腺相关病毒对CLN6多核苷酸的递送的制作方法

腺相关病毒对cln6多核苷酸的递送
1.本技术要求于2019年2月4日提交的美国临时专利申请第62/800,915号、于2019年7月30日提交的美国临时专利申请第62/880,641号、于2019年7月31日提交的美国临时专利申请第62/881,151号、于2019年10月9日提交的美国临时专利申请第62/912,977号和于2019年10月18日提交的美国临时专利申请第62/923,125号的优先权权益，所有这些申请均通过引用整体并入本文。
2.序列表通过引用并入
3.本技术含有作为公开的单独部分的计算机可读形式的序列表(文件名：53894_seqlisting.txt；24,923字节
‑
于2020年1月31日创建的ascii文本文件)，所述申请通过引用整体并入本文。
技术领域
4.本公开涉及重组腺相关病毒(raav)对蜡样脂褐质沉积症神经元6(cln6)多核苷酸的递送。本公开提供了raav和使用raav对神经元蜡样脂褐质沉积症(ncl)或cln6型巴藤病(cln6
‑
batten disease)进行cln6基因疗法的方法。


背景技术：

5.神经元蜡样脂褐质沉积症(ncl)是一组严重的神经退行性疾病，其被统称为巴藤病。这些疾病影响神经系统并且通常导致例如运动和思考能力的恶化问题。不同的ncl以其遗传原因为特征。
6.cln6型巴藤病可以以两种不同的形式出现：变异的晚期婴儿(vlincl)，更常见的形式，和成人发作的ncl(也称为a型库夫斯病)(cannelii等人，《生物化学与生物物理学研究通讯(biochem biophys res commun.)》2009；379(4)：892
‑
7，arsov等人，《美国人类遗传学期刊(am j hum genet.)》2011；88(5)：566
‑
73)。对于vlincl(此处称为cln6型巴藤病)，发病年龄为18个月至六岁，并且死亡通常发生在12岁到15岁。cln6型巴藤病最初表现为儿童早期语言受损和运动/认知发育迟缓，大多数患者在疾病发作后四年内只能坐在轮椅上(canafoglia等人，《神经病学(neurology)》2015；85(4)：316
‑
24)。疾病进展包含视力丧失、严重运动缺陷、复发性癫痫发作、痴呆和其它神经退行性症状。
7.cln6是311个氨基酸的蛋白质，具有七个预测的跨膜结构域，并且主要定位于内质网。与其它cln蛋白一样，其确切功能仍不清楚；然而，它涉及细胞内运输和溶酶体功能。目前在cln6中存在超过70种特征性致病突变(warrier等人，《生物化学与生物物理学报(biochimica et biophysica acta.)》2013；1832(11)：1827
‑
30)这些突变中的大多数导致cln6蛋白的完全丧失或产生被认为高度不稳定和/或无功能的截短的cln6蛋白产物。已经描述了几种天然存在的cln6型巴藤病动物模型；这些包含绵羊、犬和小鼠模型。在cln6
nclf
小鼠模型中发现的自发突变(在本文中称为“cln6
nclf
小鼠”)概括了所述疾病的许多病理和行为方面(morgan等人，《公共科学图书馆期刊(plos one)》2013；8(11)：e78694)。cln6
nclf
小鼠含有额外的胞嘧啶插入(c.307insc，p102后的移码)，导致提前终止密码子与cln6型巴
藤病患者中常见的突变同源(gao等人，《美国人类遗传学期刊》2002；70(2)：324
‑
35，wheeler等人，《美国人类遗传学期刊》2002；70(2)：537
‑
42)。
8.目前，没有可以逆转cln6型巴藤病症状的疗法。因此，本领域仍然有治疗cln6型巴藤病的需求。


技术实现要素：

9.本文提供了使用重组aav进行cln6基因疗法的方法和产品。
10.本文提供了编码cln6多肽的重组腺相关病毒9(raav9)，其包括raav9基因组，所述raav9基因组以5
′
到3
′
的顺序包括：杂交鸡β
‑
肌动蛋白(cb)启动子和编码所述cln6多肽的多核苷酸。在一些情况下，所述raav9基因组包括自身互补型基因组。可替代地，所述raav9基因组包括单链基因组。
11.提供了自身互补型重组腺相关病毒9(scaav9)，其编码seq id no：1中所示的cln6多肽，其中所述scaav9的基因组以5
′
到3
′
的顺序包括：第一aav末端反向重复；包括seq id no：3的序列的杂交鸡β
