一种定量测定组培苗不同氮源的自养和异养效率的方法与流程

1.本发明涉及一种定量测定组培苗不同氮源的自养和异养效率的方法，属于生物技术领域。
技术背景
2.植物的组织培养是当前生物技术中的最基本的技术和手段，现已广泛应用到园艺、农业和林业生产中。它是一种在人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件下，快速繁育植物的技术。
3.在植物组织培养过程中，组培苗的生长方式有三种：一是小植株靠光合作用进行的自养生长；二是小植株靠培养基中的有机碳源进行异养生长；三是小植株既靠培养基中的有机碳源又靠人工光照，同时进行异养和自养的兼养生长。现在常规的植物组织培养快繁技术大多数是以第三种方式进行。通常，组培苗的自养能力决定了组培苗生长的情况，且自养能力强的组培苗有助于提高后期驯化过程中组培苗的存活率。
4.氮是植物生长发育过程中的必需元素，是构成蛋白质、核酸、酶、叶绿素等的重要组成成分。大多数植物吸收利用的无机氮主要是硝酸盐和铵盐。在硝酸盐和铵盐共存下，不同的氮源在不同的浓度和配比下，其硝态氮和铵态氮的利用份额是不同的。由于不同的氮源的代谢途径和代谢机制不同，对植物的形态建成和其他代谢的影响也不同，尤其是对组培苗的自养和异养代谢效率的影响也不同。了解不同氮源对自养和异养的效率的影响差异，可以清晰了解碳氮同化的耦合过程，更加清晰碳氮耦合机制，为节能(减少蔗糖的利用)增(加)(碳)汇的氮素管理(减少污染)提供决策。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是：提供一种定量测定组培苗不同氮源的自养和异养效率的方法，可以同时获取混合氮源下组培苗的自养和异养份额以及不同无机氮源的利用份额，填补了混合氮源下不同氮源的自养效率和异养效率不能获取的空白，为节能(减少蔗糖的利用)增(加)(碳)汇的氮素管理(减少污染)提供决策。
6.它包含以下步骤：
7.第一，将所有培养选定在同一培养室中培养，所使用的蔗糖选定为同一生产厂家、同一批次的稳定碳同位素组成相同的甘蔗蔗糖；
8.第二，将在甘蔗蔗糖培养基上培养的待测组培苗通过调节培养基的激素比例使其处于增殖阶段，形成无根的组培苗；同时测定组培培养基中甘蔗蔗糖的δ
13
c值δ
cs
以及待测植物在该组培室中仅利用二氧化碳生长的叶片的δ
13
c值δ
c
；获取待测植物在该组培室中仅利用二氧化碳生长的叶片的δ
13
c值δ
c
的方法为：在实验期间，将组培苗对应的种子播种在相应的培养基中，然后在该组培室中培养5周，最后测定新生叶片的δ
13
c值δ
c
；
9.第三，通过测定用于配置植物组织培养的培养基中的硝酸盐的稳定氮同位素比值，筛选出稳定氮同位素值差值大于10
‰
的两种硝酸盐，其稳定氮同位素值分别为δ
15
n
01
和
δ
15
n
02
；分别将这两种硝酸盐作为唯一氮源配置为待考察的硝酸盐浓度的培养基；
10.第四，取带有1个单芽的待测组培苗分别培养在上述稳定氮同位素值不同的两种硝酸盐作为唯一氮源的培养基中；
11.第五，组培苗经过5周培养后，分别测定上述两种硝酸盐作为唯一氮源的培养基培养下的组培苗叶片的稳定氮同位素值，其叶片稳定氮同位素值分别记为δ
15
n
n1
和δ
15
n
n2
；
12.第六，通过测定用于配置植物组织培养的培养基中的铵盐的稳定氮同位素比值δ
15
n
a
，选出其稳定氮同位素比值δ
15
n
a
与δ
15
n
01
和δ
15
n
02
均大于10
‰
的铵盐；
13.第七，将稳定氮同位素值为δ
15
n
01
和δ
15
n
02
的硝酸盐分别与上述铵盐配置成待考察的两组混合氮源培养基；
14.第八，同样，将带有1个单芽的待测组培苗，分别同时培养在上述两组混合氮源培养基上；
