一种抗幽门螺杆菌的药食两用组合物及其应用的制作方法

1.本发明属于食疗和保健品领域，具体涉及一种抗幽门螺杆菌的药食两用组合物及其应用。


背景技术：

2.目前世界上约有一半的人口感染幽门螺杆菌(helicobacter pylori，hp)。hp感染导致胃炎和胃、十二指肠溃疡等消化道疾病,并且是胃癌发生发展的主要危险因素之一。很多研究已表明根除hp可显著降低胃癌的发生率。目前，世界卫生组织推荐hp感染的治疗方案是三联或四联疗法，即同时服用质子泵抑制剂(奥美拉唑等)加两种抗生素(克拉霉素、阿莫西林、四环素、甲硝唑等选二种)或铋剂(枸橼酸铋钾等)加质子泵抑制剂再加两种抗生素。但随着抗生素的长期使用，hp容易对抗生素产生不同程度的耐药，导致三联或四联疗法的根治失败，另外常引起菌群失调等副作用，加重患者负担。对耐药性幽门螺杆菌感染引起的难治性胃炎、胃溃疡等，已经不适合再使用产生耐药的抗生素治疗，必须调整抗生素，但是对幽门螺杆菌有效的候选抗生素非常少，迫切需要探索新方案。
3.产生大量高活性的尿素酶是hp的生物学特性之一。尿素酶水解尿素产生氨，在菌体周围形成“氨云”保护层，以抵抗胃酸的杀灭作用。因此，尿素酶在幽门螺杆菌感染中起定植和毒力的作用，也是治疗幽门螺杆菌的重要靶点。这样筛选抗hp尿素酶的抑制剂具有巨大的抗幽门螺杆菌应用前景。
4.中医自古以来就有“药食同源”(又称为“医食同源”)理论，“药食同源”指许多食物即药物，食物和药物一样同样能够防治疾病，在日常养生和临床治疗中具有广泛的应用。基于此，本发明从抗菌活性筛选出发配制药食两用组合物，抑制幽门螺杆菌的生长和尿素酶活性，达到日常预防或治疗幽门螺杆菌感染导致的胃部疾病的目的，也为中药材在抗幽门螺杆菌中的应用提供理论基础，为中医药更好用于临床提供参考。


