一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法和应用与流程

技术特征：
1.一种crispr/cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将多个sgrna通过多顺反子trna
‑
grna方式连接到pmk
‑
(1
‑
12)中间载体上，每个中间载体上可以连接1个到多个sgrnas，得到pmk(1
‑
12)
‑
ptg载体；(2)将多个pmk(1
‑
12)
‑
ptg载体上的u6/u3表达盒连接到pmmk
‑
cas9载体上，pmmk
‑
cas9连接2个到7个pmk(1
‑
12)
‑
ptg载体上u6/u3表达盒，得到pmmk
‑
ptg载体。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述pmk(1
‑
12)是一套12个用于crispr/cas9介导的基因编辑的中间载体，其中pmk1、pmk10、pmk11各含有一个osu6表达盒，osu6表达盒核苷酸序列如seq id no.1所示；pmk2、pmk3、pmk8、pmk9各含有一个osu3表达盒，osu3表达盒核苷酸序列如seq id no.2所示；pmk4、pmk5各含有一个osu6a表达盒，osu6a表达盒核苷酸序列如seq id no.3所示；pmk6、pmk7、pmk12各含有一个osu6b表达盒，osu6b核苷酸序列如seq id no.4所示。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，将多个sgrna构建到pmk(1
‑
12)中间载体上，首先根据基因打靶位点通过crispr
‑
ge网站在线设计靶序列，合成引物，grna[x]
‑
f(seq id no.5)：5
‘‑
taggtctccn9n
10
n
11
n
12
n
13
n
14
n
15
n
16
n
17
n
18
n
19
n
20
gttttagagctaga a
‑3’
grna[x]
‑
r(seq id no.6)：5
’‑
cgggtctcan
12
n
11
n
10
n9n8n7n6n5n4n3n2n1tgcaccagccggg
‑3‘
；其中，n1‑
n
20
分别表示20bp靶序列的第1位至第20位上的核苷酸。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，根据连接到pmk
‑
(1
‑
12)各个小载体的不同，使用扩增引物ptg pmk(1
‑
12)f和ptg crispr r，同时进行扩增，ptg pmk1/10/11f的引物序列如seq id no.8所示；ptg pmk2/3/8/9f的引物序列如seq id no.9所示；ptg pmk 4/5f的引物序列如seq id no.10所示；ptg pmk6/7/12f的引物序列如seq id no.11所示；ptg crispr r的引物序列如seq id no.12所示；ptg pmk1/10/11f(seq id no.8)：gtacgggtctcatgtggaacaaagcaccagtggtctaptg pmk2/3/8/9f(seq id no.9)：gtacgggtctcatggcaacaaagcaccagtggtctaptg pmk 4/5f(seq id no.10)：gtacgggtctcatgccgaacaaagcaccagtggtctaptg pmk6/7/12f(seq id no.11)：gtacgggtctcatgttgaacaaagcaccagtggtctaptg crispr r(seq id no.12)：gactaggtctccaaacaaaaaaaaaagcaccgactcg在获得trna
‑
grna单元的同时，同时扩增获得trna
‑
grna单元与小载体链接的接头片段，将trna
‑
grna单元通过多片段连接方法连接到pmk(1
‑
12)中间载体上，得到含有多顺反子trna
‑
sgrna的pmk(1
‑
12)
‑
ptg载体；所述多片段连接方法是使用iis型核酸内切酶酶切和连接的“金门”克隆，将多个trna
‑
grna同时连接到pmk(1
‑
12)中间载体，所述iis型限制性内
切酶为bsai、aari、bbsi、bsmai或bsmbi。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中pmk(1
‑
12)中间载体上，u6/3启动子后面携带iis型限制性核酸内切酶酶切位点，多顺反子trna
‑
grna片段插入到两个iis型限制性核酸内切酶酶切位点之间。6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)将多个pmk(1
‑
12)
‑
ptg载体上u6/3表达盒连接到pmmk
‑
cas9载体，pmk(1
‑
12)中间载体的连接顺序为：连接2个u6/u3时，pmk 1 pmk 2连接到pmmk
‑
cas9；连接3个u6/u3时，pmk 1 pmk 3 pmk 4连接到pmmk
‑
cas9；连接4个u6/u3时，pmk 1 pmk 3 pmk5 pmk6连接到pmmk
‑
cas9；连接5个u6/u3时，pmk1 pmk3 pmk5 pmk7 pmk8连接到pmmk
‑
cas9；连接6个u6/u3时，pmk1 pmk 3 pmk5 pmk7 pmk 9 pmk 10连接到pmmk
‑
cas9；连接7个u6/u3时，pmk1 pmk3 pmk5 pmk7 pmk9 pmk11 pmk12连接到pmmk
‑
cas9。7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，多个pmk(1
‑
12)中间载体连接pmmk
‑
cas9方法使用iis型核酸内切酶酶切和连接的“金门”克隆，将多个pmk(1
‑
12)上面的u6/3表达盒同时连接到pmmk
‑
cas9，所述iis型限制性内切酶包括bsai、aari、bbsi、bsmai或bsmbi；多个pmk(1
‑
12)上面的u6/3表达盒同时连接到pmmk
‑
cas9的两个ii型限制性内切酶之间。8.权利要求1
‑
7任一方法构建得到的工具载体或成套工具载体。9.权利要求8所述的工具载体在crispr/cas9介导的植物多基因编辑系统中的应用。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

技术总结
本发明公开了一种构建简便、高效的植物多基因编辑载体方法，其包括pMK


技术研发人员：张辉 汪冲 罗鹏宇 洪政 张亚军
受保护的技术使用者：上海师范大学
技术研发日：2021.07.08
技术公布日：2021/10/28