑
2家族多肽， 例如bcl
‑
2、bcl
‑
x
l
或者bcl
‑
w、或者它们的片段或者变体，只要所得的融合 蛋白保持抗凋亡活性。可以使用任何形式的il
‑
13或者其衍生物。例如，可 以使用结合至il
‑
13受体的il
‑
13或者il
‑
13的片段。多个抗凋亡bcl
‑
2家族 蛋白或者其片段或者变体可以被结合至il
‑
13或者其片段或者变体，或者可 以将多个il
‑
13蛋白或者其片段或者变体结合至抗凋亡bcl
‑
2家族蛋白或者 其片段或者变体。
[0095]
cpil
‑
4可以被连接至抗凋亡bcl
‑
2家族多肽，例如bcl
‑
2、bcl
‑
x
l
或者 bcl
‑
w，只要所述融合蛋白保持抗凋亡活性，如本文讨论或者本领域已知的 那样。可以使用任何形式的cpil
‑
4或者其衍生物。另外，可以将多个cpil
‑
4 蛋白结合至抗凋亡bcl
‑
2家族蛋白，或者可以将多个抗凋亡bcl
‑
2家族蛋白 结合至cpil
‑
4蛋白，或者可以将多个cpil
‑
4蛋白结合至多个抗凋亡bcl
‑
2家 族蛋白。
[0096]
例示性的融合蛋白在表1中列出。
[0097]
表1.il
‑
4/bcl
‑
2家族融合蛋白
[0098]
[0099]
[0100]
[0101]
[0102][0103]
il
‑
4r结合蛋白例如il
‑
4或者il
‑
13与抗凋亡bcl
‑
2家族成员的结合或 者“融合”可以是直接的，使得il
‑
4r结合蛋白的一个部分直接连接至抗凋 亡bcl
‑
2家族成员的一部分。例如，il
‑
4r结合蛋白的氨基酸序列的一个末 端可以直接结合至抗凋亡bcl
‑
2家族成员的氨基酸序列的一个末端。例如， il
‑
4r结合蛋白的c末端可以连接至抗凋亡bcl
‑
2家族成员的n末端，或者 抗凋亡bcl
‑
2家族成员的c末端可以连接至il
‑
4r结合蛋白的n末端。生成 这些融合蛋白的方法是本领域中的常规方法，例如使用重组分子生物学方 法。
[0104]
接头
[0105]
在一些实施方式中，可以直接通过接头将il
‑
4r结合蛋白部分连接至抗 凋亡bcl
‑
2家族成员部分。所述接头可以例如简单地用作将所述两个部分连 接的常规方式、作为将所述两个部分在空间上间隔开的方式，从而为il
‑
4r 结合蛋白或者抗凋亡bcl
‑
2家族成员或者它们的组合提供额外的功能。
[0106]
一般来说，将il
‑
4r结合蛋白部分和抗凋亡bcl
‑
2家族成员部分连接的 接头可以被设计成用于：(1)允许所述两个分子折叠并且独立于彼此发挥作 用；(2)不具有形成可能干扰这两个部分的功能的有序二级结构的倾向性； (3)具有最小的可能与功能性蛋白域相
互作用的疏水性或者带电荷特性； 和/或(4)提供两个区域的空间分离。例如，在一些情况中，可能希望将il
‑
4r 结合蛋白与抗凋亡bcl
‑
2家族成员在空间上间隔开以防止il
‑
4r结合蛋白干 扰抗凋亡bcl
‑
2家族成员的活性和/或防止抗凋亡bcl
‑
2家族成员干扰il
‑
4r 结合蛋白的活性。还可以使用接头来为抗凋亡bcl
‑
2家族成员和il
‑
4r结合 蛋白之间的连接部分提供了不稳定性、酶切位点(例如蛋白酶的酶切位点)、 稳定性序列、分子标签、可检测标签、或者它们的各种组合。在一些实施方 式中，可以在il
‑
4r结合蛋白(例如在cp分子中)或者抗凋亡bcl
‑
2家族成 员的两个域之间提供接头。
[0107]
所述接头可以具有双功能或者多功能，即，含有至少约第一反应官能团 和第二反应官能团，所述第一反应官能团位于所述接头的第一末端处或者位 于所述接头的第一末端的附近，能够结合至所述il
‑
4r结合蛋白或者被修饰 成结合至所述il
‑
4r结合蛋白，所述第二反应官能团位于所述接头的相反末 端处或者位于所述接头的相反末端的附近，能够结合至被修饰的所述抗凋亡 bcl
‑
2家族成员或者被修饰成结合至被修饰的所述抗凋亡bcl
‑
2家族成员。两 个或者两个以上的所述官能团可以相同(即，所述接头具有同源双功能)或 者它们可以不同(即，所述接头具有异源双官能)。
[0108]
所述接头的长度和组成可以有相当大的变化。所述接头的长度和组成一 般基于所述接头的目标功能以及可选的其他因素例如合成的容易度、稳定 性、耐受某些化学品的耐受性和/或温度参数以及生物相容性等考虑进行选 择。例如，所述接头不应当对il
‑
4r结合蛋白和/或抗凋亡bcl
‑
2家族成员的 活性造成显著的干扰。
[0109]
适合于在根据本公开内容的融合蛋白中使用的接头包括肽。可以使用重 组dna技术将所述接头结合至il
‑
4r结合蛋白部分和/或抗凋亡bcl
‑
2家族 成员部分。这些方法在本领域中是已知的，并且这种技术的细节可以在例如 sambrook等，molecular cloning：a laboratory manual.第二版，cold springharbor laboratory，cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor， n.y.，1989或者ausubel等，current protocols in molecular biology，john wiley &sons，1994)或者其升级版中找到。
[0110]
所述接头肽可以具有1至500个氨基酸残基(例如1至100、1至50、6 至30、1至40、1至20、或者小于30个氨基酸或者5至10个氨基酸)的链 长度。在一些实施方式中，接头的长度可以为2、3、4、5、6、7、或者8 个氨基酸，或者接头的长度可以为约10、20、30、40或者50个氨基酸。
[0111]
通常，位于柔性蛋白区域的表面氨基酸包括gly、asn和ser，并且这些 氨基酸可以用于接头序列。其他中性的氨基酸，例如thr和ala，也可以用 于所述接头序列。额外的氨基酸可以被包括在所述接头中，从而在所述接头 序列中提供独特的限制位点以便于构建融合体。在一些实施方式中，接头可 以例如包括氨基酸序列gly
‑
ser(gs)或者可以是氨基酸序列gly
‑
ser(gs) 或者可以包含泛素序列：
[0112][0112]
或者其变体。适合于用作接头的泛素分 子描述在例如bachran，c.等“anthrax toxin
‑
mediated delivery of thepseudomonas exotoxin a enzymatic domain to the cytosol of tumor cells viacleavable ubiquitin fusions”，mbio.2013 apr 30；4(3)：e00201
‑