技术实现要素：

5.解决的技术问题：本发明旨在于克服现有技术的不足，根据中医食疗“药食同源”的原理，采用天然药食两用植物提取物作为原料，提供一种抗幽门螺杆菌的药食两用组合物及其应用，即“生姜提取物、槐米提取物和桑叶提取物”，该方法对耐药性和敏感性幽门螺杆菌均有较好的抑制作用，并能够抑制尿素酶活性，有效降低幽门螺杆菌耐药率。
6.技术方案：一种抗幽门螺杆菌的药食两用组合物，它是由以下重量配比的原料组成的：生姜提取物3
‑
10份、槐米提取物不超过3份、桑叶提取物不超过5份。
7.优选的，按重量份计，组成为生姜提取物3
‑
7份、槐米提取物1
‑
3份、桑叶提取物1
‑
5份。
8.上述组合物在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染导致的消化道疾病食品和保健品中的应用。
9.上述组合物可制备成片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂或粉剂。
10.有益效果：本发明组合物可用于制备预防或治疗耐药性或敏感性幽门螺杆菌感染导致的急、慢性胃炎和胃、十二脂肠溃疡等胃部疾病药物，而且毒副作用小、医疗费用低。本发明组合物配伍合理，对幽门螺杆菌抗生素敏感株和耐药株都具有较好的抑制作用，且有效抑制幽门螺杆菌尿素酶活性，具有多成分、多途径、多靶点的作用特点，适用于hp感染者。总之该组合物的应用能减少抗生素的使用从而有效缓解幽门螺杆菌耐药性问题。
具体实施方式
11.实施例1抗幽门螺杆菌活性的植物提取物的筛选
12.为实现本发明根除幽门螺杆菌的目的，首先选用药食两用的植物提取物共76种，进行抗幽门螺杆菌的体外活性筛选，通过测定对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(mic)获得具有抗hp活性的植物提取物。
13.1.1材料
14.1)化学品和植物提取物：阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星等购于mce公司。植物提取物共76种，包括丁香、决明子、枸杞子、白芷、白果、赤小豆、百合、乌梅、亚麻籽、佛手、茯苓、甘草、高良姜、葛根、荷叶、罗汉果、黄芥子、黄精、黑芝麻、黑胡椒、槐米、槐花、藿香、金银花、生姜、桔红、橘皮、薄荷、桔梗、菊花、菊苣、昆布、莱菔子、莲子、淡竹叶、马齿苋、木瓜、火麻仁、胖大海、蒲公英、香薷、芡实、青果、桑椹、肉豆蔻、肉桂、山药、沙棘、砂仁、桑叶、小茴香、小蓟、香橼、鱼腥草、鲜白茅根、薤白、玉竹、余甘子、郁李仁、鱼腥草、益智仁、薏苡仁、枳椇子、栀子、竹叶黄酮、芫荽、蛹虫草、枇杷叶、辣木叶、短梗五加、玛咖粉、西蓝花粉、阿萨伊果、短刺五加、薏苡仁和紫苏籽等，购于西安小草植物科技有限责任公司。
15.2)菌株：幽门螺杆菌标准菌株26695、g27和atcc43504；其他临床菌株hp129、hp159和jres00015为南京医科大学附属第一医院和附属逸夫医院从临床患者胃粘膜样本中分离鉴定所得。
16.3)培养基和主要试剂：脑心浸液培养液(bhi)、哥伦比亚培养基、小牛血清(fcs)和100％二甲基亚砜(dmso)。
17.4)主要仪器：binder cb160三气培养箱、紫外分光光度计、恒温摇床(thermo)、离心机和电子天平等。
18.1.2方法：采用微量肉汤稀释法检测植物提取物对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(mic，100μl体系)
19.1)分别配备100mg/ml的植物提取物存储液，溶剂为无菌水或100％dmso。
20.2)菌液制备：取固体平板上对数期生长的幽门螺杆菌用bhi(含10％fcs)制作成菌悬液，调整浓度od600为0.2(菌量浓度约为1
×
108cfu/ml)，稀释10倍，菌量约为1
×
107cfu/ml，备用。
21.3)96孔板制备：第一孔先加bhi培养液(含10％fcs)176μl，再各加4μl的植物提取物储存溶液，采用二倍稀释法稀释至第8孔。
22.4)接种菌液：取10μl上述备用菌液加入上述每孔中(每孔菌量浓度约为1.0
×
106cfu/ml)内，植物提取物的终浓度依次为2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.3μg/ml和16μg/ml。另外一排每孔分别加100μl bhi培养液(含10％fcs)，作为无菌对照组；再一排每孔分别加90μl bhi培养液(含10％fcs)和10μl上述备
用菌液，作为阳性对照组。放置三气培养箱培养。
23.5)结果判断：培养48或72h后判读结果，以在小孔内完全抑制细菌生长的最低浓度为mic。当阳性对照孔(即不含药物)内细菌明显生长以及无菌对照组无菌生长时，实验才有意义。重复3次实验。
24.1.3结果
25.结果见表1。结果表明，三种提取物包括生姜、槐米和桑叶具有抗幽门螺杆菌活性，mic范围在250～1000μg/ml；而其他73种植物提取物对hp的mic均大于1000μg/ml。
26.表1.植物提取物的最小抑菌浓度(mic,μg/ml)
[0027][0028]
实施例2联合抗hp作用的检测
[0029]