15.第九，同样，待组培苗培养5周后，测定在上述两组混合氮源培养基上培养的组培苗叶片稳定氮同位素值，铵盐与稳定氮同位素值为δ
15
n
01
的硝酸盐组成的混合氮源培养基培养的组培苗叶片稳定氮同位素值记为δ
15
n
n1mix
，铵盐与稳定氮同位素值为δ
15
n
02
的硝酸盐组成的混合氮源培养基培养下的组培苗叶片稳定氮同位素值记为δ
15
n
n2mix
；
16.第十，同时测定在上述两组混合氮源培养基上培养的组培苗叶片稳定碳同位素值δ
ct
以及c/n值r，c/n值r测定方法为：通过元素分析仪同时测得叶片的碳含量c和氮含量n,c/n值r则为：r＝c/n；
17.第十一，利用δ
15
n
n1
、δ
15
n
n2
、δ
15
n
n1mix
和δ
15
n
n2mix
，计算组培苗利用硝酸盐份额f
n
；进而计算出铵盐利用份额f
a
；计算组培苗利用硝酸盐的份额f
n
的方法为：将δ
15
n
n1
、δ
15
n
n2
以及该硝酸盐浓度下的δ
15
n
n1mix
和δ
15
n
n2mix
代入方程：代入方程：铵盐利用份额f
a
的公式是：f
a
＝1
‑
f
n
。
18.第十二，利用δ
cs
、δ
ct
以及δ
c
；计算组培苗自养份额f
at
；进而计算出异养份额f
ht
；计算组培苗自养份额f
at
的方法为：将δ
cs
、δ
ct
以及δ
c
带入方程：带入方程：异养份额f
ht
的公式是：f
ht
＝1
‑
f
at
。
19.第十三，依据叶片的r、f
a
、f
n
、f
at
以及f
ht
，进而获得组培苗不同氮源培养下的自养和异养效率；获得组培苗在不同氮源培养下的自养和异养效率的方法为：铵态氮的自养效率e
at
‑
a
，e
at
‑
a
＝r f
at
/f
a
；铵态氮的异养效率e
ht
‑
a
，e
ht
‑
a
＝r f
ht
/f
a
；硝态氮的自养效率e
at
‑
n
，e
at
‑
n
＝r f
at
/f
n
；硝态氮的异养效率e
ht
‑
n
，e
ht
‑
n
＝r f
ht
/f
n
。
20.本发明有益效果及优点
21.1)本发明可以同时测定在混合氮源培养下组培苗碳氮同化信息。
22.2)本发明可以获取不同氮源配置下不同无机氮源对组培苗的自养和异养途径的贡献，可以评价不同氮源配置下组培苗的碳氮耦合能力，为优质组培苗的培养基筛选提供了技术支持。
23.3)本方法的自养和异养信息的获取利用了普通的实验条件，不增加额外的实验，与无机氮的信息同时获得，减少了实验误差，因此获得的结果更为可靠。
24.4)本方法可以以较少的实验快速获取组培苗同化不同无机氮源的信息，可以预测
不同氮源配置下的组培苗无机氮同化效果。
25.5)本方法采用的步骤少，计算简单。
26.发明原理
27.稳定氮同位素技术目前已被广泛用着氮源的指示剂来研究生物圈的氮循环。自然界中氮元素的两种稳定氮同位素为
14
n和
15
n，稳定氮同位素值通常用δ
15
n(
‰
)表示，自然界中δ
15
n的变化为
‑
10
‰
～ 20
‰
。培养在不同氮源下的植物的叶片氮同位素值能很好地反映氮源的稳定氮同位素值的特征。因此，通过质量平衡原理和同位素混合模型就可定量判别植物体内不同的无机氮源。
28.组培苗在同化硝酸盐和铵盐时都会存在一定的氮同位素分馏。在混合氮源条件下培养的组培苗叶片的稳定氮同位素值是同化硝酸盐和铵盐发生氮同位素分馏后的稳定氮同位素值混合的结果。
29.在植物组织培养的增殖阶段，可以通过调节细胞分裂素和生长素的浓度比例来确保组培苗在整个增殖阶段不产生根，这样硝酸盐和铵盐的同化就仅发生在叶片。本发明测定组培苗的硝酸盐和铵盐的利用份额是通过双向氮同位素标记培养法。首先用两种稳定氮同位素差值大于10
‰
的硝酸盐同时培养组培苗，然后，在分别用这两种硝酸盐与同一种铵盐同时培养组培苗，保证铵盐的稳定氮同位素值与这两种硝酸盐的稳定氮同位素值差值均大于10