13或者pct 公报wo/2012/139112中。
[0113]
在一个实施例中，可以使用这样的肽接头，该肽接头容易受到具有蛋白 水解活性的补体系统的酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂、胰蛋白酶、纤 维蛋白溶酶或者其他酶切割。根据另一个实施例，所述il
‑
4r结合蛋白可以 通过容易受到具有蛋白水解活性的尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂、纤维蛋 白溶酶、凝血酶或者胰蛋白酶切割的接头进行连接。另外，所述il
‑
4r结合 蛋白可以通过二硫键(例如在半胱氨酸分子上的二硫键)而被连接到所述抗 凋亡bcl
‑
2家族成员。
[0114]
所述接头可以使用本领域已知的常规技术连接至所述il
‑
4r结合蛋白部 分和/或抗凋亡bcl
‑
2家族成员部分。
[0115]
il
‑
4r结合蛋白/抗凋亡bcl
‑
2家族融合蛋白的制备
[0116]
可以使用本领域已知的常规方法制备融合蛋白。可以例如通过使用重组 dna技术改造编码所述融合蛋白的核酸或者通过肽合成制备融合蛋白以及 对其进行的修饰。对所述融合蛋白进行的修饰可以例如使用化学修饰和/或限 制蛋白水解法通过修饰所述融合蛋白多肽本身来进行。也可以使用这些方法 的组合来制备所述融合蛋白。
[0117]
克隆和表达蛋白的方法在本领域中已知的，用于重组蛋白的表达的技术 和系统的详细说明可以在例如current protocols in protein science(coligan， j.e.,等，wiley&sons，new york)中找到。本领域技术人员应当理解的是， 可以使用各种不同的表达系统来提供重组蛋白。因此，所述融合蛋白可以在 原核生物宿主(例如，大肠杆菌(e.coli)、杀鲑气单胞菌(a.salmonicida) 或者枯草芽孢杆菌(b.subtilis))或者真核生物宿主(例如，酵母菌 (saccharomyces)或者毕赤酵母(pichia)；哺乳动物细胞，例如cos、nih3t3、cho、bhk、293、或者海拉细胞(hela cell)；或者昆虫细胞(杆状 病毒))中制得。所述融合蛋白可以使用本领域已知的标准技术从宿主细胞 中纯化。
[0118]
各种例示性的融合蛋白的序列提供在表1中。如果需要另外可选的序列， 可以使用标准技术(例如参见ausubel等，current protocols in molecularbiology，wiley&sons，ny(1997 and updates)；sambrook等，sambrook, 等molecular cloning：a laboratory manual.第二版，cold spring harborlaboratory，cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.， 1989或者它们的升级版)克隆这些序列的变体和类似物。例如可以从适当的 生物体例如嗜水气单胞菌(aeromonas hydrophila)通过提取mrna然后根 据mrna模板(例如通过rt
‑
pcr)合成cdna或者从基因组dna通过pcr 扩增该基因直接获得核酸序列。作为选择，编码il
‑
4r结合部分或者所述抗 凋亡bcl
‑
2家族部分的核酸序列可以通过标准程序从适当的cdna文库获 得。然后将分离的cdna插入到适当的载体例如克隆载体或者表达载体中。
[0119]
可以在特异性的预定位置通过本领域已知的体外定点诱变技术引入突 变(如果需要的话)。可以通过对构成编码序列的一个或者多个适当核苷酸 的缺失、插入、取代、倒位或者它们的组合来引入突变。
[0120]
所述表达载体可以进一步包含调控元件例如充分转录融合蛋白编码序 列所需要的转录元件。能够引入到载体中的调控元件的示例包括但不限于启 动子、增强子、终止子和多腺苷化信号序列。可以使用包含操作地连接至编 码遗传改造的融合蛋白的核酸序列的调控元件的载体来生成所述融合蛋白。
[0121]
所述表达载体还可以另外包含便于对表达的融合蛋白进行纯化的异源 核酸序
列，例如亲和标签(如金属亲和标签、组氨酸标签、抗生物素/链霉亲 和素编码序列、谷胱甘肽
‑
s
‑
转移酶(gst)编码序列、麦芽糖结合蛋白(mbp) 编码序列和生物素编码序列)。在一个实施例中，所述标签被结合至融合蛋 白的n末端或者c末端，或者可以定位在所述融合蛋白中。所述标签可以 在使用之前根据本领域已知的方法从表达的融合蛋白除去。可选的是，所述 标签可以保留在所述融合蛋白上，前提是它们不干扰所述融合蛋白的所希望 的活性的能力。
[0122]
所述融合蛋白可以根据需要和/或如本文所讨论的那样包含一个或者多 个接头以及其他部分。它们可以包含结合区域，例如抗生物素或者表位、或 者可以用于纯化和加工所述融合蛋白的多组氨酸标签等标签以及本文所述 的其他接头。另外，可以将可检测的标记物结合至所述融合蛋白，使得可以 方便地监视所述融合蛋白通过身体或者细胞的运输。这些标记物包括放射性 核素、酶、荧光团、发色团以及类似的标记物。
[0123]
本领域技术人员应当理解的是，可以以很多种方式改变所述dna而不 影响编码蛋白的生物学活性。例如，可以使用pcr来在编码所述融合蛋白 的dna序列中产生变化。编码融合蛋白的dna中的这些变化可以被用来 对用于表达所述蛋白的宿主中的密码子偏好进行优化，或者可以包含能够便 于表达的其他序列变化。
[0124]
il
‑
4r结合蛋白与抗凋亡bcl
‑
2家族成员的直接的共价连接或者通过接 头的共价连接可以如本领域已知的那样采取各种形式。例如，共价连接可以 为二硫键的形式。编码所述部分中的一个部分的所述dna可以被改造成包 含独特的半胱氨酸密码子。第二部分可以使用与第一部分的半胱氨酸具有反 应性的巯基进行衍生。可选的是，可以使用固相多肽技术将巯基本身或者作 为半胱氨酸的一部分引入。例如，根据hiskey(peptides 3：137，1981)所 述将巯基引入到肽中。
[0125]
分析
[0126]
可以使用本领域已知的或者本文描述的标准方法对融合蛋白进行分析。
[0127]
例如，可以使用适当的细胞(通常为表达标靶的细胞系或者癌症细胞) 对所述融合蛋白促进细胞存活或者促进细胞增殖的能力进行体外分析。一般 来说，使选用的测试细胞系的细胞生长至适当的密度，并且添加候选的融合 蛋白。可以将融合蛋白以约至少1ng/ml、至少1ug/ml、或者至少1mg/ml， 例如约0.01ug/ml至约1mg/ml、约0.10ug/ml至约0.5mg/ml、约1ug/ml 至约0.4mg/ml添加至培养物中。在一些实施例中，测试了系列稀释液。经 过适当的温浴时间(例如约48小时至72小时)之后，评价细胞存活、增殖 或者生长。确定细胞存活、增殖或者生长的方法在本领域中是已知的，并且 包括但不限于刃天青还原试验(参见fields&lancaster am.biotechnol.lab.， 11：48
