五谷虫用于改善睡眠的新用途的制作方法

1.本发明涉及抗癌药五谷虫的新用途，具体地，是五谷虫或其提取物用于制备改善睡眠的 药物的用途。


背景技术：

2.失眠症是一种没有明显原因的入睡困难和/或持续感觉睡眠不足的病症，可能是由于多种 情绪和身体疾病所导致的。失眠是最常见的睡眠障碍，作为原发性病症或共存病症影响着数 百万人。睡眠障碍包括六大类：(1)失眠(insomnia)、(2)睡眠过度(hypersomnia)、(3)睡眠异常 (parasomnia)、(4)昼夜节律睡眠-觉醒障碍(circadianrhythm sleep-wake disorder)、(5)睡眠相关的 呼吸障碍(sleep-related breathing disorder)和(6)睡眠运动障碍(sleep movement disorder)。睡眠障 碍在患有该病症的人中产生明显的痛苦和/或功能障碍，需要恰当的治疗。
3.国际睡眠基金会针对老年人的调查数据显示，睡眠障碍与伴随人体老化的各种疾病呈正 相关，能增加诸如充血性心力衰竭、肾功能衰竭、慢性阻塞性肺疾病、脑卒中、帕金森病、 糖尿病等与年龄相关的慢性疾病的发病风险。失眠症的亚型有入睡困难型失眠、睡眠维持困 难型失眠、早醒型失眠以及心因性失眠，老年人中睡眠维持困难型和早醒型失眠较为常见。 根据睡眠障碍的病程，失眠症又可分为急性或短期失眠(病程＜1月)、持续性失眠(病程＞4周) 和慢性失眠(病程＞6月)。
4.现有技术中有多种药物通过多种机制来缓和睡眠。例如苯二氮类药物如劳拉西泮、替马 西泮等，巴比妥类药物如苯巴比妥、戊巴比妥等和z-药物如扎来普隆、唑吡坦、佐匹克隆等。 苯二氮类药物通过增加氯通道开放的频率来增强gaba。巴比妥类药物通过增加氯通道开放 的持续时间来增强gaba。z-药物是gabaaγ1亚基的激动剂。然而，这些药物通常半衰期 长且具有多种副作用，例如精神混乱、抑郁等，并且长期服用会产生高成瘾潜能。
5.五谷虫是丽蝇科昆虫大头金蝇或其他近缘昆虫的幼虫或蛹壳，虫体呈扁圆柱形，长 1-1.5cm，宽2-3mm，黄白色，有的略透明。五谷虫性寒、味甘、咸苦，五毒，入脾胃经，具 有健脾化食、去热消疳等功能。现有研究发现，五谷虫提取物能够杀灭大肠杆菌、金黄色葡 萄球菌等，具有广谱抗菌活性，还能够促进创面愈合、抗动脉粥样硬化、降血脂，对白血病 细胞、肺癌细胞、hiv-1整合酶等具有抑制活性。但未有五谷虫提取物能用于治疗失眠的相 关报道。
6.左亚叶酸钙又名左旋亚叶酸钙，通常作为抗肿瘤辅助药，与氟尿嘧啶合用以增强其疗效， 用于治疗胃癌、结肠癌、直肠癌等肿瘤，还可用于预防或治疗大剂量叶酸拮抗剂中毒，用于 预防或治疗叶酸缺乏所致的巨幼细胞性贫血。甲氨蝶呤等叶酸拮抗剂与二氢叶酸还原酶结合 而阻断叶酸向四氢叶酸的转化。左亚叶酸钙可以直接提供活性叶酸，具有解救过量的叶酸拮 抗剂在体内的毒性反应，有利于dtmp、dna、rna和蛋白质合成的作用。
7.本技术发明人经过多年研究，发现五谷虫提取物具有改善睡眠障碍、治疗失眠的良好作 用。更为值得一提的是，经由一次偶然性错误操作，发明人意外发现五谷虫提取物
和左亚叶 酸钙的组合物具有协同作用，能大大提高对于睡眠障碍特别是失眠的治疗效果。左亚叶酸钙 本身不具有改善睡眠的药理作用，但与五谷虫提取物联用，能显著增强五谷虫提取物对于改 善睡眠障碍、治疗失眠的活性，具体药理作用机制未明。


技术实现要素：

8.本发明的一个方面，提供了一种用于改善、预防和/或治疗睡眠障碍的药物组合物，包含 五谷虫或其提取物和左亚叶酸钙。
9.本发明的另一个方面，所述药物组合物，其中五谷虫提取物按照如下方法制备：
10.(1)人工养殖五谷虫冷冻干燥，粉碎后过筛，用二氧化碳流体超临界萃取，得到粗产物；