‑
肌动蛋白(cb)启动子；编码seq id no：2中所示的cln6多肽的多核苷酸；以及第二aav末端反向重复。编码所述cln6多肽的所述多核苷酸可以与seq id no：2至少90％一致。
12.还提供了具有以5
′
到3
′
的顺序包括以下的基因组的scaav9：第一aav末端反向重复；cmv增强子；杂交鸡β
‑
肌动蛋白启动子(cb)；sv40内含子；编码seq id no：1的cln6多肽的多核苷酸；以及第二aav末端反向重复；具有以5
′
到3
′
的顺序包括以下的基因组的scaav9：第一aav末端反向重复；包括seq id no：3的序列的cb启动子；编码seq id no：1的cln6多肽的多核苷酸；牛生长激素多腺苷酸化poly a序列；以及第二aav末端反向重复；以及具有包括seq id no：4的核酸序列中示出的基因盒的基因组的scaav9。
13.还提供了具有以5
′
到3
′
的顺序包括以下的基因组的ssaav9：第一aav末端反向重复；cmv增强子；杂交鸡β
‑
肌动蛋白启动子(cb)；sv40内含子；编码seq id no：1的cln6多肽的多核苷酸；以及第二aav末端反向重复；具有以5
′
到3
′
的顺序包括以下的基因组的ssaav9：第一aav末端反向重复；包括seq id no：3的序列的cb启动子；编码seq id no：1的cln6多肽的多核苷酸；牛生长激素多腺苷酸化poly a序列；以及第二aav末端反向重复；或具有包括seq id no：4的核酸序列中示出的基因盒的基因组的ssaav9。
14.seq id no：4所示的核酸序列是图1a中提供的基因盒。提供了包括scaav9基因组或ssaav9基因组的raav9，其包括与seq id no：4的核酸序列至少90％一致、与seq id no：4的核酸序列至少95％一致、或与seq id no：4的核酸序列至少98％一致的核酸序列。
15.进一步提供了核酸分子，其包括：第一aav末端反向重复；包括seq id no：3的核酸序列的cb启动子；编码seq id no：1的cln6多肽的核酸序列；以及第二aav末端反向重复。在一些实施例中，编码所述cln6多肽的所述多核苷酸可以与seq id no：2的所述核酸序列至少90％一致。
16.还提供了包括以下的核酸分子：第一aav末端反向重复；包括seq id no：3的核苷酸序列的cb启动子；sv40内含子；编码seq id no：1的所述cln6多肽的核酸序列；以及第二aav末端反向重复。另外，进一步提供了核酸分子，其包括：第一aav末端反向重复；包括seq id no：3的核苷酸序列的cb启动子；编码seq id no：1的所述cln6多肽的核酸；bgh poly
‑
a
序列；以及第二aav末端反向重复。在提供的任何多核苷酸中，cln6多肽可以由与seq id no：2的核酸序列至少90％一致的核酸序列编码。
17.提供了具有scaav基因组或ssaav基因组的raav，其中所述基因组包括与seq id no：4的核酸序列至少90％一致、或与seq id no：4的核酸序列至少95％一致、或与seq id no：4的核酸序列至少98％一致的核酸序列。
18.提供的raav可以包括本文公开的任何多核苷酸。另外，提供了包括任何公开的核酸的病毒颗粒。还提供了具有自身互补型或单链基因组的raav。
19.还提供了编码cln6多肽的重组腺相关病毒9(raav9)病毒颗粒，其包括raav9基因组，所述raav9基因组以5
′
到3
′
的顺序包括：包括与seq id no：6至少90％一致的核酸序列的cmv增强子；包括与seq id no：3至少90％一致的核酸序列的cb启动子；以及编码cln6多肽的与seq id no：1的氨基酸序列至少90％一致的多核苷酸。在一些实施例中，提供的raav9病毒颗粒包括自身互补型基因组。可替代地，提供的raav9病毒颗粒包括单链基因组。
20.进一步提供了raav9病毒颗粒，其中raav9基因组以5
′
到3
′
的顺序包括：第一aav末端反向重复；包括与seq id no：6至少90％一致的核酸序列的所述cmv增强子；包括与seq id no：3至少90％一致的核酸序列的所述cb启动子；编码cln6多肽的与seq id no：1的所述氨基酸序列至少90％一致的所述多核苷酸；以及第二aav末端反向重复。提供的raav9颗粒包括编码cln6多肽的多核苷酸，其包括与seq id no：1至少90％一致的氨基酸序列。任何raav9病毒颗粒可以任选地进一步包括sv40内含子和/或bgh poly
