纸基微流体二极管装置及可视化生物分子检测方法与流程

1.本发明涉及微流控芯片技术领域，尤其是一种基于喷墨打印技术制造的纸基微流体二极管装置及可视化生物分子检测方法。


背景技术：

2.二极管是电子电路中最基本的元件之一，能实现电流单向导通，对电子器件小型化发挥了重要作用。对于流体流动控制系统，同样是往微小型化发展，主要目标是把物理、生化反应、分析反应中的采样、稀释、反应、分离、检测等操作模块集成在几微米或者几十微米的芯片上让其自动进行。而实现这些操作的关键部件是流体二极管。在宏观尺度下，流体二极管的功能可以由具有运动部件的阀门实现。然而在微小尺度下，这些移动部件会增加制造成本，并出现不可靠、需要极高能量启动运行等问题。
3.现有技术中，微流体二极管主要是针对离子输运电流的控制，实现电流的整流效果。对于流体本身流动的控制，由于在微尺度下，对于流体特别是测试过程中所需的液体样品流动的有序控制很困难。所以，开发具有固定结构的微流体二极管实现流体定向流动对于微流控芯片发展具有重要意义。
4.微流控芯片检测技术主要有比色法、荧光法和电化学检测法等，荧光分析法是指利用某些物质被特定波长的光照射后进入激发态，当其由激发态恢复到基态时所产生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法。但目前荧光分析法通常采用紫外光最为激发光源，紫外光激发光组织穿透深度有限，不能有效激发深层组织信号分子，而且会受到生物体自发荧光干扰等，同时传统荧光法需要用荧光光度计或荧光分光光度计。而这些设备通常须在实验室使用，不易取且不易调试。


技术实现要素：

5.针对现有技术的缺陷，本发明提供一种纸基微流体二极管装置及可视化生物分子检测方法，目的在于实现流体流动的准确控制和准确测试。
6.本发明采用的技术方案如下：
7.一种纸基微流体二极管装置，包括正向滴液池和反向滴液池，所述正向滴液池和反向滴液池之间通过微流道相连；所述正向滴液池具有壁面一，所述壁面一与所述微流道一端垂直连接；所述反向滴液池具有对称设置的壁面二，所述壁面二与所述微流道另一端成α角连接，由正向滴液池向反向滴液池流动的液体在所述微流道中形成的流体接触角为θ，α与θ之和小于90度。
8.作为上述技术方案的进一步改进：
9.所述二极管装置由纸张上的疏水边界形成。
10.所述疏水边界为打印机喷出的疏水性墨水干燥后留下的疏水性屏障。
11.所述反向滴液池内设有发光材料层。
12.所述发光材料层通过向所述反向滴液池内滴加上转换纳米荧光材料溶液并干燥
后得到。
13.所述微流道的截面为矩形，其宽度为50μm。
14.所述正向滴液池为矩形槽，其宽度尺寸为10
‑
30mm。
15.一种利用纸基微流体二极管装置的可视化生物分子检测方法，所述二极管装置基于喷墨打印由亲水性纸张上的疏水边界打印形成，所述检测方法包括以下步骤：
16.将上转换纳米荧光材料溶液滴入反向滴液池，溶液充满反向滴液池和微流道，但不会流入正向滴液池：
17.待上转换纳米荧光材料溶液干燥后，用激光器照射所述反向滴液池并在黑暗条件下拍照，计算照片的总荧光强度；
18.向所述正向滴液池中加入待测样品溶液，样品溶液经微流道流入反向滴液池；
19.待样品溶液干燥后，用激光器照射所述反向滴液池并在黑暗条件下拍照，计算两次照片总荧光强度的变化，与标准曲线比对，得到生物分子的浓度。
20.本发明的有益效果如下：