11.(2)向步骤1得到的粗产物中加入3％的蒸馏水，搅拌混合；离心分离，去除沉淀物， 得到脱胶油脂；
12.(3)向步骤2得到的脱胶油脂中加入氢氧化钠，搅拌，凝结，离心分离；向上清液中加 入蒸馏水，搅拌，静置，分离，重复1-3次，直到下层水加酚酞不变色即可；取上清液备用；
13.(4)对上清液用活性炭吸附剂脱色：活性炭添加量为4％，脱色温度为90℃，脱色时间 为90分钟，反复三次，即得五谷虫提取物。
14.本发明的另一个方面，所述药物组合物，其中五谷虫或其提取物和左亚叶酸钙的质量比 例为0.1-50:1，优选20:1、10:1或者5:1。
15.本发明的另一个方面，所述药物组合物，其包含药学上可接受的载体。
16.本发明的另一个方面，所述药物组合物，其为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂、滴鼻剂、 吸入剂、缓释剂、气雾剂或膜剂。
17.本发明的另一个方面，提供了所述药物组合物在制备预防和/或治疗睡眠障碍的药物中的 用途。所述睡眠障碍包括失眠。
18.本发明的另一个方面，提供了一种用于改善、预防和/或治疗睡眠障碍的药物，其中包含 五谷虫或其提取物。
19.本发明的另一个方面，提供了五谷虫或其提取物在制备预防和/或治疗睡眠障碍的药物中 的用途。
20.本发明的另一个方面，所述睡眠障碍是指失眠。
21.本发明的另一个方面，提供了一种五谷虫提取物的制备方法：
22.(1)人工养殖五谷虫冷冻干燥，粉碎后过筛，用二氧化碳流体超临界萃取，得到粗产物；
23.(2)向步骤1得到的粗产物中加入3％的蒸馏水，搅拌混合；离心分离，去除沉淀物， 得到脱胶油脂；
24.(3)向步骤2得到的脱胶油脂中加入氢氧化钠，搅拌，凝结，离心分离；向上清液中加 入蒸馏水，搅拌，静置，分离，重复1-3次，直到下层水加酚酞不变色即可；取上清液备用；
25.(4)对上清液用活性炭吸附剂脱色：活性炭添加量为4％，脱色温度为90℃，脱色时间 为90分钟，反复三次，即得五谷虫提取物。
26.发明详述
27.本技术发明人通过多年研究，发现五谷虫或其提取物对于预防和/或治疗睡眠障
碍(优选 失眠)具有有效的药理活性。进一步地，将五谷虫或其提取物与左亚叶酸钙以特定比例组合， 能够进一步增强改善睡眠障碍的活性，具有协同作用。
28.如非特殊说明，本技术所述计量单位为质量。
29.本发明的一个方面，提供了一种五谷虫或其提取物在制备预防和/或治疗睡眠障碍的药物 中的用途。
30.本发明的一个方面，提供了一种药物组合物，包含五谷虫或其提取物和左亚叶酸钙。
31.本发明的另一个方面，提供了所述药物组合物在制备预防和/或治疗睡眠障碍的药物中的 用途。
32.五谷虫提取物按照如下方法制备：
33.1.人工养殖五谷虫冷冻干燥，粉碎后过筛，用二氧化碳流体超临界萃取，得到粗产物。
34.2.向步骤1得到的粗产物中加入3％的蒸馏水，搅拌混合；离心分离，去除沉淀物，得 到脱胶油脂。
35.3.向步骤2得到的脱胶油脂中加入氢氧化钠，搅拌，凝结，离心分离。向上清液中加入 蒸馏水，搅拌，静置，分离，重复1-3次，直到下层水加酚酞不变色即可。取上清液备用。
36.4.对上清液用活性炭吸附剂脱色：活性炭添加量为4％，脱色温度为90℃，脱色时间为 90分钟，反复三次，即得五谷虫提取物。
37.本发明的另一个方面，所述五谷虫提取物在药物中的含量为0.1-99.9％。
38.本发明的另一个方面，所述药物包含五谷虫或其提取物和药学上可接收的载体。
39.本发明的另一个方面，所述药物为药学上可以使用的制剂形式。
40.本发明的另一个方面，所述药物组合物为药学上可以使用的制剂形式。
41.本发明的另一个方面，所述药物组合物中五谷虫或其提取物和左亚叶酸钙的质量比例为 0.1-50:1。
42.本发明的另一个方面，所述药物组合物中五谷虫或其提取物和左亚叶酸钙的质量比例为 1-30:1。