选取具有抗幽门螺杆菌活性的三种植物提取物(生姜、槐米和桑叶提取物)，进行针对幽门螺杆菌的联合抗菌效应检测。借助标准棋盘滴定法[tanaka m,isogai e,isogai h,et al.,synergic effect of quinolone antibacterial agents and proton pump inhibitors on helicobacter pylori.j antimicrob chemother 2002,49(6):1039
–
1040]，采用分级抑制浓度指数(factional inhibitory concentration index,fic)评定联合用药效果。fic计算如下：∑fic＝fic
a
fic
b
，其中fic
a
＝mic
a
(在b存在下)/mic
a
(单独)，fic
b
＝mic
b
(在a存在下)/mic
b
(单独)。fic指数判读标准如下：≤0.5，协同作用；0.5
‑
1，相加作用；1
‑
4.0，无关作用；>4.0，拮抗作用。重复3次实验。
[0030]
结果见表2。结果表明，生姜提取物分别与槐米提取物和桑叶提取物可协同抗幽门螺杆菌。
[0031]
表2.生姜、槐米和桑叶的联合抗hp作用
[0032][0033]
实施例3药食两用组合物配方及其抗幽门螺杆菌活性的测定
[0034]
一种抗幽门螺杆菌的药食两用组合物(组合物1)，按重量份数组成如下：生姜提取物3份，槐米提取物2份，桑叶提取物5份。
[0035]
一种抗幽门螺杆菌的药食两用组合物(组合物2)，按重量份数组成如下：生姜提取物4份，槐米提取物3份，桑叶提取物3份。
[0036]
一种抗幽门螺杆菌的药食两用组合物(组合物3)，按重量份数组成如下：生姜提取
物5份，槐米提取物1份，桑叶提取物4份。
[0037]
一种抗幽门螺杆菌的药食两用组合物(组合物4)，按重量份数组成如下：生姜提取物6份，槐米提取物3份，桑叶提取物1份。
[0038]
一种抗幽门螺杆菌的药食两用组合物(组合物5)，按重量份数组成如下：生姜提取物7份，槐米提取物1份，桑叶提取物2份。
[0039]
采用实施例1的方法即微量肉汤稀释法，测定上述5种组合物对幽门螺杆菌的mic，结果见表3。结果表明，5种组合物都具有抗幽门螺杆菌活性，其中组合物4和5活性最强，强于各单个植物提取物。
[0040]
表3.各组合物的最小抑菌浓度(mic,μg/ml)
[0041][0042]
实施例4抗幽门螺杆菌尿素酶活性的测定
[0043]
4.1材料
[0044]
1)化学品：尿素、洋刀豆脲酶(jbu)标准品、乙酰氧肟酸(acetohydroxamic acid，aha)、乙二胺四乙酸(edta)、亚硝基铁氰化钠(snp)、水杨酸钠(ssa)和次氯酸钠(naocl)等购于sigma公司。
[0045]
2)菌株：幽门螺杆菌标准菌株g27。
[0046]
3)主要仪器：酶标分析仪、超声破碎仪、电子天平。
[0047]
4.2方法：用berthelot显色法检测抗尿素酶活性。
[0048]
1)hp尿素酶的提取：将g27菌株接种在200毫升bhi培养液(含10％fcs)中，三气培养箱37℃培养48小时，离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液pbs(ph7.4)洗涤两次，将hp菌体置于
‑
80℃保存24小时。然后取出恢复至室温，加入12毫升50mm磷酸盐缓冲液(含300mm氯化钠，ph7.0)重悬，并加入蛋白酶抑制剂，超声破碎10分钟，4℃14000rpm离心30分钟，取上清液经sephadex g
‑
25层析柱除盐，往粗酶中加入等体积的甘油，并在4℃储存，用于活性测定。
[0049]
2)洋刀豆脲酶活性标准曲线绘制：用pbs
‑
edta溶液将洋刀豆脲酶标准品稀释为0.128、0.064、0.032、0.016和0.008u/ml。取1.5ml离心管，分别加入100μl各浓度的洋刀豆脲酶标准品和100μl的100mm尿素溶液，室温反应20分钟，然后加入berthelot显色液，即依次加100μl a试剂(9.73mm snp和700mm ssa)和100μl b试剂(125mm naoh和11.3mm naocl)，混匀，室温避光显色10分钟，pbs
‑
edta作为阴性对照。显色完毕后，吸取到96孔板上，用酶标仪检测od635，计算各浓度下的od
相对值
＝od
绝对值
‑
od
阴性对照
。
[0050]
3)berthelot显色法测定尿素酶活性：采用上述berthelot显色法和标准曲线检测并计算提取的hp尿素酶活性。然后用bradford方法检测尿素酶浓度，最后计算提取的尿素酶活性，单位为u/mg。
[0051]
4)尿素酶半数抑制浓度(ic50)测定：在96孔板中加入25μl尿素酶溶液(10u/ml)、
25μl受试植物提取物或组合物(浓度根据实验设定)和50μl含尿素100mm的磷酸盐缓冲溶液，混匀，避光，室温反应20分钟，然后加入100μl上述a试剂和b试剂，混匀，避光，室温反应20分钟，在635nm下测定吸光度值。另设空白组、正常对照组、阳性对照组(aha)，由此计算出抑制率及半数抑制浓度ic50。
[0052]
4.3结果
[0053]
结果见表4。结果表明，各组合物均具有一定的抗幽门螺杆菌尿素酶活性。
[0054]
表4.各样品对尿素酶的半数抑制浓度(ic50)
[0055]