21.本发明装置通过有效接触角的设计实现正、反方向不同的流动机制从而形成不同的启动压力，实现较大压力范围内的流体单向流动。压力范围的大小可以通过微流道的宽度尺寸和湿润性的控制来改变。
22.本发明装置构造简单、取材方便，微尺度下相比于同类其他使用微观表面修饰技术的制作方式，利用喷墨打印技术、采用纸类材质，来源丰富、可批量生产、可降解、便携、易操作，使制造难度、成本大幅下降。喷墨打印机的高精度决定了微流道可达到的最小宽度，微米级的打印精度可以将本装置的压力范围提升至几千帕左右。
23.本发明的生物分子测试方法采用微流体二极管装置，正向流动无需驱动力，无源自发的工作方式使流体流动更加可靠，能保证检测区的上转换材料浓度恒定，并通过纸基实现被检测目标物质的富集，大幅提高检测精度和速度。
附图说明
24.图1为本发明装置的一种形式的结构示意图。
25.图2为本发明装置的另一种形式的结构示意图。
26.图3为本发明装置的正向流通作用的工作原理示意图。
27.图4为本发明装置的方向无法流通作用的工作原理示意图。
28.图5为本发明生物分子检测方法所采用的具体装置结构示意图。
29.图6为本发明生物分子检测方法具体实施例的试验结果。
30.图中：1、正向滴液池；2、微流道；3、反向滴液池；4、疏水边界；11、壁面一；31、壁面二。
具体实施方式
31.以下结合附图说明本发明的具体实施方式。
32.本实施例的纸基微流体二极管装置，如图1和图2所示，包括正向滴液池1和反向滴液池3，正向滴液池1和反向滴液池3之间通过微流道2相连；正向滴液池1具有壁面一11，壁面一11与微流道2一端垂直连接；反向滴液池3具有对称设置的壁面二31，如图3所示，壁面
二31与微流道2另一端成α角连接，由正向滴液池1向反向滴液池3流动的液体在微流道2中形成的流体接触角为θ，α与θ之和小于90度。
33.上述实施例中，反向滴液池3形状具体可设置成如图1所示的“水滴状”，“水滴状”结构包括壁面二31和与壁面二31圆滑过渡连接的弧形边。反向滴液池3形状还设置成如图2所示的“喇叭状”或“漏斗状”。还可采用其他类似结构，只要满足壁面二31与微流道2之间的夹角为α即可。
34.由图3可知，α指的是微流道2的中心轴线(朝向反向滴液池3的流动方向)与壁面二31之间构成的锐角。上述实施例中，微流道2的截面为矩形，宽度(垂直于流向)为几十至几百微米。优选地，取50μm。
35.上述实施例中，正向滴液池1优选地为矩形槽，其宽度尺寸(即沿垂直微流道2的方向上的尺寸)为毫米级，取值10
‑
30mm。优选地，取15mm。
36.上述实施例的纸基微流体二极管装置，由亲水性纸张上的疏水边界4形成，疏水边界4内部形成的区域均为亲水区。上述纸张优选亲水性滤纸。
37.具体地，疏水边界4为打印机喷出的疏水性墨水干燥后留下的疏水性屏障。
38.疏水性墨水可采用永久性记号笔油墨与酒精的混合墨，混合墨水挥发后留下疏水性树脂和着色剂可作为疏水屏障。
39.具体地，疏水边界4的厚度为1mm。
40.上述实施例的纸基微流体二极管装置的工作方式：
41.正向滴液池1的流体能够自发地充满微流道2，顺利流向反向滴液池3，实现正向流动导通；反之，反向滴液池3的流体渗入微流道2，在流经微流道2的末端时，由于流体的表面张力阻碍，无法顺利流入正向滴液池1，即反向流动不导通。
42.上述实施例的纸基微流体二极管装置的工作原理：
43.渗透压力指流体从水槽进入并充满毛细管所需要的最小压力。释放压力指流体从较小截面尺寸的通道流出所需要的最小压力。计算所需最小压力的杨拉普拉斯方程如下：
44.p＝(
‑
2γcosθ)/h
ꢀꢀ