‰
，分别测定两种混合氮源培养下组培苗叶片的稳定氮同位素值。最后通过两端元混合模型来计算出组培苗分别利用硝酸盐和铵盐的份额。
30.两端元的同位素混合模型表示为：
31.δ
15
n
n1mix
＝f
n
δ
15
n
n1
f
a
δ
15
n
a
‑
t
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)
32.δ
15
n
n2mix
＝f
n
δ
15
n
n2
f
a
δ
15
n
a
‑
t
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)
33.f
a
＝1
‑
f
n
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(3)
34.这里的δ
15
n
n1
和δ
15
n
n2
分别为组培苗在稳定氮同位素值差值大于10
‰
的两种硝酸盐培养下的叶片稳定氮同位素值，δ
15
n
a
‑
t
为混合氮源培养下组培苗同化铵盐发生氮同位素分馏后的稳定氮同位素值。δ
15
n
n1mix
是稳定氮同位素值为δ
15
n
01
的硝酸盐与铵盐组成混合氮源培养下的组培苗叶片的稳定氮同位素值。δ
15
n
n2mix
是稳定氮同位素值为δ
15
n
02
的硝酸盐与铵盐组成混合氮源培养下的组培苗叶片的稳定氮同位素值。f
n
为硝酸盐的利用份额，f
a
为铵盐的利用份额。
35.联立方程(1)(2)和(3)，求解得到：
[0036][0037]
自然界中碳元素同样也有两种稳定同位素：
12
c和
13
c，它们的天然平均丰度分别为98.89％和1.11％。稳定碳同位素组成通常用δ
13
c(
‰
)表示,自然界中δ
13
c的变化为
‑
90
‰
～ 20
‰
。
[0038]
在植物组织培养过程中，组培苗通常是进行兼养生长，因此，就得额外提供糖作为有机碳源。组培苗在生长过程中会利用有机碳源和无机碳源来生长，因此就会造成新生叶片的δ
13
c值既有来自有机碳源的组分(异养来源)，又有来自无机碳源的组分(自养来源)。因此，可以利用两端元的同位素混合模型获取组培苗利用有机碳源的份额。c3植物δ
13
c的变化范围为
‑
20
‰
～
‑
35
‰
，c4植物δ
13
c的变化范围为
‑9‰
～
‑
17
‰
。c3植物的代表性蔗糖是甜菜
蔗糖，c4植物的代表性蔗糖是甘蔗蔗糖。选用甘蔗蔗糖作为碳源会使c3植物δ
13
c比利用空气中co2作为碳源相差10
‰
左右，因此可以用两端元的同位素混合模型来计算出各自的份额。
[0039]
两端元的同位素混合模型可以表示为：
[0040]
δ
ct
＝δ
h
‑
f
at
δ
h
f
at
δ
c
ꢀꢀ
(5)
[0041]
这里的δ
ct
为混合氮源培养下组培苗新生叶片的δ
13
c值，δ
c
为组培苗完全利用空气中co2作为无机碳源的δ
13
c值，δ
h
为组培苗完全利用蔗糖作为有机碳源的δ
13
c值，f
ah
为该考察组培苗利用无机碳源时的自养份额。
[0042]
δ
c
为组培苗完全利用空气中co2作为无机碳源的δ
13
c值，它近似等同于组培苗对应的种子播种在相应的培养基中，然后在该组培室中培养5周，最后测定的新生叶片的δ
13
c值δ
c
。δ
h
为组培苗完全利用蔗糖作为有机碳源的δ
13
c值，我们知道，组培条件下甘蔗蔗糖的稳定碳同位素分馏值为2.54
‰
，因此：δ
h
＝δ
cs
‑
2.54
‰
，这里δ
cs
为甘蔗蔗糖的的δ
13
c值。因此可得：
[0043][0044]
则：
[0045]
f
ht
＝1
‑
f
at
ꢀꢀ
(7)
[0046]
这里f
ht
为异养份额。
[0047]
植物的c/n比r可以表征植物的氮的利用效率。同理，自养碳与铵态氮的利用份额的比率则可表征铵态氮对于自养的效率，即e