‑
50，1993；o'brien等，eur.j.biochem.，267：5421
‑
5426，2000或 者u.s.pat.no.5,501,959)、磺基罗丹明分析(rubinstein等，j.natl.cancerinst.，82：113
‑
118，1999)、或者中性红色染料测试(kitano等，euro.j.clin. investg.，21：53
‑
58，1991；west等，j.investigative derm.，99：95
‑
100， 1992)、或者台盼蓝分析。可以使用很多可以商购获得的试剂盒，例如celltiter aqueous one solution细胞增殖分析(promega)。通过比较被处理的培 养物中的细胞存活和一个或者多个对照例如未处理的培养物和/或使用对照 化合物(通常是一种已知的治疗剂)预处理的培养物或者其他适当的对照的 细胞存活来确定增殖。
[0128]
另外的分析法在例如crouch等(j.immunol.meth.160，81
‑
8)；kangas 等
氏症、桥本氏病、多发性硬化症、重症肌无力、恶性贫血、反应性关节炎、 类风湿关节炎、干燥综合征、系统性红斑狼疮、i型糖尿病等)、细胞、组织 或器官移植的接受、细胞毒性药物治疗、化学治疗的接受、或者放射治疗的 接受。在一些实施方式中，包含抗凋亡bcl
‑
2家族成员的融合蛋白可以被用 来刺激需要的受试者中的脂肪细胞代谢或者减缓肥胖。在一些实施方式中， 包含抗凋亡bcl
‑
2家族成员的融合蛋白可以被用来治疗粒线体疾病。
[0134]
可以使用包含抗凋亡bcl
‑
2家族成员的融合蛋白来治疗的增殖性和/或分 化性紊乱的其他例子包括皮肤病、炎性疾病等。
[0135]
皮肤病可能涉及真皮、表皮或者皮下层中的细胞或者细胞组或者多个层 的异常活性、或者真皮
‑
表皮结合部位的异常。例如，皮肤病可能涉及角质 形成细胞(如过度增生性基底和紧挨着上基部的角质形成细胞)、黑色素细 胞、朗格汉斯细胞、默克尔细胞、免疫细胞和见于一个或多个表皮层的其它 细胞例如基底细胞层(生发层)、棘层、颗粒细胞层、透明细胞层或角质层 的异常活性。在其他一些实施方式中，所述疾病可能涉及真皮细胞例如皮肤 内皮细胞、成纤维细胞、见于真皮层例如乳头层或网状层的免疫细胞(如肥 大细胞或巨噬细胞)的异常活性。
[0136]
皮肤疾病的例子包括银屑病、银屑病性关节炎、皮炎(湿疹)例如剥脱 性皮炎或特应性皮炎、毛发红糠疹、酒渣鼻糠疹、副银屑病、苔藓样糠疹、 扁平苔藓、光泽性苔藓、鱼鳞病样皮肤病、角化性皮肤病、皮肤病、斑秃、 坏疽性脓皮病、白癜风、类天疱疮(例如，眼部瘢痕性类天疱疮或大疱性类 天疱疮)、荨麻疹、汗孔角化症(prokeratosis)、涉及内衬关节囊的上皮相关 细胞的过度增殖和炎症的类风湿关节炎；皮炎如脂溢性皮炎和日光性皮炎； 角化病如脂溢性角化病、老年角化病、光化性角化病、光致脂溢性角化、和 毛囊角化病；寻常痤疮；瘢痕瘤和预防瘢痕瘤形成；色素痣；疣类包括疣、 湿疣或花椰菜样赘疣、人乳头状瘤病毒(hpv)感染，如性病疣；白斑； 扁平苔藓；和角膜炎。皮肤病可以是皮炎，如特应性皮炎或过敏性皮炎或银 屑病。
[0137]
适合治疗的患者也可能患有银屑病。术语“银屑病”拟具有其医学意思， 即这样的一种疾病，其主要困扰皮肤和产生提高、增厚、起鳞、非瘢痕性病 变。病变通常是边界清晰的红色丘疹，覆有重叠的闪光鳞片。鳞片通常银白 色或浅乳白色。指甲受累经常发生导致凹痕、指甲分离、增厚和变色。银屑 病有时与关节炎相关联，并且可能是断裂性的。角质形成细胞的过度增殖是 银屑病性表皮增生的主要特征，伴随有表皮炎症和角质形成细胞的分化下 降。曾经提出多种机制来解释以银屑病为特征的角质形成细胞过度增生。紊 乱的细胞免疫性也参与了银屑病发病机理。银屑病性疾病的例子包括慢性静 止银屑病、寻常型银屑病、爆发性(斑点)银屑病、银屑病性红皮病、泛 发性脓疱型牛皮癣(von zumbusch)、环形泛发性脓疱型银屑病以及局部泛 发性脓疱型银屑病。
[0138]
可以使用包含抗凋亡bcl
‑
2家庭成员的融合蛋白治疗的紊乱或病症的其 他例子包括膀胱炎、创面修复、肌腱修复、肝再生、肝移植、重症肌无力、 眼色素层炎、白塞病、血吸虫病、利什曼病、结核病、弓形虫脑炎或疟疾。
[0139]
可以使用包含抗凋亡bcl
‑
2家庭成员的融合蛋白治疗的紊乱或病症的其 他例子包括中枢神经系统退行性疾病、癫痫、萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默 氏症、帕金森氏症、创伤性脑损伤、脑缺血、血管性痴呆、中风、多发性硬 化症、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩症、眼科疾病或损伤、线粒体疾病、自身免 疫性紊乱、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨质疏松症、克罗
恩氏症、特应性 皮炎、银屑病、炎性肠病、胰岛炎、i型糖尿病、肝移植或狼疮。在一些实 施方式中，可以使用包含抗凋亡bcl
‑
2家庭成员的融合蛋白治疗的紊乱或病 症包括神经紊乱或病症，例如中枢神经系统退行性疾病、癫痫、萎缩侧索硬 化症、阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、创伤性脑损伤、脑缺血、血管性痴呆、 中风、多发性硬化症、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩症等。
[0140]
在一些另外可选的实施方式中，可以使用包含抗凋亡bcl
‑
2家庭成员的 融合蛋白：作为用于治疗传染性疾病的疫苗的佐剂、用于胰岛细胞的离体保 存和扩大培养、用于离体器官保存用途、用于基于树突状细胞的治疗、用于 癌症免疫治疗、用于疫苗的免疫调节、用于树突状细胞成熟、或者用于改造 t细胞的繁殖和扩大培养，例如用于过继细胞转移治疗和嵌合抗原受体 (car)治疗(car
‑
t)的改造t细胞的繁殖或扩大培养。
[0141]
在一些另外可选的实施方式中，包含抗凋亡bcl
‑
2家庭成员的融合蛋白 可以用来刺激树突状细胞或者细胞基疫苗。在一些另外可选的实施方式中， 包含抗凋亡bcl
‑