43.本发明的另一个方面，所述药物组合物中五谷虫或其提取物和左亚叶酸钙的质量比例为 2-25:1。
44.本发明的另一个方面，所述药物组合物中五谷虫或其提取物和左亚叶酸钙的质量比例为 20:1。
45.本发明的另一个方面，所述药物组合物中五谷虫或其提取物和左亚叶酸钙的质量比例为 10:1。
46.本发明的另一个方面，所述药物组合物中五谷虫或其提取物和左亚叶酸钙的质量比例为 5:1。
47.本发明的另一个方面，所述制剂形式包括片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂、滴鼻剂、吸入 剂、缓释剂、气雾剂、膜剂等。
48.本发明的另一个方面，五谷虫或其提取物和左亚叶酸钙的组合是“用于同时、分别或依 次使用的联合剂或药物组合物”，尤其指的是一种“组分包”，意思是五谷虫或其提取物和左 亚叶酸钙可各自独立地施用或通过具有不同组分含量的不同固定组合施用，即在
不同时间点 或同时施用。组分包的组分可例如同时施用或按时间顺序间隔施用，即在不同时间点且以相 同或不同的时间间隔施用组分包的任意组分。优选地，所选择的时间间隔应使联合使用组分 对所治疗疾病或病症的效果高于仅使用任何单独的组分所获得效果。
49.术语“预防”指的是向健康患者预防性地施用所述组合以防止此处所述的疾病和病症发 生。此外，术语“预防”还可以指向处于待治疗疾病前期的患者预防性施用所述组合。
50.治疗有效量的本发明组合中每种组分可以同时或以任何依次使用，并且所述组分可分别 施用或作为固定组合施用。组合中的单个组分可以在治疗期间的不同时间分别施用或者以分 开的或单一的组合形式并施用。此外，术语“使用”还包括使用可在体内转化为所选择的药 物的任何药物的前药。因此，应将本发明理解为包括所有这些同时或交替治疗的方案，并应 相应地对术语“使用”进行解释。
51.本发明剂量形式的优选施用途径为经肠内或优选口服途径。由于施用方便，片剂和胶囊 代表了最佳的口服剂量单位形式。
52.组合治疗中所使用的每种活性成分的有效剂量可以随所使用的具体的药物组合物、使用 方式或所治疗病症的严重程度而变化。
53.本发明药物所使用的药学上可接收的载体包括填充剂、稀释剂、赋形剂、稳定剂、抗氧 剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、着色剂等。
54.优选地，填充剂选自淀粉、预交化淀粉、糊精、壳聚糖、甘露糖、微晶纤维素、聚酸酐 类、聚磷酸酯类、聚氨酯类、纤维蛋白、脂质体、聚乙二醇、半乳糖、聚维酮中的至少一种。
55.优选地，稀释剂选自甘露醇、微晶纤维素、乳糖、淀粉、糖精中的至少一种。
56.优选地，稳定剂选自环糊精及其衍生物、聚乙二醇、吐温、司盘、右旋糖苷、甘露醇中 的至少一种。
57.优选地，抗氧剂选自维生素c、焦亚硫酸钠、安息香酸、枸橼酸盐、山梨酸、亚硫酸钠、 亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠中的至少一种。
58.优选地，崩解剂选自交联羧甲纤维素钠、交联聚维酮、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、聚 山梨酯80、十二烷基硫酸钠等。
59.优选地，粘合剂选自羟丙基甲基纤维素、聚维酮、淀粉、糊精、微晶纤维素、海藻酸钠、 甲基纤维素等。
60.优选地，润滑剂选自硬脂酸、硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠等。
61.优选地，防腐剂选自苯甲酸、尼泊金、山梨酸、乙醇等。
具体实施方式
62.实施例1：五谷虫提取物的制备
63.按照下述方法制备得到五谷虫提取物：