at
‑
a
，e
at
‑
a
＝r f
at
/f
a
；同理可得铵态氮的异养效率e
ht
‑
a
，e
ht
‑
a
＝r f
ht
/f
a
；硝态氮的自养效率e
at
‑
n
，e
at
‑
n
＝rf
at
/f
n
；硝态氮的异养效率e
ht
‑
n
，e
ht
‑
n
＝r f
ht
/f
n
。
具体实施方式
[0048]
本发明的实施例，它包括以下步骤：
[0049]
第一，将所有培养选定在同一培养室中培养，所使用的蔗糖选定为同一生产厂家、同一批次的稳定碳同位素组成相同的甘蔗蔗糖；
[0050]
第二，将在甘蔗蔗糖培养基上培养的待测组培苗通过调节培养基的激素比例使其处于增殖阶段，形成无根的组培苗；同时测定培养基中甘蔗蔗糖的δ
13
c值δ
cs
以及待测植物在该组培室中仅利用二氧化碳生长的叶片的δ
13
c值δ
c
；获取待测植物在该组培室中仅利用二氧化碳生长的叶片的δ
13
c值δ
c
的方法为：在实验期间，将组培苗对应的种子播种在相应的培养基中，然后在该组培室中培养5周，最后测定新生叶片的δ
13
c值δ
c
；
[0051]
第三，通过测定用于配置植物组织培养的培养基中的硝酸盐的稳定氮同位素比值，筛选出稳定氮同位素值差值大于10
‰
的两种硝酸盐，其稳定氮同位素值分别为δ
15
n
01
和δ
15
n
02
；分别将这两种硝酸盐作为唯一氮源配置为待考察的硝酸盐浓度的培养基；
[0052]
第四，取带有1个单芽的待测组培苗分别培养在上述稳定氮同位素值不同的两种硝酸盐作为唯一氮源的培养基中；
[0053]
第五，组培苗经过5周培养后，分别测定上述两种硝酸盐作为唯一氮源的培养基培养下的组培苗叶片的稳定氮同位素值，其叶片稳定氮同位素值分别记为δ
15
n
n1
和δ
15
n
n2
；
[0054]
第六，通过测定用于配置植物组织培养的培养基中的铵盐的稳定氮同位素比值δ
15
n
a
，选出其稳定氮同位素比值δ
15
n
a
与δ
15
n
01
和δ
15
n
02
均大于10
‰
的铵盐；
[0055]
第七，将稳定氮同位素值为δ
15
n
01
和δ
15
n
02
的硝酸盐分别与上述铵盐配置成待考察的两组混合氮源培养基；
[0056]
第八，同样，将带有1个单芽的待测组培苗，分别同时培养在上述两组混合氮源培养基上；
[0057]
第九，同样，待组培苗培养5周后，测定在上述两组混合氮源培养基上培养的组培苗叶片稳定氮同位素值，铵盐与稳定氮同位素值为δ
15
n
01
的硝酸盐组成的混合氮源培养基培养的组培苗叶片稳定氮同位素值记为δ
15
n
n1mix
，铵盐与稳定氮同位素值为δ
15
n
02
的硝酸盐组成的混合氮源培养基培养下的组培苗叶片稳定氮同位素值记为δ
15
n
n2mix
；
[0058]
第十，同时测定在上述两组混合氮源培养基上培养的组培苗叶片稳定碳同位素值δ
ct
以及c/n值r，c/n值r测定方法为：通过元素分析仪同时测得叶片的碳含量c和氮含量n,c/n值r则为：r＝c/n；
[0059]
第十一，利用δ
15
n
n1
、δ
15
n
n2
、δ
15
n
n1mix
和δ
15
n
n2mix
，计算组培苗利用硝酸盐份额f
n
；进而计算出铵盐利用份额f
a
；计算组培苗利用硝酸盐的份额f
n
的方法为：将δ
15
n
n1
、δ
15
n
n2
以及该硝酸盐浓度下的δ
15
n
n1mix
和δ
15
n
n2mix
代入方程：代入方程：铵盐利用份额f
a
的公式是：f
a
＝1
‑
f
n
。
[0060]
第十二，利用δ
cs
、δ
ct
以及δ
c
；计算组培苗自养份额f
at
；进而计算出异养份额f
ht
；计算组培苗自养份额f
at
的方法为：将δ
cs
、δ
ct
以及δ
c
带入方程：带入方程：异养份额f