2家庭成员的融合蛋白可以作为用于例如癌症治疗或者传 染性疾病治疗的疫苗佐剂。在一些另外可选的实施方式中，包含抗凋亡bcl
‑
2 家庭成员的融合蛋白可以在例如传染性疾病治疗或移植的治疗中用来刺激 免疫系统。
[0142]
在一些实施方式中，包含抗凋亡bcl
‑
2家族蛋白的融合蛋白或其片段可 以促进细胞存活、促进细胞增殖、抑制细胞的死亡或凋亡。在一些实施方式 中，在与适当的对照如单独的il
‑
4、结合至非抗凋亡bcl
‑
2家族蛋白的il
‑
4 等比较时，il
‑
4r结合蛋白
‑
抗凋亡bcl
‑
2家族融合蛋白能够促进细胞存活、 促进细胞增殖、抑制细胞的死亡或凋亡。合适的对照还可以包括以前建立的 标准。因此，用于确定il
‑
4r结合蛋白
‑
抗凋亡bcl
‑
2家族融合蛋白的疗效或 活性的任何测试或者分析法都可以与既定标准进行比较，并且可能不需要每 次都包括与对照进行的比较。“促进细胞存活”指的是提高(例如，至少10％、 20％、30％、或者高达50％、75％、85％或90％或更多)存在细胞死亡风险 的细胞将存活的可能性。“促进细胞增殖”指的是提高(例如，至少10％、 20％、30％、或者50％、75％、85％或90％或更多)细胞生长或增殖。“抑制 细胞死亡或凋亡”或者“保护细胞以防细胞死亡”指的是降低(例如，至少 10％、20％、30％、或者50％、75％、85％或90％或更多)的存在细胞死亡 风险的细胞将会经历凋亡、坏死或任何其他形式的细胞死亡的可能性。“增 加细胞活化作用”指的是提高(例如，至少10％、20％、30％、或者50％、 75％、85％或90％或更多)细胞的活化作用。“使细胞成熟”指的是提高(例 如，至少10％、20％、30％、或者50％、75％、85％或90％或更多)的细胞 分化成更加成熟的细胞类型。
[0143]
在一些实施方式中，包含抗凋亡bcl
‑
2家族蛋白成员或其片段的融合蛋 白在与在类似条件下培养但是不与所述融合蛋白接触的细胞相比时，能够促 进细胞存活、促进细胞增殖，抑制细胞死亡或凋亡至少20％，30％、或者高 达50％、75％、85％或90％或更多。
[0144]
在一些实施方式中，包含抗凋亡bcl
‑
2家族蛋白成员或者其片段的融合 蛋白在以如下浓度施用时与天然il
‑
4相比促进细胞存活、促进细胞增殖、抑 制细胞死亡或凋亡、保护细胞以防细胞死亡、增加细胞活化作用或者使细胞 成熟至少20％、30％、或者高达50％、75％、85％或90％或更多：约10ng/ml 至约10,000ng/ml或者其间的任何数值，例如约25ng/ml、50ng/ml、75 ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml、450ng/ml、500ng/ml、550ng/ml、600ng/ml、650ng/ml、 700ng/ml、750ng/ml、
800ng/ml、850ng/ml、900ng/ml、950ng/ml、 1000ng/ml、1500ng/ml、2000ng/ml、2500ng/ml、3000ng/ml、3500ng/ml、 4000ng/ml、4500ng/ml、5000ng/ml、5500ng/ml、6000ng/ml、6500ng/ml、 7000ng/ml、7500ng/ml、8000ng/ml、8500ng/ml、9000ng/ml、9500ng/ml、 或者10000ng/ml。
[0145]
用于测量细胞存活的促进作用、细胞增殖的促进作用、细胞死亡或者凋 亡的抑制作用、保护细胞以防细胞死亡的保护作用、细胞活化作用的增加或 者细胞成熟的促进作用的适当分析法在本文中描述或者在本领域中是已知 的。
[0146]“靶细胞”包括但不限于：神经元、淋巴细胞、干细胞、上皮细胞、免 疫细胞、骨细胞、凋亡细胞、坏死细胞、脂肪细胞和其他细胞例如经历凋亡 或者坏死或者存在凋亡或者坏死的风险的细胞。所选择的靶细胞将取决于拟 用所述融合蛋白治疗的疾病或损伤或病症。
[0147]
药物组合物，剂量和施用
[0148]
根据本公开内容的药物组合物可以包含一种或多种融合蛋白和一种或 多种非毒性的药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和佐剂。这些组合物可 以适合在本文所述的治疗性适应症的治疗中使用。
[0149]
如果需要，可以将其它活性成分包含在所述组合物中。
[0150]
在一些实施方式中，包含抗凋亡bcl
‑
2家庭成员的融合蛋白可用于促进 细胞存活、促进细胞增殖、抑制细胞死亡或凋亡、保护细胞以防细胞死亡、 增加细胞活化作用或者使细胞成熟。因此，包含所述融合蛋白的组合物如果 需要的话可以与一般用于治疗以过度细胞死亡为特征的疾病或者紊乱的任 何标准疗法结合。在一个实施方式中，所述标准疗法可以用于治疗与如下疾 病相关联的细胞死亡或者凋亡：缺氧、缺血、再灌注损伤、中风、阿尔茨海 默氏症、帕金森氏症、卢伽雷氏病、亨廷顿舞蹈症、脊髓性肌萎缩症、脊髓 损伤、细胞、组织或器官移植的接受、化学治疗的接受、或者放射治疗的接 受。特别是对于以多巴胺能细胞的死亡为特征的疾病如帕金森氏症，所述融 合蛋白可以与提高多巴胺的生成的试剂或多巴胺类似物以及抗运动障碍药 例如金刚烷胺或抗胆碱能剂结合施用。对于与存在血栓形成相关联的缺血性 损伤，所述融合蛋白可以与抗血栓试剂或溶栓试剂结合施用。。这些方法对 于本领域技术人员而言是已知的并且在e.w.martin的remington'spharmaceutical sciences中有描述。
[0151]
在一些实施方式中，对于影响中枢神经系统的疾病或者紊乱的治疗，所 述融合蛋白可以结合增强横跨血脑屏障进行运输的试剂提供。所述试剂在本 领域中是已知的并且由例如美国专利公报20050027110、20020068080和 20030091640所描述。增强活性试剂横跨血脑屏障输送的其他组合和方法在 如下出版物中记载：batrakova等，bioconjug chem.2005july
‑
august；16 (4):793
‑
802；borlongan等，brain res bull.2003may 15；60(3):297
‑
306； kreuter等，pharm res.2003march；20(3):409
‑
16；以及lee等，j drug target. 2002september；10(6):463
‑
7。用于增强血脑屏障运输的其他方法包括使 用通过渗透破坏或者生物化学打开使紧密结合部位可渗透的试剂；所述试剂 包括rmp
‑
7(alkermes)和血管活性化合物(例如组胺)。增强横跨血脑屏 障的运输的其他试剂增强了横跨内皮细胞到达下层脑细胞的胞移作用。