64.1.人工养殖五谷虫冷冻干燥，粉碎后过60目筛，用二氧化碳流体超临界萃取，萃取参 数为压力25mpa，温度50℃，co2流量25l/h，萃取2小时，得到粗产物。
65.2.将步骤1得到的粗产物加热至80℃，加入粗产物体积3％的80℃的蒸馏水，搅拌30 分钟，充分混合；5000r/min离心分离，去除沉淀物，得到脱胶油脂。
66.3.取步骤2得到的脱胶油脂，加热至60℃，加入0.3％(w/w)的氢氧化钠，搅拌1小
时， 出现细小的皂化物，升温至80℃，出现絮状物，凝结，5000r/min离心分离。取上清液，加 热至80℃，加入上清液体积30％的80-85℃的蒸馏水，搅拌30分钟，静置，用分液漏斗分离， 上清液再次加热加水搅拌静置，测分离出的下层水的ph值，重复3次，下层水加酚酞不变 色即可。取上清液备用。
67.4.吸附剂脱色：添加上清液体积4％的活性炭，脱色温度为90℃，脱色时间为90分钟， 反复三次，即得五谷虫提取物。
68.实施例2：改善睡眠障碍药理试验
69.1.试验方法
70.icr小鼠60只，雄性，重量18～22g，6-8周龄。动物置于室温(22
±
1)℃，相对湿 度65％及正常昼夜节律调节光照时间环境下，食用标准饲料，自由饮水。
71.本实验采用跑台力竭训练结合腹腔注射pcpa(对氯苯丙氨酸)造成虚劳失眠模型，探 究五谷虫提取物改善虚劳失眠模型小鼠的睡眠功能。
72.除空白组外，其他组小鼠进行30min的小鼠跑台力竭训练(25m/min)，每天1次，连续 7天。第8天腹腔注射pcpa(250mg/kg)混悬液，注射药物后，小鼠出现挛缩疼痛，持续 30～60min后症状缓解。依据小鼠体征变化和测定指标评价模型成功与否。造模2天后， 小鼠出现睡眠紊乱，易惊觉，行动迟缓，表明虚劳失眠模型造型成功。
73.将80只小鼠，按随机原则，分为8组，每组10只，即空白组、模型组、五谷虫提取 物组、左亚叶酸钙组、五谷虫提取物 左亚叶酸钙组1-3、阳性对照组。五谷虫提取物组 (40mg/kg)，左亚叶酸钙组(4mg/kg)，五谷虫提取物 左亚叶酸钙1组(20mg/kg 1mg/kg)， 五谷虫提取物 左亚叶酸钙2组(20mg/kg 2mg/kg)、五谷虫提取物 左亚叶酸钙3组 (20mg/kg 4mg/kg)分别灌胃。空白组、模型组分别以相同体积蒸馏水灌胃，阳性对照药 为地西泮，小鼠给药剂量为0.75mg/kg。以上各组灌胃，每日1次，连续15d。
74.每组小鼠观察进食量/d、体重、精神、活动、体态、毛发及检测血清5-ht、da和acth 含量。治疗第15d，各组小鼠禁食12h，断头取血。血液4℃放置90min，以3500r/min转速 离心10min，取血清，-20℃冰箱保存，待测。采用血清用酶联免疫分析法(elisa)测定血清 5-ht、da和acth含量。
75.2.实验结果。
76.1.小鼠体征变化。
77.给药后，五谷虫提取物组、五谷虫提取物 左亚叶酸钙1-3组、阳性对照组灌胃后小鼠 食量开始恢复正常，体重不同程度增加，行动逐步正常，身体舒展，毛色有光泽，皮肤黏 膜粉红，与正常小鼠比较无差别，小鼠睡眠节律恢复正常。
78.模型组、左亚叶酸钙组小鼠仍然睡眠紊乱、毛色枯燥、行动迟缓，无明显改善。
79.2.对血清5-ht、da和acth水平的影响
80.表1.对血清5-ht、da和acth水平的影响
81.[0082][0083]
由表1可知，与空白组比较，模型组小鼠血清5-ht、da和acth水平显著性降低 (p<0.01)，表明造模成功；与模型组比较，五谷虫提取物组、五谷虫提取物 左亚叶酸钙1-3 组、阳性对照组均能显著升高5-ht、da和acth(p<0.01)，表明对于治疗小鼠睡眠障碍有 效。
[0084]
实施例3采用改善睡眠功能检验方法评价改善睡眠功能
[0085]
1.实验方法