‑
a序列。
21.在另外的实施例中，raav9病毒颗粒包括aav9基因组，所述aav9基因组包括与seq id no：4的序列至少90％一致、与seq id no：4的核酸序列至少95％一致、或与seq id no：4的核酸序列至少98％一致的核酸序列。
22.在所提供的任何raav、ssaav或scaav中，aav末端反向重复可以是aav2末端反向重复。
23.还提供了核酸分子，其包括raav9基因组，所述raav9基因组以5
′
到3
′
的顺序包括：第一aav末端反向重复；包括与seq id no：6至少90％一致的核酸序列的cmv增强子；包括与seq id no：3至少90％一致的核酸序列的cb启动子；以及编码cln6多肽的与seq id no：1的所述氨基酸序列至少90％一致的多核苷酸。所提供的核酸分子包括自身互补型基因组和/或单链基因组。
24.进一步提供了核酸分子，其包括raav9基因组，所述raav9基因组以5
′
到3
′
的顺序包括：第一aav末端反向重复；包括与seq id no：6至少90％一致的核酸序列的所述cmv增强子；包括与seq id no：3至少90％一致的核酸序列的所述cb启动子；编码cln6多肽的与seq id no：1的所述氨基酸序列至少90％一致的所述多核苷酸；以及第二aav末端反向重复。所提供的核酸分子可以包括编码cln6多肽的多核苷酸，其包括与seq id no：1的氨基酸序列至少90％一致的氨基酸序列。另外，所述核酸分子可以包括aav9基因组，所述aav9基因组包括与seq id no：4的序列至少90％一致、与seq id no：4的核酸序列至少95％一致、或与seq id no：4的核酸序列至少98％一致的核酸序列。提供的任何核酸分子任选地进一步包括sv40内含子和/或bgh poly
‑
a序列。
25.进一步提供了包括以下的组合物：本文所描述的scaav9、本文所描述的核酸分子或本文所描述的raav病毒颗粒以及至少一种药学上可接受的赋形剂。在一些情况下，所述
药学上可接受的赋形剂包括非离子低渗透化合物、缓冲液、聚合物、盐或其组合。在一些实施例中，所述聚合物是共聚物。在一些实施例中，所述共聚物是泊洛沙姆。例如，所述组合物可以至少包括药学上可接受的赋形剂，其包括非离子低渗透化合物。例如，所述药学上可接受的赋形剂可以包括约20％到40％的非离子的、低渗化合物或约25％到约35％非离子低渗透化合物。一种示例性组合物包括配制在20mm的tris(ph为8.0)、1mm的mgcl2、200mm的nacl、0.001％泊洛沙姆188和约25％到约35％的非离子低渗透化合物的scaav。另一种示例性组合物包括：在包括0.001％普郎尼克f68的1
×
pbs中配制的scaav。
26.仍进一步提供了治疗受试者的cln6型巴藤病的方法，所述方法包括：向受试者施用包括治疗有效量的以下各项的组合物：本文公开的任何raav9、本文公开的任何scaav9、本文公开的任何ssaav、本文所描述的任何核酸分子或本文所描述的任何组合物。
27.本公开还提供了治疗有效量的本文公开的任何raav9、本文公开的任何scaav9、本文公开的任何ssaav、本文所描述的任何核酸分子或本文所描述的任何组合物用于制备用于治疗cln6型巴藤病的药物的用途。
28.还提供了用于治疗cln6型巴藤病的组合物，所述组合物包括治疗有效量的本文公开的任何raav9、本文公开的任何scaav9、本文公开的任何ssaav、本文所描述的任何核酸分子或本文所描述的任何组合物。
29.在所提供的用于治疗cln6型巴藤病的任何方法、用途或组合物中，所述组合物、raav9、scaav9或ssaav和/或核酸分子通过选自由以下组成的组的途径施用：鞘内、脑室内、脑实质内、静脉内和其组合。
30.通过鞘内途径施用的scaav9、ssaav或raav9的示例性剂量是约1
×
10
11
vg的所述scaav、ssaav或raav9病毒颗粒到约1
×
10
15
vg的所述scaav或aav9病毒颗粒；或约1
×
10
12
vg的所述scaav、ssaav或raav9病毒颗粒到约1
×
10
14
vg的所述scaav、ssaav或aav9病毒颗粒。例如，可以将约1
×
10
13
vg的所述scaav、ssaav或raav9病毒颗粒施用于受试者；或者可以将约1.5