(1)
45.其中γ为流体的表面张力系数，h为流道宽度，θ是流体接触角；
46.本实施例的微流道2的截面尺寸(宽度、高度)设置成微米级别，目的是由于微流道2的渗透压和释放压决定二极管装置的单向流动的压降范围。微流道2的截面尺寸越小，流体表面张力影响越大。当宽度缩小至微米级别，微流道2渗透压和释放压的差别可达兆帕，大幅提高控制流体单向流动的压降范围，微流道2内壁为疏水性墨水构成的疏水壁。微流道2的截面宽度不能过大，至少能保证在一个大气压下，确保反向滴液池3中流体不能自发流入滴液池1。
47.工作时，由于正向与反向的流动机制不同导致正向与反向流动的激活压力不同。正向流动时，需要经过微流道2的渗入过程，可参考图3中正向导通过程的原理示意。根据公式(1)，θ＜90
°
，微流道2的渗入压力p
in
＜0，且由于有效接触角θ α＜90
°
，流体能自发顺着微流道2边缘进入反向滴液池3；而反向流动时，如图4所示，流体也需要渗入微流道2，在此基础上，当流体到达微流道2的末端，此时α＝90
°
，由于流体表面张力的阻碍，流体接触角会增加，有效接触角θ
*
大于90
°
，流体流动停止。只有进一步增加驱动压力，才能突破流体表面张力的束缚，从而实现反向导通。所以，反向导通的压力要远高于正向导通的压力。
48.本装置基于喷墨打印技术采用纸张制作，流体由亲水纤维素或硝化纤维素为导向，通过毛细作用从微通道2入口自动输运到期望的出口，正向工作无需驱动力。在微尺度下，流体在微流道2中的渗透压力与释放压力存在很大差距，因此可以实现流体在较大压力范围内的单向流动。
49.目前大多数家用打印机的打印精度也达到了微米级别，喷墨打印机的墨滴大小甚至可以达到1.5皮升，本实施例使用记号笔油墨与酒精的混合自制墨代替打印机原装墨进行打印，具体采用压电式喷墨打印机进行本实施例二极管装置的生产，具体的操作步骤如下：
50.i.撬开打印机内的新墨盒，取出海绵、过滤块，清水洗净，再用油墨清洗剂清洗一遍，清水洗净后干燥。并防止水或者清洗剂接触到芯片。
51.ii.将洗净干燥后的墨盒按原样拼装好，使用热熔胶将撬开的墨盒粘至完全密封。
52.iii.配置记号笔墨水，记号笔墨水与乙醇的体积比为1∶5。取记号笔墨水通过0.45μm滤膜过滤，并加入5倍体积的乙醇，置入烧杯搅拌均匀。
53.iv.用注射器吸入配置完成的墨水并注入墨盒中，注射速度要慢，以避免产生气泡溢出墨盒。注射完成后用胶带封闭注射口。
54.v.用该改装墨盒替换原装打印机墨盒。
55.vi.打印机自清洗。在打印机的进纸口，拨开进纸阻隔的装置，装入a4纸，根据屏幕提示打印喷嘴检查的图案并进行比对。
56.vii.用绘图软件(autocad)绘制二极管图案。
57.viii.更换whatman gradel滤纸(或者新华1号滤纸，提前裁剪成a4大小)，双面多次打印纸基微流道。将印刷后的滤纸风干15分钟，以蒸发掉乙醇。疏水性树脂和着色剂保留在滤纸中形成可见的疏水性屏障。
58.鉴于上述实施例的二极管装置的正、反向滴液池适合分别作为加样区域与检测区域，以下提供一种利用上述实施例的纸基微流体二极管装置进行可视化生物分子的检测方法，包括以下流程：
59.将上转换纳米荧光材料溶液滴入反向滴液池3，溶液能充满反向滴液池3和微流道2；
60.待上转换纳米荧光材料溶液干燥后，用激光器照射反向滴液池3并在黑暗条件下拍照，计算照片的总荧光强度；
61.向正向滴液池1中加入待测样品溶液，样品溶液顺利流入反向滴液池3；