ht
的公式是：f
ht
＝1
‑
f
at
。
[0061]
第十三，依据叶片的r、f
a
、f
n
、f
at
以及f
ht
，进而获得组培苗不同氮源的自养和异养效率；获得组培苗不同氮源的自养和异养效率的方法为：铵态氮的自养效率e
at
‑
a
，e
at
‑
a
＝r f
at
/f
a
；铵态氮的异养效率e
ht
‑
a
，e
ht
‑
a
＝r f
ht
/f
a
；硝态氮的自养效率e
at
‑
n
，e
at
‑
n
＝r f
at
/f
n
；硝态氮的异养效率e
ht
‑
n
，e
ht
‑
n
＝r f
ht
/f
n
。
[0062]
实施例1：硝酸盐浓度为20mm时不同铵盐浓度下甘蓝型油菜组培苗不同氮源自养和异养效率的确定
[0063]
培养材料：无性系甘蓝型油菜组培苗
[0064]
培养基配方为：ms 6
‑
ba 2.0 mg/l naa 0.2mg/l，30g/l甘蔗蔗糖，琼脂：7.5g/l，ph值：5.8，培养室温度：25
±
2℃。光周期：12h/d，光照强度：50μmol
·
m
‑2·
s
‑1，甘蔗蔗糖的δ
13
c值δ
cs
为
‑
11.64
‰
；两种硝酸盐的稳定氮同位素值分别为：δ
15
n
01
＝8.08
‰
，δ
15
n
02
＝22.67
‰
。铵盐的稳定氮同位素值为：δ
15
n
a
＝
‑
2.64
‰
。按照本发明的方法，将铵盐分别与稳定氮同位素值为δ
15
n
01
和δ
15
n
02
的硝酸盐组成混合氮源，在配置培养基时，保证培养基的硝酸盐浓度都为20mm，然后设置铵盐的浓度分别为2.5mm、5mm、10mm和40mm。这样培养基的无机氮浓度就分别是22.5mm、25mm、30mm和60mm。将无性系甘蓝型油菜组培苗分别培养在上述培养基中，经过5周培养后，分别测定甘蓝型油菜组培苗叶片的c/n、δ
13
c值δ
ct
，以及在δ
15
n
01
的硝酸盐与铵盐组成混合氮源培养下的叶片稳定氮同位素值δ
15
n
n1mix
和在稳定氮同位素值为δ
15
n
02
的硝酸盐与铵盐组成混合氮源培养下叶片稳定氮同位素值δ
15
n
n2mix
。测定结果如表1所示：与此同时，将组培苗对应的种子播种在相应的培养基中，然后在该组培室中培养5周，最
后测定新生叶片的δ
13
c值δ
c
，测定新生叶片的δ
13
c值δ
c
为
‑
28.05
‰
(n＝3)。
[0065]
表1铵盐处理下甘蓝型油菜组培苗叶片的稳定碳氮同位素值和c:n
[0066][0067]
注：培养基中的硝酸盐都为20mm。n＝3。
[0068]
从表1可知，在培养基中硝酸盐浓度都为20mm的情况下，增加铵盐的浓度，甘蓝型油菜组培苗分别在铵盐与两种稳定氮同位素值差距较大的硝酸盐组成混合氮源培养下的叶片稳定氮同位素值都在逐渐减小，且都在最高铵盐浓度下有最小的稳定氮同位素值；然而，甘蓝型油菜组培苗的叶片稳定碳同位素值则呈现先逐渐减小，然后逐渐增大的趋势。
[0069]
由于培养基中硝酸盐的浓度都为20mm，而甘蓝型油菜组培苗在20mm稳定氮同位素值为δ
15
n
01
的硝酸盐培养下的叶片稳定氮同位素值δ
15
n1＝3.30
‰
(n＝3)；在20mm稳定氮同位素值为δ
15
n
02
的硝酸盐培养下的叶片稳定氮同位素值δ
15
n2＝15.53
‰
(n＝3)。结合表1的δ
15
n
n1mix
和δ
15
n
n2mix
，利用方程，利用方程就可以计算得到在混合氮源培养下甘蓝型油菜组培苗利用硝酸盐和铵盐的份额，其结果如表2所示。同时利用表1的δ
ct
数据，同时将δ
cs
(
‑
11.64
‰
)，δ
c
(
‑
28.05
‰
)带入方程：可以计算得到在混合氮源培养下甘蓝型油菜组培苗的自养和异养份额，其结果如表2所示。
[0070]
表2铵盐处理下甘蓝型油菜组培苗的硝酸盐利用份额(f