×
10
13
的所述scaav、ssaav或raav9病毒颗粒施用于受试者；或者可以将约6
×
10
13
vg的所述scaav、ssaav或raav9病毒颗粒施用于受试者。
31.与治疗前的受试者或未治疗的cln6型巴藤病患者相比，本文公开的用于治疗cln6型巴藤病的方法、用途或组合物使受试者得到以下中的一种或多种：(a)自发荧光储存材料的溶酶体积累减少或减缓，(b)atp合成酶亚单位c的溶酶体积累减少或减缓，(c)胶质细胞活化(星形胶质细胞和/或小胶质细胞)活化减少或减缓，(d)星形细胞增生减少或减缓，(e)通过mri测量的脑量损失减少或减缓，(f)癫痫发作减少或减缓，以及(g)稳定、进展减少或用于评估cln6型巴藤病进展和/或改善的量表，例如统一巴藤病评定系统(ubdrs)评估量表、汉堡运动(hamburg motor)和语言量表或马伦早期学习量表(mullen scales of early learning)中的一个或多个提高。在施用本文公开的raav9、ssaav9病毒颗粒或scaav或核酸分子后，受试者可以保持在特伦德伦伯格位置。
32.仍进一步提供了治疗有需要的患者的cln6疾病的方法，所述方法包括将包括以下的组合物递送到有需要的患者的脑或脊髓：本文提供的公开的任何一种raav病毒颗粒、本文公开的任何scaav9、本文公开的任何ssaav9、本文所描述的任何核酸分子或本文所描述的任何组合物。
33.另外，本公开提供了本文提供的公开的任何一种raav病毒颗粒、本文公开的任何
scaav9、本文公开的任何ssaav9、本文所描述的任何核酸分子或本文所描述的任何组合物用于制备用于将所述ssaav9、核酸分子或组合物递送到有需要的患者的脑或脊髓的药物的用途。
34.还提供了用于将所述ssaav9、核酸分子或组合物递送到有需要的患者的脑或脊髓的组合物，所述组合物包括本文提供的公开的任何一种raav病毒颗粒、本文公开的任何scaav9、本文公开的任何ssaav9、本文所描述的任何核酸分子或本文所描述的任何组合物。
35.在所提供的任何方法、用途或组合物中，所述组合物可以通过鞘内、脑室内、脑实质内或静脉内注射或其组合来递送。所提供的任何方法进一步包括在鞘内注射本文公开的组合物、raav9、ssaav9或scaav或核酸分子后将患者置于特伦德伦伯格位置。
36.在所提供的任何方法、用途或组合物中，所述组合物或药物可以包括非离子低渗透造影剂。例如，所述组合物可以包括非离子低渗透造影剂，其中所述非离子低渗透造影剂选自由以下组成的组：碘比醇、碘海醇、碘美普尔、碘帕醇、碘喷托、碘普胺、碘佛醇、碘昔兰和其组合。
37.施用的所述组合物或药物可以包括药学上可接受的赋形剂。例如，所述药学上可接受的赋形剂可以包括约20％到40％的非离子低渗透化合物或约25％到约35％的非离子低渗透化合物。示例性组合物包括配制在20mm的tris(ph为8.0)、1mm的mgcl2、200mm的nacl、0.001％泊洛沙姆188和约25％到约35％的非离子低渗透化合物的scaav。另一种示例性组合物包括配制在1x pbs和0.001％普郎尼克f68中的scaav。
38.在所提供的任何方法、用途或组合物中，可以将组合物或药物递送到脑或脊髓，可以将组合物或药物递送到脑干、或可以将其递送到小脑、可以将其递送到视觉皮层、或可以将其递送到运动皮层。进一步地，在所提供的任何方法中，可以将所述组合物或药物递送到脑或脊髓，可以将所述组合物递送到神经细胞、神经胶质细胞或两者。例如，其中所述递送到所述脑或脊髓包括递送到神经系统的细胞，如神经元、下运动神经元、小神经胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、施万细胞或其组合。
39.与治疗前的受试者相比或与未治疗的cln6型巴藤病受试者相比，本文公开的方法、用途或组合物使受试者得到以下中的一种或多种：(a)自发荧光储存材料的溶酶体积累减少或减缓，(b)atp合成酶亚单位c的溶酶体积累减少或减缓，(c)胶质细胞活化(星形胶质细胞和/或小胶质细胞)活化减少或减缓，(d)星形细胞增生减少或减缓，(e)通过mri测量的脑量损失减少或减缓，(f)癫痫发作减少或减缓，以及(g)稳定、进展减少或用于评估cln6型巴藤病进展和/或改善的量表，例如统一巴藤病评定系统(ubdrs)评估量表、汉堡运动和语言量表或马伦早期学习量表(msel)中的一个或多个提高。