62.待样品溶液干燥后，用激光器照射反向滴液池3并在黑暗条件下拍照，计算两次照片总荧光强度的变化，与标准曲线比对，即可得到生物分子的浓度。
63.具体试验装置及流程可参考图5，图中“纸基微流控芯片”即指上述实施例的纸基微流体二极管装置。可用808nm或980nm的近红外光作为激光器激发光源；采用负载滤光片的手机在黑暗条件下对激光器照射处进行拍照。滤光片可采用700nm短通滤波片。采用imagej等专业软件可快速计算荧光强度。根据淬灭的效率(两次总荧光强度的差值除以未加待样品的总荧光强度)可以计算出样片溶液中生物分子的浓度。
64.上转换纳米荧光材料可采用：nagdf4：yb，nd，er、nagdf4：er、nagdf4：yb，er@naybf4：nd、nayf4：yb，er，nd@nayf4：nd等。样品溶液中的生物分子能在550nm有吸收峰，包
括阿霉素、表阿霉素、米托蔥醌、柔红霉素、去甲基柔红霉素、花青素、多巴胺等。发射出550nm的可见光的上转换纳米荧光材料作为荧光探针，多巴胺、阿霉素等生物分子可定量淬灭上转换纳米发光荧光探针，从而达到快速、灵敏、可视化检测多巴胺、阿霉素等生物分子。
65.上述检测方法中，正向滴液池1、反向滴液池3分别作为加样区和检测区，在反向滴液池3滴加上转换纳米荧光材料溶液，该溶液充满反向滴液池3和微流道2，但由于二极管装置的整流工作机制，上转换纳米荧光材料溶液不会流入正向滴液池1。利用纸基二极管装置出色的整流特性，实现荧光法可视化定量检测生物分子，可以解决以下重要问题：
66.首先，上转换纳米荧光材料溶液可以定量滴加在反向滴液池3内并在该区域扩散，但是始终不能流进正向滴液池1区域，有效解决了检测区域与加样区域的自分离。其次，上转换纳米荧光材料溶液干燥后，在正向滴液池1加样品溶液，由于上述的负压(渗入压力p
in
＜0)作用，样品溶液可以自动地沿着微流道2流向检测区域即反向滴液池3，并在检测区域3扩散，与上转换材料充分混合并发生淬灭，并能使待测样品溶液富集。
67.上述实施例的纸基微流体二极管装置，可借助于喷墨打印大批量高效率地进行生产：
68.在反向滴液池3内设置发光材料层。发光材料层可通过提前向反向滴液池3内滴加上转换纳米荧光材料溶液并干燥后得到。
69.反向滴液池3内的区域提前加入等量且定量的上转换材料溶液，实验室实验或者野外现场检测中，可以直接取用，无需专业人员，可以像试纸一样使用，在加样区(正向滴液池1)滴加待测样品，拍照后发至云端计算荧光值得到生物分子浓度比例。
70.以下用具体实施方式可视化生物分子的检测方法做进一步说明：
71.检测不同浓度分别为100μm和200μm的阿霉素溶液(样品溶液)的总荧光强度变化。
72.手机摄像头参数设置为：1.85(焦距)，1000(感光度)，1/5(快门)，手机型号为小米11。
73.在反向滴液池3中滴加1μl浓度为1mg/ml的nayf4：yb，er，nd@nayf4：nd上转换材料溶液，待干燥后使用；
74.利用808nm激光器照射反向滴液池3，调整激光覆盖角度拍摄3次照片；
75.向正向滴液池1中滴加1μl样品溶液(100μm和200μm的阿霉素溶液)，等干燥后分别拍摄3次照片；
76.将拍摄的照片植入imagej进行总荧光强度计算。
77.三次测试的总荧光强度取平均值与淬灭效率比较如图6所示，总荧光淬灭效率与阿霉素浓度有线性关系与线性范围。随着阿霉素溶液浓度的滴加，上转换纳米荧光材料淬灭增加，总荧光强度随即降低，淬灭效率增加，本实验中淬灭效率分为达到了17.738％与23.697％。