n
)和铵盐利用份额(f
a
＝1
‑
f
n
)；自养份额(f
at
)和异养份额(f
ht
)
[0071][0072]
注：培养基中的硝酸盐都为20mm。n＝3。
[0073]
依据表1和表2的叶片r、f
a
、f
n
、f
at
以及f
ht
，进而获得甘蓝型油菜组培苗在铵盐处理下的自养和异养效率；见表3。
[0074]
表3铵盐处理下甘蓝型油菜组培苗不同氮源的自养效率和异养效率
[0075]
[0076][0077]
注：培养基中的硝酸盐都为20mm。n＝3。
[0078]
从表3可以看出，在培养基中硝酸盐浓度都为20mm的情况下，随着铵盐浓度的增加，甘蓝型油菜组培苗铵盐的自养效率和异养效率都是在逐渐减下的，且在最高铵盐浓度下的自养效率和异养效率都最小。然而，增加铵盐的浓度能明显提高甘蓝型油菜组培苗硝酸盐的异养效率，但是对硝酸盐的自养效率的提高存在一个拐点，在铵盐浓度为5mm时，甘蓝型油菜组培苗的硝酸盐自养效率最大，此后，随着铵盐浓度的增加，硝酸盐的自养效率逐渐降低。在植物组织培养过程中，一般不追求最大的硝酸盐和铵盐异养效率，因为最大无机氮异养效率常常意味着较低自养能力，这对组培苗的后期驯化过程不利。然而，在组织培养过程中也不是不惜一切代价地获取组培苗的最大自养能力。考虑到氮是植物生长发育过程中的必需元素，是构成蛋白质、酶和叶绿素等的重要组成成分。因此，量化组培苗的硝酸盐和铵盐自养效率就显得尤为重要。从表3可知，在培养基中硝酸盐浓度为20mm,铵盐浓度为5mm时，甘蓝型油菜组培苗的硝酸盐和铵盐的自养效率之和最大，这意味着甘蓝型油菜在这种无机氮配比情况下的无机碳固定效率最高。继续增加无机氮的供应并不能提高甘蓝型油菜组培苗的硝酸盐和铵盐的自养效率，反而造成了无机氮的浪费。
[0079]
实施例2：铵盐浓度为20mm时不同硝酸盐浓度下甘蓝型油菜组培苗不同氮源自养和异养效率的确定
[0080]
培养材料：无性系甘蓝型油菜组培苗
[0081]
培养基配方为：ms 6
‑
ba 2.0 mg/l naa 0.2mg/l，30g/l甘蔗蔗糖，琼脂：7.5g/l，ph值：5.8，培养室温度：25
±
2℃。光周期：12h/d，光照强度：50μmol
·
m
‑2·
s
‑1，甘蔗蔗糖的δ
13
c值δ
cs
为
‑
11.64
‰
；两种硝酸盐的稳定氮同位素值分别为：δ
15
n
01
＝8.08
‰
，δ
15
n
02
＝22.67
‰
。铵盐的稳定氮同位素值为：δ
15
n
a
＝
‑
2.64
‰
。按照本发明的方法，将铵盐分别与稳定氮同位素值为δ
15
n
01
和δ
15
n
02
的硝酸盐组成混合氮源，在配置培养基时，保证培养基的铵盐浓度都为20mm，然后设置硝酸盐的浓度分别为5mm、10mm、20mm、和40mm。这样培养基的氮浓度就分别是25mm、30mm、40mm和60mm。将无性系甘蓝型油菜组培苗分别培养在上述培养基中，经过5周培养后，分别测定甘蓝型油菜组培苗叶片的c/n、δ
13
c值δ
ct
，以及在δ
15
n
01
的硝酸盐与铵盐组成混合氮源培养下的叶片稳定氮同位素值δ
15
n
n1mix
和在稳定氮同位素值为δ
15
n
02
的硝酸盐与铵盐组成混合氮源培养下叶片稳定氮同位素值δ
15
n
n2mix
。测定结果如表4所示：将组培苗对应的种子播种在相应的培养基中，然后在该组培室中培养5周，最后测定新生叶片的δ
13
c值δ
c
，测定新生叶片的δ
13
c值δ
c
为
‑
28.05
‰
(n＝3)。
[0082]
表4硝酸盐处理下甘蓝型油菜组培苗叶片的稳定碳氮同位素值和c:n
[0083][0084]
注：培养基中的铵盐都为20mm。n＝3。
[0085]