[0152]
作为选择，包含抗凋亡bcl
‑
2家族成员的融合蛋白可以结合化学治疗施 用，使得
所述融合蛋白降低一般与化学治疗相关联的毒性作用。例如，接受 化学治疗和融合蛋白的患者相对于仅接受化学治疗的患者而言相对不遭受 与正常细胞的凋亡(降低的中性粒细胞计数)相关联的副作用。本发明的组 合物可以在如下任何一种或者多种的使用之前、同时或者之后施用：化学治 疗试剂、放射治疗试剂、激素试剂、生物试剂、抗炎试剂、癌症疫苗佐剂。 例示性的化学治疗试剂包括它莫西芬、赫赛汀(trastuzamab)、雷洛昔芬、 阿霉素、氟尿嘧啶/5
‑
fu、帕米膦酸二钠、阿那曲唑、依西美坦、环磷酰胺、 表阿霉素、来曲唑、托瑞米芬、氟维司群、氟羟甲基睾丸素、曲妥珠单抗、 甲氨蝶呤、醋酸甲地孕酮(megastrol acetate)、多西紫杉醇，泰素、睾内酯 酮、氮丙啶、长春碱、卡培他滨、醋酸苟斯立霖(goselerin acetate)、唑来膦 酸、紫杉醇、长春碱和长春新碱。
[0153]
如果需要降低对所述融合蛋白的系统性免疫应答，可以将免疫抑制治疗 与包含抗凋亡bcl
‑
2家族成员的所述融合蛋白组合施用。免疫抑制治疗的例 子包括但不限于系统性的或者局部的皮质激素类(suga等，ann.thorac. surg.，73:1092
‑
7，2002)、环孢子菌素a(fang等，hum.gene ther，6:1039
‑
44， 1995)、环磷醯胺(smith等，gene ther，3:496
‑
502，1996)、脱氧精胍菌素 (kaplan等，hum.gene ther，8:1095
‑
1104，1997)和抗t细胞和/或b细 胞的抗体例如抗
‑
cd40配体、抗
‑
cd4抗体或者抗
‑
cd20抗体(rituximab) (manning等，hum.gene ther，9:477
‑
85，1998)。所述试剂可以在施用所 述融合蛋白之前、期间或者之后施用。所述试剂可以按约10mg/周至约1000 mg/周、约40mg/周至约700mg/周、或者约200mg/周至约500mg/周施用2、 3、4、5、6、或者7周。如果受试者保持反应性(例如癌症症状停止或者减 轻)的话，可以根据需要重复多个疗程。
[0154]“受试者”可以是需要治疗的哺乳动物，如人类或兽医学患者(例如， 啮齿类动物，如小鼠或者大鼠、猫、狗、奶牛、马、绵羊、山羊，或其他牲 畜)。在一些实施方式中，“受试者”可以是临床患者、临床试验志愿者、实 验动物等等。所述受试者可能被怀疑患有以细胞死亡为特征的疾病或者具有 患上以细胞死亡为特征的疾病、被诊断为患有以细胞死亡为特征的疾病、或 者是被证实不患有以细胞死亡为特征的疾病的对照受试者，如本文所述。用 于以细胞死亡为特征的疾病的诊断方法和这种诊断的临床划分对于本领域 技术人员是已知的。
[0155]
所述组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、缓释制剂或粉末，并且可 以和药学上可接受的载体配制。所述组合物可以使用传统的粘合剂和载体例 如甘油三酯配制成栓剂。“药学上可接受的载体”是指不会干扰活性成分的 生物活性的有效性并且不对所述宿主或者受试者产生毒性的载体基质或者 媒介物(vehicle)。
[0156]
融合蛋白可以和药学上可接受的媒介物一起输送。在一个实施例中，媒 介物可以增强稳定性和/或输送性质。因此，本公开内容还提供了所述融合蛋 白与合适的媒介物，如人造膜囊泡(包括脂质体、非离子表面活性剂泡囊 (noisome)、纳米微脂囊等)、微粒或者微胶囊、或者包含药学可接受的聚 合物的胶体制剂。这种媒介物/聚合物的使用有利于实现所述融合蛋白的持续 释放。作为替代方式或者另外的方式，所述融合蛋白制剂可以包括用于稳定 体内蛋白的添加剂例如人类血清白蛋白，或者本领域已知的用于蛋白治疗剂 的其他稳定剂。融合蛋白制剂还可以包括一种或者多种粘性增强试剂，所述 粘性增强试剂可以在例如通过注射或者经由导管进行施用时防止所述制剂 的反流。这种粘度增强试剂包括但不限于具有生物兼容性的甘油和蔗糖。
[0157]
包含一种或者多种融合蛋白的药物组合物可以根据本领域已知的方法 并且使用适当的一种或者多种分散试剂或润湿试剂和/或悬浮试剂配制成无 菌可注射水性或者油质悬浮液。所述无菌可注射制剂可以是在非毒性的亲本 可接受的稀释剂或者溶剂中的无菌可注射溶液或者悬浮液。例如，在1,3
‑
丁 二醇中的溶液。可以采用的可接受的媒介物和溶剂包括但不限于水、林格氏 溶液、乳酸林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。其他的例子包括一般被用作溶剂 或者悬浮介质的无菌固定油、以及各种品牌的固定油，包括例如合成单甘油 酯或二甘油酯。脂肪酸如油酸也可以用于可注射制剂的制备。
[0158]
在一些实施方式中，融合蛋白被偶联至水溶性聚合物例如以增加稳定性 或循环半衰期或者降低免疫原性。临床可接受的水溶性聚合物包括但不是限 于：聚乙二醇(peg)、聚乙二醇丙醛、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇 (pva)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚丙二醇均聚物(ppg)、聚氧乙烯化多 元醇(polyoxyethylated polyols，pog)、(例如，丙三醇)和其他聚氧乙烯化 多元醇、聚氧乙烯化山梨醇或者聚氧乙烯化葡萄糖和其他碳水化合物聚合 物。用于将多肽偶联至水溶性聚合物如聚乙二醇的方法例如在美国专利no. 20050106148以及本文所引用的参考文献中有描述。在一个实施例中，所述 聚合物是设计用于增强药物从酸性体腔释放到细胞质的释放的ph敏感性聚 合物(例如参见henry等，biomacromolecules 7(8)：2407
‑
14，2006)。
[0159]
在一些实施方式中，包含抗凋亡bcl
‑
2家族成员多肽的融合蛋白(例如 cpil
‑4‑
bcl
‑
xl融合蛋白)可以在生产治疗性或者预防性疫苗的过程中用于抑 制树突状细胞的凋亡或者促进树突状细胞增殖。在一些实施方式中，含抗凋 亡bcl
‑
2家族成员多肽的融合蛋白(例如cpil
‑4‑
bcl
‑
xl融合蛋白)与gm
‑
csfbcl
‑