40.在本文所描述的任何方法、组合物和用途中，所述治疗、组合物或药物稳定或减缓cln
‑
6型巴藤病的疾病进展。具体地，疾病进展是用ubdrs量表、汉堡运动和语言量表、使用儿科生活质量(pedsqol)量表的治疗对生活质量的影响、马伦早期学习量表(msel)、延长的存活潜力或其组合来评估的。
41.在本文所描述的任何方法、用途或组合物中，与未治疗的cln6型巴藤病患者相比，所述治疗、组合物或药物减少或减缓cln
‑
6型巴藤病的一种或多种症状，所述症状选自：(a)脑量丧失；(b)认知功能丧失；以及(c)语言发展迟缓。具体地，所述治疗稳定或减缓cln
‑
6型巴藤病的疾病进展。例如，疾病进展是用ubdrs量表、汉堡运动和语言量表、使用儿科生活质
量(pedsqol)量表的治疗对生活质量的影响、马伦早期学习量表(msel)、延长的存活潜力或其组合来评估的。
42.在本文所描述的任何方法、用途或组合物中，受试者的年龄为80个月或以下、75个月或以下、70个月或以下、65个月或以下、62个月或以下、60个月或以下、55个月或以下、50个月或以下或者40个月或以下。
43.鉴于cln6型巴藤病没有有效的治愈方法，cln6
nclf
小鼠模型用于测试通过腺相关病毒(aav)介导的基因疗法引入功能性人类cln6的功效。本文提供的临床前结果表明，使用aav
‑
血清型9允许在整个cns中有效表达人类cln6蛋白，其中最受影响的细胞位于cns中。为了评估在较大的动物模型中治疗的安全性，通过鞘内腰椎csf注射给三只四岁的食蟹猴(cynomolgus macaques)施用scaav9.cb.cln6并且在注射后监测长达六个月。没有观察到不良反应或病理学，而在所有动物的整个脑和脊髓中发现高水平的转基因表达。将scaav9.cb.cln6单次出生后脑室内(icv)注射到小鼠的csf中，在cln6
nclf
小鼠体内诱导转基因的持续表达。施用scaav9.cb.cln6降低了所述疾病的典型标志，包含自发荧光存储材料和atp合酶亚单位c的积累、反应性胶质细胞增生和树突棘的丧失。重要的是，这种基因疗法治疗可以带来广泛的功能益处，因为其可以防止cln6
nclf
小鼠的许多运动、记忆和学习以及生存缺陷。这些结果强烈强调了csf递送的scaav9.cb.cln6用于治疗cln6型巴藤病的治疗潜力。
44.本文的标题是为了方便读者而不是限制性的。
45.本文中“可能/可以(may)”和“可以(can)”的使用是描述权利要求中包含的各种实施例，而不是指示权利要求范围的不确定性。
附图说明
46.图1a到1c证明了体内神经元靶向和人类cln6蛋白的表达。图1a提供了scaav.cb.cln6的scaav基因组的示意图。图1b中的图表提供了用scaav.cb.cln6质粒瞬时转染hek293细胞后的cnl6 mrna和人类cln6(hcln6)蛋白表达水平。图1c中的图像提供了scaav.cb.cln6质粒的子宫内电穿孔后gfp和hcln6蛋白的免疫组织化学染色。
47.图2a和图2b提供了显示注射scaav9.cb.cln6的cln6
nclf
小鼠的cns中人类cln6转录物的广泛表达的图像。图2a中的图像和图表提供了代表性的rt
‑
pcr凝胶和在注射后6个月和18个月通过光密度测定法(相对于gapdh归一化)的定量。此分析证明，与野生型小鼠(wt或wt pbs)和注射pbs的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf
pbs)相比，scaav9.cb.cln6递送(cln6
nclf
scaav9)后基因表达增加。图2b的左图提供了证明在注射后6个月和18个月，与野生型小鼠(wt pbs)相比，注射scaav9.cb.cln6(cln6
nclf
scaav9)的cln6
nclf
小鼠的cns中人类cln6转录物的广泛表达的图像。图2b的右图提供了显示免疫组织化学染色的图像，其证明在注射后6个月和18个月时，与野生型小鼠(wt pbs)相比，注射scaav9.cb.cln6的cln6
nclf
小鼠的各种脑区中的蛋白质表达。比例尺50μm。平均值 /
‑
sem。n＝3
‑
9只小鼠/组。单因素方差分析(one
‑
way anova)，邦费罗尼校正(bonferroni correction)。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。