[0086]
icr小鼠120只，雄性，重量18～22g，6-8周龄。动物置于室温(22
±
1)℃，相对湿 度65％及正常昼夜节律调节光照时间环境下，食用标准饲料，自由饮水。
[0087]
将60只小鼠用于直接睡眠实验，60只小鼠用于巴比妥钠睡眠潜伏期实验。每个实验将 动物随机分为五谷虫提取物组、左亚叶酸钙组、五谷虫提取物 左亚叶酸钙1-3组和阴性对 照组，每组10只动物。各组药物用量如实施例2，经口灌胃，阴性对照组给予等量蒸馏水， 每日灌胃1次，连续30d。
[0088]
按照卫生部《保健食品检验与评价技术规范》方法进行。改善睡眠功能检验包括：直 接睡眠实验和巴比妥钠睡眠潜伏期实验。
[0089]
(1)直接睡眠实验：观察给药组动物给予受试样品后，阴性对照组给予同体积蒸馏水 后，是否出现睡眠现象。睡眠以翻正反射消失为指标。如超过30-60s不能翻正者，即认为 翻正反射消失，进入睡眠。翻正反射恢复即为觉醒，翻正反射消失至恢复这段时间为动物 睡眠时间。记录阴性对照组与给药组入睡动物数及睡眠时间。
[0090]
(2)巴比妥钠睡眠潜伏期实验：做正式实验前先进行预实验，确定使动物100％入睡， 但又不使睡眠时间过长的巴比妥钠的剂量，用此剂量正式实验。动物末次给药15min后， 给各组动物腹腔注射巴比妥钠(该实验剂量为：280mg/kgbw)，注射量为0.1ml/10g bw， 以翻正反射消失为指标，观察受试样品对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响。
[0091]
2.实验结果。
[0092]
(1)直接睡眠作用。
[0093]
给药后，各组小鼠表现出了安静、自主活动减少等症状，个别小鼠进入睡眠状态，特 别是五谷虫提取物 左亚叶酸钙联合给药组睡眠小鼠较多，表明联合给药具有促睡眠作用。
[0094]
表2.对小鼠直接睡眠作用的影响
[0095][0096]
(2)对戊巴比妥钠睡眠时间的影响。
[0097]
在戊巴比妥钠的催眠作用下，各给药组小鼠的睡眠时间均比阴性对照组延长，其中联 合给药组与阴性对照组具有显著性差异(p<0.01)，提示该样品具有延长戊巴比妥钠睡眠时间 的作用。
[0098]
表3.对戊巴比妥钠睡眠时间的影响
[0099]
分组小鼠数量(只)睡眠时间(min)阴性对照组1019五谷虫提取物组1028左亚叶酸钙组1018五谷虫提取物 左亚叶酸钙1组1037五谷虫提取物 左亚叶酸钙2组1045五谷虫提取物 左亚叶酸钙3组1046
[0100]
3.结论
[0101]
(1)五谷虫提取物、五谷虫提取物 左亚叶酸钙组合物能够有效地促进小鼠睡眠，延长 戊巴比妥钠睡眠时间。特别是五谷虫提取物 左亚叶酸钙联合给药组能够显著促进和延长小鼠 睡眠，与单独使用五谷虫提取物相比具有协同作用。
[0102]
(2)单独使用左亚叶酸钙无促睡眠作用，但是左亚叶酸钙能够显著增强五谷虫提取物的 促睡眠效果。
[0103]
(3)五谷虫提取物和左亚叶酸钙的组合物的促睡眠协同效果不具有剂量依赖性。
[0104]
实施例3：片剂的制备
[0105]
五谷虫提取物
ꢀꢀꢀ
60g
[0106]
左亚叶酸钙
ꢀꢀꢀꢀꢀ
3g
[0107]
取上述活性成分，加入制备片剂的常规辅料适量，混匀，常规压片机制成1000片。
[0108]
实施例4：片剂的制备
[0109]
五谷虫提取物
ꢀꢀꢀ
50g
[0110]
左亚叶酸钙
ꢀꢀꢀꢀꢀ
5g
[0111]
取上述活性成分，加入制备片剂的常规辅料适量，混匀，常规压片机制成1000片。
[0112]
实施例5：胶囊剂的制备
[0113]
五谷虫提取物
ꢀꢀꢀ
50g
[0114]
左亚叶酸钙
ꢀꢀꢀꢀꢀ
10g
[0115]
取上述活性成分，加入制备胶囊剂的常规辅料适量，混匀，装胶囊制成1000片。