xl融合蛋白结合使用。一般来说，所述疫苗包括衍生自需要接种疫苗的 受试者的细胞(例如树突状细胞)。一般来说，所述细胞从所述受试者的生 物学样品例如血样品或者骨髓样品获得。优选的是，从所述受试者获得树突 状细胞或者树突状干细胞，并且将所述细胞进行体外培养以获得树突状细胞 群。将所培养的细胞与抗原(例如癌症抗原)在本发明的融合蛋白存在的情 况下接触。希望的是，在所述融合蛋白存在的情况下与所述抗原接触的树突 状细胞相对于在没有所述融合蛋白存在的情况下接触的树突状细胞相比具 有相对较低的凋亡风险。可选的是，将所接触的细胞在体外进行数量扩大培 养。然后将所述细胞重新导入到所述受试者中，其中它们增强或者引起抗感 兴趣的抗原(例如癌症抗原)的免疫应答。用于产生这些疫苗的方法在本领 域中是已知的，并且描述在例如zhu等，j neurooncol.2005august；74 (1):9
‑
17；nair等，int.j.cancer.1997；70:706
‑
715；以及fong等，annu. rev.immunol.2000；18:245
‑
273中。
[0160]
通常，疫苗被制备成可注射形式，或者作为液体溶液或者作为悬浮液。 适用于注射的固体剂型也可以被制备成乳液，或者将多肽包封在脂质体中。 可以在本领域已知的任何适当的载体中注射细胞。适当的载体一般包含代谢 缓慢的大的大分子，例如蛋白质、多肽、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、 氨基酸共聚物、脂质集料以及无活性的病毒颗粒。这种载体对于本领域技术 人员来说是已知的。这些载体还可以用作佐剂。
[0161]
佐剂是增加疫苗的有效性的免疫刺激试剂。有效的佐剂包括但不限于铵 盐例如氢氧化铵和磷酸铝、胞壁酰肽(muramyl peptide)、细菌细胞壁组分、 皂素佐剂以及用作免疫刺激试剂以增强所述组合物的有效性的其他物质。
[0162]
疫苗以与剂量配方兼容的方式施用。有效量是指有效治疗或者预防疾病 或者紊
乱的单剂量，或者是以多剂量安排施用的疫苗。优选的是，剂量可有 效地抑制赘生物的生长。所施用的剂量药物将因被处理对受试者、受试者健 康状况和身体条件、受试者的免疫系统产生抗体的能力、期望保护的程度以 及其它有关因素而异。所需的活性成分的精确量将取决于医生的判断。
[0163]
在一些实施方式中，包含抗凋亡bcl
‑
2家族成员多肽的融合蛋白根据需 要可以在离体方法中使用。例如，可以将细胞(例如，从患者分离并且放置 或者保持在培养物中的外周血细胞或者纯化淋巴细胞群)在培养基中进行体 外培养，并且所述接触步骤可以通过将所述il
‑
4r融合蛋白添加至所述培养 基中来进行。所述培养步骤可以包括另外的步骤，在所述另外的步骤中，使 用其他试剂刺激或者处理所述细胞以例如刺激或者减少细胞(例如，t
h
2细 胞)群的增殖，或者以扩大培养或者消耗所述细胞群。然后将所述细胞施用 于所述患者。
[0164]
本文描述的药物组合物包括一种或多种融合蛋白，其量为有效地达到预 期的目的。通常情况下，包含含有抗凋亡bcl
‑
2家族成员的融合蛋白的组合 物被施用于已经患有以细胞死亡为特征的疾病、紊乱或者病症的患者、或者 具有患上这些疾病、紊乱或者病症的风险的患者，其量为足以治愈或者至少 部分地抑制与细胞死亡有关的症状或者促进细胞生长、存活、活化作用或者 成熟。
[0165]
因此，本领域技术人员应当认识到的是，将施用的剂量不受特定的限制。 在为治疗目的而施用之前，所述融合蛋白的剂量可能需要针对特定目的而进 行修改或改变，例如，系统性地施用所需的融合蛋白的浓度可能不同于用于 局部施用的浓度。类似的，治疗剂的毒性可能会因所使用的施用模式和总体 组成(如缓冲剂、稀释剂、附加化学治疗剂等)而异。
[0166]
根据本发明的药物组合物的“有效量”包括治疗有效量或者预防有效量。
ꢀ“
治疗有效量”是指所述融合蛋白的在用必要的剂量和时间时有效地减轻待 治疗的疾病、紊乱或者病症的量。化合物的治疗有效量可能因受试者的诸如 疾病状态、年龄、性别和体重以及该化合物在所述受试者中引起所期望的反 应的能力等因素而异。可以对剂量方案进行调整以提供最优的治疗反应。治 疗有效量还是其中所述融合蛋白的任何有毒或者不利的效果被治疗有益效 果所超过的量。确定化合物的治疗有效量完全处在本领域技术人员的能力范 围内。例如，治疗有效剂量最初可以以细胞培养分析法进行确定、或者在动 物模型例如本文所述的那些动物模型中确定。“预防有效量”是指所述融合蛋 白的在用必要的剂量和时间时有效地实现了所期望的预防效果，例如延长神 经紊乱的症状的发作或者癌症的持续缓解的量。可以使用动物模型来确定适 当的施用浓度范围和途径。这些信息然后可以被用来利用本领域普通技术人 员已知的标准方法来确定用于在其他动物例如人类中施用的有用的剂量和 途径。
[0167]
所述融合蛋白在最终的制剂中的浓度可以为至少0.1mg/ml，例如至少 1ng/ml或者至少1ug/ml或者至少1mg/ml。例如，在最终制剂中的浓度 可以为约0.01ug/ml至约1,000ug/ml。在一个实施例中，在最终制剂中的 浓度为约0.01mg/ml至约100mg/ml。
[0168]
在一些实施方式中，以如下浓度范围施用包含抗凋亡bcl
‑
2家族蛋白或 者其片段的融合蛋白：约10ng/ml至约10,000ng/ml或者其间的任意值， 例如约25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、 250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml、
450ng/ml、500ng/ml、 550ng/ml、600ng/ml、650ng/ml、700ng/ml、750ng/ml、800ng/ml、 850ng/ml、900ng/ml、950ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml、2000ng/ml、 2500ng/ml、3000ng/ml、3500ng/ml、4000ng/ml、4500ng/ml、5000ng/ml、 5500ng/ml、6000ng/ml、6500ng/ml、7000ng/ml、7500ng/ml、8000ng/ml、 8500ng/ml、9000ng/ml、9500ng/ml、或者10000ng/ml。
[0169]
然而，应当理解的是，准备施用的化合物的实际的量将由医生根据有关 情况包括待治疗的病症、所选用的施用途径、所施用的实际化合物、个体患 者的年龄、体重和反应以及患者症状的严重程度来决定。上述剂量范围仅以 举例方式给出，并且根本没有限制范围的任何意图。在一些情况中，低于上 述范围的下限的剂量水平可能更加适当，但是在其他一些情况中，可以采用 较大的剂量而没有导致有害的副作用，例如，首先通过将较大的剂量分成若 干较小的计量以用于整天施用。