48.图3a到图3c证明了单次scaav9.cb.cln6注射在2个月龄的动物中的作用。图3a中的图像和图表提供了代表性的rt
‑
pcr凝胶和在注射后2个月通过光密度测定法(相对于
gapdh归一化)的定量。此分析证明，与野生型小鼠(wt pbs)和注射pbs的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf
pbs)相比，scaav9.cb.cln6递送(cln6
nclf
scaav9)后基因表达增加。图3b中的上图提供了证明在注射后2个月，与野生型小鼠(wt pbs)相比，注射scaav9.cb.cln6(cln6
nclf
scaav9)的cln6
nclf
小鼠的cns中人类cln6转录物的广泛表达的图像。图3b的下图提供了显示免疫组织化学染色的图像证明在注射后2个月，与野生型小鼠(wt pbs)相比，注射scaav9.cb.cln6的cln6
nclf
小鼠的各种脑区中的蛋白质表达。比例尺200μm。平均值 /
‑
sem。n＝39。单因素方差分析(one
‑
way anova)，邦费罗尼校正(bonferroni correction)。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。图3c的图像和图表证明在注射后2个月，与野生型小鼠(wt)和注射pbs的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf pbs)相比，在p1处单次icv注射scaav9.cb.cln6减少了cln6
nclf
小鼠的vpm/vpl和躯体感觉皮层中自发荧光存储材料(asm；上图)和atp合酶亚单位c(subc；下图)的积累。平均值 /
‑
sem，n＝3
‑
10。(上图)；平均值 /
‑
sem，n＝21
‑
72，生物学n＝3
‑
10(下图)单因素方差分析，邦费罗尼校正。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。比例尺200μm(顶部面板)。比例尺50μm(底部面板)。
49.图4a和图4b证明cln6 mrna和hcln6蛋白在以下区中在整个脑中的广泛表达：a：运动皮层，b：躯体感觉皮层；c：视觉皮层；d：丘脑；e：脑桥；f：小脑；g：在图4a中提供的脑干图像证明在注射后2个月、6个月和18个月的scaav9.cb.cln6治疗的cln6
nclf
小鼠中整个脑中的hcln6转录物表达。在图4b中提供的图像证明在注射后2个月、6个月和18个月的scaav9.cb.cln6治疗的cln6
nclf
小鼠中整个脑中的hcln6蛋白表达。比例尺50μm。
50.图5提供了证明注射后6个月和18个月，与野生型小鼠(wt)和pbs治疗的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf
pbs)相比，scaav9.cb.cln6治疗的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf scaav)的vpm/vpl和躯体感觉皮层中自发荧光存储材料(asm)的累积减少的图像和图表。图表示出了asm

细胞/2500μm2的数量。平均值 /
‑
sem，基于时间点n＝3
‑
10。单因素方差分析(one
‑
way anova)，邦费罗尼校正(bonferroni correction)。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。比例尺50μm。
51.图6提供了证明注射后6个月和18个月，与野生型小鼠(wt)和pbs治疗的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf pbs)相比，scaav9.cb.cln6治疗的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf scaav)的vpm/vpl和躯体感觉皮层中线粒体atp合成酶亚单位c(subunitc)的积累减少的图像和图表。棕色染色代表亚单位c，而蓝色染色代表甲基绿(核)。图表示出了每个像场的总subc

面积。平均值 /
‑
sem，n＝21
‑
72，生物学n＝3
‑
10。单因素方差分析(one
‑