从表4可知，在培养基中铵盐浓度都为20mm的情况下，随着硝酸盐浓度的增加，甘蓝型油菜组培苗分别在铵盐与两种稳定氮同位素值差距较大的硝酸盐组成混合氮源培养下的叶片稳定氮同位素值都呈逐渐增大的趋势，且都在最高硝酸盐浓度下有最大的稳定氮同位素值；甘蓝型油菜组培苗的叶片稳定碳同位素值则呈现逐渐减小的趋势。
[0086]
甘蓝型油菜组培苗在稳定氮同位素值为8.08
‰
硝酸盐配置的三个单硝酸盐浓度下(10mm，20mm和40mm)的叶片稳定氮同位素值差异不显著，且在稳定氮同位素值为22.67
‰
硝酸盐配置的三个单硝酸盐浓度下(10mm，20mm和40mm)的叶片稳定氮同位素值差异也不显著。因此，在本实验中甘蓝型组培苗的δ
15
n
n1
就近似等于这三个单硝酸盐(稳定氮同位素值为8.08
‰
)浓度培养下叶片的稳定氮同位素值的平均值，δ
15
n
n1
＝
‑
3.17
‰
(n＝9)；甘蓝型组培苗的δ
15
n
n2
也近似等于这三个单硝酸盐(稳定氮同位素值为22.67
‰
)浓度培养下叶片的稳定氮同位素值的平均值，δ
15
n
n2
＝
‑
15.19
‰
(n＝9)。结合表4的δ
15
n
n1mix
和δ
15
n
n2mix
，利用方程就可以计算得到在混合氮源培养下甘蓝型油菜组培苗利用硝酸盐和铵盐的份额，其结果如表5所示。同时利用表4的δ
ct
数据，同时将δ
cs
(
‑
11.64
‰
)，δ
c
(
‑
28.05
‰
)带入方程：可以计算得到在混合氮源培养下甘蓝型油菜组培苗的自养和异养份额，其结果如表5所示。
[0087]
表5硝酸盐处理下油菜组培苗的硝酸盐利用份额(f
n
)和铵盐利用份额(f
a
＝1
‑
f
n
)；自养份额(f
at
)和异养份额(f
ht
)
[0088][0089]
注：培养基中的铵盐都为20mm。n＝3。
[0090]
依据表4和表5的叶片r、f
a
、f
n
、f
at
以及f
ht
，进而获得甘蓝型油菜组培苗在硝酸盐处理下的自养和异养效率；见表6。
[0091]
表6硝酸盐处理下甘蓝型油菜组培苗不同氮源的自养效率和异养效率
[0092][0093]
注：培养基中的铵盐都为20mm。n＝3。
[0094]
从表6可知，在培养基中铵盐都为20mm的情况下，随着硝酸盐浓度的增加，甘蓝型油菜组培苗的铵盐自养效率呈现逐渐上升的趋势，而铵盐的异养效率曾呈现逐渐下降的趋势，增加硝酸盐的供应有助于提高甘蓝型油组培苗的铵态氮自养效率。然而，随着硝酸盐的逐渐增加，硝酸盐的异养效率是逐渐降低的，而硝酸盐的自养效率曾呈现先增加后降低的趋势。考虑到硝酸盐和铵盐的最大自养效率有助于组培苗固定更多的无机碳，因此，在铵盐浓度为20mm，硝酸盐的浓度为10mm时，此时甘蓝型油菜组培苗的无机碳固定效率最高。
[0095]
实施例3：不同无机氮浓度下甘蓝型油菜组培苗不同氮源自养和异养效率的确定
[0096]
培养材料：无性系甘蓝型油菜组培苗
[0097]
培养基配方为：ms 6
‑
ba 2.0 mg/l naa 0.2mg/l，30g/l甘蔗蔗糖，琼脂：7.5g/l，ph值：5.8，培养室温度：25
±
2℃。光周期：12h/d，光照强度：50μmol
·
m
‑2·
s
‑1，甘蔗蔗糖的δ
13
c值δ
cs
为
‑
12.65
‰
；两种硝酸盐的稳定氮同位素值分别为：δ
15
n
01
＝8.08
‰
，δ
15
n
02
＝22.67
‰
。铵盐的稳定氮同位素值为：δ
15
n
a
＝
‑
2.64
‰
。按照本发明的方法，将铵盐分别与稳定氮同位素值为δ
15
n
01
和δ
15
n
02
的硝酸盐组成混合氮源，在配置培养基时，保证培养基中硝酸盐和铵盐的浓度比例为2：1，然后设置无机氮的浓度分别为20mm、40mm、60mm和80mm。将无性系甘蓝型油菜组培苗分别培养在上述培养基中，经过5周培养后，分别测定甘蓝型油菜组培苗叶片的c/n、δ
13
c值δ
ct
，以及在δ
15