[0170]
本领域的普通技术人员将理解的是，剂量将取决于被施用的融合蛋白的 类型和正在被治疗的紊乱或者病症类型等。
[0171]
通常，根据本公开内容的所述融合蛋白含有大量的人类序列，因此比例 如免疫毒素或者包含非人类序列的其他分子具有较低的抗原性。在一些实施 方式中，根据本公开内容的所述融合蛋白包含至少80％，例如，80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的人类序列。在一些实施方 式中，根据本公开内容的所述融合蛋白可以以比例如免疫毒素或者天然 il
‑
4r结合蛋白例如il
‑
4或者il
‑
13明显较低的剂量施用。
[0172]
在一些实施方式中，所述融合蛋白可以在施用于受试者时引起一定水平 的抗体应答，这在一些情况中可能导致不利的副作用。因此，如果需要，可 以按照本领域已知的或者本文描述的那样评价所述融合蛋白的抗原性。例 如，可以通过在治疗的过程中测量所述融合蛋白对动物体重的影响以及在杀 死动物后通过进行血象(hematological profile)和肝酶分析法来评价所述融 合蛋白的体内毒性影响。可以根据本领域已知的方法测试所述融合蛋白的总 体毒性。例如，可以通过在单次静脉内注射后确定杀死100％的小鼠(即， ld
100
)或者杀死50％的小鼠(即，ld
50
)的剂量来测试所述融合蛋白的总 体系统毒性。可以选择比ld
100
或者ld
50
低至少约2、5或者10倍的剂量来 施用于其他动物例如人类中。
[0173]
可以例如在免疫活性小鼠中确定抗体对本文所述的融合蛋白反应的动 力学和量级。并且可以将所述动力学和量级用于促进可以用于免疫活性人类 的剂量方案的形成。对免疫活性小鼠例如c57
‑
bl6株系施用静脉内剂量的融 合蛋白。以不同的时间间隔杀死所述小鼠(例如，在单个剂量之后、在多个 剂量之后)并获得血清。使用基于elisa的分析法检测抗
‑
融合蛋白抗体的 存在。
[0174]
如本领域已知的那样评价来自小鼠的血清样品中抗
‑
融合蛋白抗体的存 在。作为另一个实施例，还可以使用表位作图法来确定蛋白的抗原性，例如 在stickler等，j.immunotherapy，23：654
‑
660，2000中所述的那样。简而 言之，从没有暴露于感兴趣的蛋白的社会供体分离称作树突状细胞的免疫细 胞和cd4 t细胞。然后向培养的细胞中添加跨过所述蛋白的长度的小和合 成肽。响应于特定肽的存在的增殖指示t细胞表位被涵盖在该序列中。然后 在所述融合蛋白中删除或者修饰这个肽序列，由此降低它的抗原性。
[0175]
还可以例如通过确定半数有效剂量或者ed
50
(即在50％的群体中治疗 有效的剂量)和半数致死剂量或者led
50
(对50％的群体而言是致死的剂量) 等标准药学程序来确定治疗效果和毒性。治疗效果和毒性效果之间的剂量比 被称为“治疗指数”，其可以表示为比
例ld
50
/ed
50
。从细胞培养物分析和动 物研究中获得的数据可以被用来制定用于人类或者动物使用的剂量的范围。 包含在这种组合物中的剂量通常处于包括ed
50
的浓度的范围之内并且显示 出几乎没有毒性或者没有毒性。剂量根据采用的剂型、受试者的敏感性和施 用途径等而在这个范围内变化。
[0176]
对于对动物进行的施用，可以将所述药物组合物配制成用于通过各种途 径施用。例如，可以将所述组合物配制成用于表面施用、直肠施用或者肠胃 外施用或者用于通过吸入法或者喷雾施用。本文使用的术语“肠胃外”包括皮 下注射、静脉内注射、肌肉内注射、鞘内注射、胸骨内注射或者输注技术。 对流增强输送法也可以被用来施用所述融合蛋白。
[0177]
包含抗凋亡bcl
‑
2家族成员的融合蛋白可以用于在中枢神经系统(cns) 中促进细胞存活或者增殖。当输送部位是脑部时，所述融合蛋白必须能够被 输送到脑部。血脑屏障限制了很多治疗试剂从周身循环吸收到大脑和脊髓 中。跨过血脑屏障的分子使用两种主要机制：自由扩散和促进运输。因为存 在血脑屏障，所以可能需要使用特定的药物输送策略来实现给定融合蛋白在 中枢神经系统中的有益浓度。可以通过若干种方法实现融合蛋白对中枢神经 系统的输送。
[0178]
一种方法依赖于神经外科技术。例如，融合蛋白可以通过直接物理引导 而输送到中枢神经系统中，例如脑室内注射、病灶内注射或者鞘内注射。脑 室内注射可以通过脑室内导管例如连接到储室例如ommaya储室的导管来 提供便利。还可以通过可以重新填充的或者生物可降解的装置来提供导入方 法。另一种方法是通过增加血脑屏障的通透性的物质来突破血脑屏障。例子 包括动脉内输注扩散性差的试剂例如甘露醇、增加脑血管通透性的药物例如 依托泊苷或血管活性试剂如白三烯或利用导管通过对流增强输送法(ced) 进行动脉内输送。另外，可能希望将所述组合物局部施用到需要治疗的区域； 这可以例如通过在手术过程中通过注射、利用导管、或者利用植入物进行局 部输注来实现，所述植入物是孔隙性的或者非孔隙性的，或者是胶状材料， 包括膜，例如硅橡胶膜或者纤维。适当的膜有(eisai inc.)。
[0179]
包含抗凋亡
‑
bcl
‑
2家族成员的融合蛋白(例如il
‑
4r结合蛋白
‑
bcl
‑
x
l
融 合蛋白)或者其片段的体内或者体外表达是用于提高存在经历细胞死亡风险 的细胞的存活或者增殖的另一个治疗途径。编码这些融合蛋白的核酸分子可 以被输送至存在凋亡风险的受试者的细胞。融合蛋白在细胞中的表达在所述 细胞中或者在靶细胞或者组织中促进增殖、防止凋亡或者降低凋亡的风险。 必须将核酸分子以它们能够被吸收使得能够产生所述融合蛋白的治疗有效 水平的形式而被输送至受试者的细胞中。转导病毒(例如反转录病毒和腺病 毒或者腺相关病毒)载体可以被用于体细胞基因治疗，特别是因为它们具有 高效率的转染和稳定的整合和表达(参见例如cayouette等，human genetherapy 8:423
‑
430，1997；kido等，current eye research 15:833
‑
844，1996； bloomer等，journal of virology 71:6641
‑
6649，1997；naldini等，science272:263
‑
267，1996；以及miyoshi等，proc.natl.acad.sci.u.s.a.94:10319， 1997)。例如，编码融合蛋白、其变体或者片段的多核苷酸可以被克隆到反 转录病毒载体并且可以从其内源性启动子、从反转录病毒长末端重复序列或 者从对感兴趣的目标细胞类型具有特异性的启动子开始驱动表达。能够使用 的其他病毒载体包括例如痘苗病毒、牛乳头状瘤病毒或疱疹病毒，如埃
‑