way anova)，邦费罗尼校正(bonferroni correction)。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。比例尺50μm。
52.图7提供了证明与野生型小鼠(wt)和注射pbs的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf
)相比，注射scaav9.cb.cln6的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf scaav)在6个月和18个月的vpm/vpl和躯体感觉皮层中展现出较少的星形胶质细胞增生(gfap反应性)的图像和图表。图表示出了总gfap 免疫反应性。平均值 /
‑
sem，n＝16
‑
49个切片，生物学n＝3
‑
10个小鼠/组。单因素方差分析(one
‑
way anova)，邦费罗尼校正(bonferroni correction)。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。比例尺50μm。插入比例尺10μm。
53.图8提供了证明与野生型小鼠(wt)和注射pbs的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf
pbs)相比，注射scaav9.cb.cln6的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf
scaav9)在注射后6个月的小鼠的躯体感觉皮层
中，并且与野生型小鼠(wt)和注射pbs的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf
pbs)相比，在注射后18个月的vpm/vpl和躯体感觉皮层中展现出较小的小胶质细胞增生(cd68反应性)的图像和图表。图表示出了总cd68 免疫反应性。平均值 /
‑
sem，n＝16
‑
49个切片，生物学n＝3
‑
10个小鼠/组。单因素方差分析(one
‑
way anova)，邦费罗尼校正(bonferroni correction)。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。比例尺50μm。插入比例尺10μm。
54.图9a到图9e提供了证明cln6的持续表达拯救cln6
nclf
小鼠中的运动、记忆、学习和存活缺陷的图表。图9a证明与野生型小鼠(wt)和注射pbs的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf
pbs)相比，注射scaav9.cb.cln6的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf scaav)在8个月到24个月龄时具有减少的旋转棒缺陷。图9b证明与野生型小鼠(wt)和注射pbs的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf
pbs)相比，scaav9.cb.cln6注射在注射scaav9.cb.cln6的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf scaav)中纠正12个月和18个月龄小鼠的后肢扣紧、步态和壁架降低缺陷。图9c证明与野生型小鼠(wt)和注射pbs的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf
pbs)相比，scaav9.cb.cln6预防注射scaav9.cb.cln6的cln6
nclf mice小鼠(cln6
nclf scaav)中9个月到12个月龄的morris水迷宫中的记忆和学习缺陷。图9d证明scaav9.cb.cln6注射防止cln6
nclf
动物的早期死亡，而注射pbs的cln6
nclf
动物在15个月龄时死亡。图9e示出了与野生型动物(wt)和pbs注射的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf
pbs)相比，在scaav9.cb.cln6治疗的小鼠(cln6
nclf scaav)中研究过程中雄性(左图)和雌性(右图)的体重发育。对于旋转杆，平均值 /
‑
sem，n＝6
‑
24；对于扣紧分数，n＝7
‑
13；对于水迷宫，n＝5
‑