n
01
的硝酸盐与铵盐组成混合氮源培养下的叶片稳定氮同位素值δ
15
n
n1mix
和在稳定氮同位素值为δ
15
n
02
的硝酸盐与铵盐组成混合氮源培养下叶片稳定氮同位素值δ
15
n
n2mix
。测定结果如表7所示：与此同时，将组培苗对应的种子播种在相应的培养基中，然后在该组培室中培养5周，最后测定新生叶片的δ
13
c值δ
c
，测定新生叶片的δ
13
c值δ
c
为
‑
28.05
‰
(n＝3)。
[0098]
表7不同无机氮浓度处理下甘蓝型油菜组培苗叶片的稳定碳氮同位素值和c:n
[0099][0100]
注：每个无机氮浓度下的硝酸盐和铵盐的浓度比例为2：1，n＝3。
[0101]
从表1可知，随着无机氮浓度的逐渐增加，甘蓝型油菜组培苗分别在铵盐与两种稳定氮同位素值差距较大的硝酸盐组成混合氮源培养下的叶片稳定氮同位素值都呈现先逐渐减小然后增大的趋势；甘蓝型油菜组培苗的叶片稳定碳同位素值则呈现逐渐减小的趋势。
[0102]
甘蓝型油菜组培苗在稳定氮同位素值为8.08
‰
硝酸盐配置的三个单硝酸盐浓度
下(10mm，20mm和40mm)的叶片稳定氮同位素值差异不显著，且在稳定氮同位素值为22.67
‰
硝酸盐配置的三个单硝酸盐浓度下(10mm，20mm和40mm)的叶片稳定氮同位素值差异也不显著。因此，在本实验中甘蓝型组培苗的δ
15
n
n1
就近似等于这三个单硝酸盐(稳定氮同位素值为8.08
‰
)浓度培养下叶片的稳定氮同位素值的平均值，δ
15
n
n1
＝
‑
3.17
‰
(n＝9)；甘蓝型组培苗的δ
15
n
n2
也近似等于这三个单硝酸盐(稳定氮同位素值为22.67
‰
)浓度培养下叶片的稳定氮同位素值的平均值，δ
15
n
n2
＝
‑
15.19
‰
(n＝9)。结合表7的δ
15
n
n1mix
和δ
15
n
n2mix
，利用方程就可以计算得到在混合氮源培养下甘蓝型油菜组培苗利用硝酸盐和铵盐的份额，其结果如表8所示。同时利用表7的δ
ct
数据，同时将δ
cs
(
‑
11.64
‰
)，δ
c
(
‑
28.05
‰
)带入方程：可以计算得到在混合氮源培养下甘蓝型油菜组培苗的自养和异养份额，其结果如表8所示。
[0103]
表8不同无机氮浓度处理下甘蓝型油菜组培苗的硝酸盐利用份额(f
n
)和铵盐利用份额(f
a
＝1
‑
f
n
)；自养份额(f
at
)和异养份额(f
ht
)
[0104][0105]
注：每个无机氮浓度下的硝酸盐和铵盐的浓度比例为2：1。n＝3。
[0106]
依据表7和表8的叶片r、f
a
、f
n
、f
at
以及f
ht
，进而获得甘蓝型油菜组培苗在不同无机氮浓度处理下的自养和异养效率；见表9。
[0107]
表9不同无机氮浓度处理下甘蓝型油菜组培苗不同氮源的自养效率和异养效率
[0108][0109]
注：每个无机氮浓度下的硝酸盐和铵盐的浓度比例为2：1，n＝3。
[0110]
从表9可以看出，随着无机氮浓度的增加，硝酸盐和铵盐的异养效率都在逐渐减小，且在最高无机氮浓度下获得最小的硝酸盐和铵盐的异养效率。铵盐的自养效率随着无机氮浓度的增加呈现逐渐下降的趋势，但在最高无机氮浓度下出现小幅度的回升；随着无机氮浓度的增加，硝酸盐的自养效率则呈现先增大后逐渐减小的趋势。从植物组织培养的角度出发，获取最大的硝态氮和铵态氮自养效率有利于提高无机氮的利用效率，因此，无机氮浓度为40mm(硝酸盐和铵盐的浓度比例为2：1)时，此时无机氮的自养效率最高。
[0111]
综上所述，本发明可以获得不同氮源配比下的硝态氮和铵态氮自养效率。从上述的结果中可知，高硝低铵有利于自养效率的提高，这与它们的不同代谢机制相吻合的，与实际也相符的。
[0112]
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。