巴 二氏病毒(还参见the vectors of miller，human gene therapy 15
‑
14，1990； friedman，science 244:
1275
‑
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‑
83s，1995)。反转录病毒开发得特别好并且已经在临床环境中使用(rosenberg等，n.engl.j.med 323：370,1990；anderson等，美国专利no. 5,399,346)。更优选的是，使用病毒载体向靶细胞、组织施用嵌合多核苷酸， 或者系统性地施用嵌合多核苷酸。
[0180]
非病毒方法也可以用于将治疗剂导入至需要调节细胞死亡的细胞(例 如，患者的细胞)。例如，可以在存在脂质转染法(feigner等，proc.natl.acad. sci.u.s.a.84：7413，1987；ono等，neuroscience letters 17：259，1990； brigham等，am.j.med.sci.298：278，1989；staubinger等，methods inenzymology 101：512，1983)、缺乏唾液酸基的血清粘蛋白
‑
多赖氨酸偶联法 (asialoorosomucoid
‑
polylysine conjugation)(wu等，journal of biologicalchemistry 263：14621，1988；wu等，journal of biological chemistry 264： 16985，1989)、或者通过在手术条件下进行的微注射(wolff等，science 247： 1465，1990)的情况下通过施用核酸分子来将核酸分子导入到细胞中。优选 的是，将所述核酸与脂质体和鱼精蛋白结合施用。
[0181]
也可以使用涉及体外转染的非病毒方法实现基因转移。这些方法包括磷 酸钙、deae葡聚糖、电穿孔和原生质体融合的使用。脂质体还可能潜在地 有利于将dna输送到细胞中。还可以通过将正常核酸转移到可离体培养的 细胞类型(例如，自体或者异种原发细胞或者其子代细胞)来实现将融合蛋 白移植到患者的受影响的组织中，然后将细胞(或者其后代细胞)注射到目 标组织中。
[0182]
用于多核苷酸治疗方法的cdna表达可以由任何适当的启动子(例如， 人类巨细胞病毒(cmv)、猿猴病毒40(sv40)或金属硫蛋白启动子)指 导，而且可以受任何适当的哺乳动物调控元件调控。例如，如果需要，可以 使用已知优先指导细胞在特定细胞类型中表达的增强子来指导核酸的表达。 所使用的增强子可以包括但不限于，那些被定性为组织或细胞特异性的增强 子的那些增强子。作为选择，如果基因组克隆被用作治疗构建体，调控可以 由同源调控序列进行介导，或者如果需要的话，通过源自于异种来源的调控 序列，包括上述的任意启动子或者调控元件进行介导。
[0183]
本发明将在如下实施例中进行进一步的描述。
[0184]
实施例
[0185]
实施例1
[0186]
使用可以商购获得的重组人il
‑
4作为参比，使用标准技术制备cpil
‑4‑
bclxl融合蛋白。在使用gsno或者sts损伤(insult)后，测定重 组人il
‑
4(rhil
‑
4)和cpil
‑4‑
ub
‑
bclxl对神经细胞存活的影响。多个测试的 结果表明，所述融合蛋白具有更大的保护作用。
[0187]
在一个测试中，将sh
‑
sy5y细胞与融合蛋白或者重组il
‑
4(rhil
‑
4)一 起在没有血清的培养基中温浴2小时。将gsno(0.25mm)添加到dmem 和10％血清中温浴22小时。通过cfda分析法在2至3个实验中估测细胞 的生活力。在含有tween 80的tris缓冲液中(图1a)
和在含有尿素的pbs 缓冲液中(图1b)测试所述融合蛋白。在使用gsno处理之后， cpil
‑4‑
ub
‑
bclxl(500ng)将细胞存活提高了约25％至40％，而rhil
‑
4(500 ng)将细胞生活力仅提高了约15％(图1c)。
[0188]
为了测试所述融合蛋白在响应于sts
‑
诱导的细胞死亡时对神经细胞存 活的影响，将sh
‑
sy5y细胞与所述融合蛋白或者重组il
‑
4(rhil
‑
4)一起在 没有血清的培养基中温浴2小时。将sts(50nm)添加至dmem和10％ 血清中并温浴22小时。通过cfda分析法在2个实验中估测细胞的生活力。 在含有tween 80的tris缓冲液中(图2a)和在含有尿素的pbs缓冲液中 (图2b)测试所述融合蛋白。在使用sts处理之后，cpil
‑4‑
ub
‑
bclxl(500 ng)将细胞存活提高了约20％至25％，而rhil
‑
4(500ng)对抗sts诱导的 细胞死亡没有显示出明显的保护作用(图2c)。
[0189]
实施例2
[0190]
通过将源自于外周血的单核细胞培养在粒细胞
‑
巨噬细胞菌落刺激因子 (gm
‑
csf)和白介素
‑
4(il
‑
4)中来生成人类树突状细胞(dc)(图3a)， 从而得到未成熟的dc(idc)(图3b)，使用标准的技术，使用另外的因子 和细胞因子使所述未成熟的dc进一步熟化成成熟的dc(mdc)(图3c)。 当使用gm
‑
csf
‑
bcl
‑
x
l
和cpil
‑4‑
bcl
‑
x
l
来生成dc(图3d)时，idc的收 率比通过单独使用gm
‑
csf和野生型il
‑
4生成的dc多1.8倍。通过两种条 件产生的idc的表型是相似的。当使idc熟化成mdc(图3e)时，相对于 天然细胞因子，使用bcl
‑
x
l
融合细胞因子，mdc的收率保持较高。使用整 个基因组转录体微阵列(约35,000个探针)的基因表达图谱来表征通过 bcl
‑
x
l
细胞因子生成的dc表明，当单核细胞分化成idc时，它们相对于转 录调节因子、报告子、跨膜受体、肽酶和磷酸酶而言急剧地提高了基因表达， 并且当idc分化为mdc时，细胞因子和趋化因子编码基因和th1而不是th2引诱剂受到上调。尽管发生这些变化，但是在bcl
‑
x
l
‑
idc和idc之间 以及在bcl
‑
x
l
–
mdc和mdc之间的基因表达没有统计学显著性差异(标准 fdr为0.01并且倍数变化为1.5)。这些结果表明，bcl
‑
x
l
细胞因子生成的 dc具有较高的收率且在表型或者总体基因表达图谱中没有任何差异，因此 可以用于癌症治疗。
[0191]
在此通过参引方式将所有引用文献并入本文。
[0192]
已经就一个或者多个实施方式对本发明进行了说明。但是，本领域技术 人员应当理解的是，可以进行很多变化和改进而没有脱离根据权利要求书所 限定的范围。