15；对于存活曲线，n＝10
‑
15。重量n＝3
‑
13。在适当的情况下使用邦费罗尼校正或非配对t检验的单因素方差分析。时序检验(log
‑
rank(mantel
‑
cox)检验)用于生存曲线分析*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001
55.图10提供了12个月到24个月动物的额外行为数据。图10a中提供的图表证明，在morris水迷宫测试中，未治疗的cln6
nclf
动物在11个月和12个月龄时具有显著更慢的游泳速度。图10b中的图表证明在12个月、18个月和24个月龄时，scaav9.cb.cln6在morris水迷宫逆转任务中不显著改善cln6
nclf
小鼠的记忆和学习缺陷。游泳速度显示为对照。对于水迷宫，n＝5
‑
15；非配对t检验，平均值 /
‑
sem。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001
56.图11a到图11c提供了证明scaav9.cb.cln6在非人类灵长类动物中高度表达和良好耐受的数据。图11a提供了蛋白质印迹，证明了scaav9.cb.cln6治疗的非人类灵长类动物的各种脑和脊髓区中转基因的高表达。印迹代表3只动物，“ ”指示用scaav9.cb.cln6治疗的动物。以下脑区进行了皮层(ctx)、胼胝体(c.call)、室周白质(p.v.w.m.：)、海马(hipp)、小脑(cere)、丘脑(thal)、颈椎脊髓(颈椎)、胸椎脊髓(胸椎)、腰椎脊髓(腰椎)的测试。图11b中的图表提供了图1a中荧光蛋白质印迹的定量。平均值 /
‑
sem，n＝3。未配对的学生t检验。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。图11c中的图表证明scaav9.cb.cln6的递送在大多数scaav9.cb.cln6治疗的非人类灵长类动物中不改变血小板浓度或提高肝酶。红色数据点指示scaav9.cb.cln6治疗的动物；蓝色数据点指示pbs治疗的动物。测试的酶如下：丙氨酸氨基转移酶(alt)、天冬氨酸氨基转移酶(ast)、碱性磷酸酶(alk phos)、γ
‑
谷氨酰转移酶(ggt)。
57.图12a
‑
c提供了通过汉堡运动和语言量表测量的在研究中的同胞对中注射scaav9.cb.cln6后疾病进展的分析。
58.图13提供了scaav9.cb.cln6基因盒的核酸序列(seq id no：4)。aav2 itr核酸序列以斜体显示(5
′
itr如seq id no：9所示；3
′
itr如seq id no：8所示)；cmv增强子核酸序列(seq id no：6)用虚线标出下划线；cb启动子核酸序列(seq id no：3)用单线标出下划线；sv40内含子核酸序列(seq id no：11)用双线标出下划线；人类cln6 cdna序列(seq id no：2)的核酸序列以粗体显示；bgh polya终止子(seq id no：10)的核酸序列用虚线标出下划线。
59.图14提供了完整aav.cb.cln6(seq id no：8)的核酸序列。
60.图15提供了如通过汉堡运动和语言量表测量的用scaav9.cb.cln6治疗的8名患者的功效数据。
61.图16a
‑
c提供了治疗同胞与未治疗同胞之间的比较。将一个同胞用scaav9.cb.cln6治疗，并且将如通过汉堡运动和语言量表测量的其进展与其未治疗同胞的自然历史进行比较。这个数据被提供为汉堡分数：随着时间的推移，运动 语言。图17提供了汉堡运动和语言功能的组合分数相对于基线直到未反向减少2个或更多个点的时间的卡普兰
‑
梅尔(kaplan
‑
meier)曲线。此附图将前8名用scaav9.cb.cln6治疗的患者的数据与来自由全国儿童医院(nationwide children’s hospital)进行的cln6患者的正在进行的自然历史研究的数据(n＝14)进行比较。使用存活概率估计及其标准误差计算置信带。
62.图18提供来自用scaav9.cb.cln6(n＝8)治疗的患者的组合的和单独的汉堡运动和语言分数，显示了cln6基因疗法停止或基本上减缓疾病进展，其中对8名患者中的7名患者的运动和语言功能产生积极影响。
63.图19提供了与针对年龄和基线汉堡运动和语言累积分数匹配的天然历史患者相比，用scaav9.cb.cln6(n＝8)治疗的患者之间的天然历史匹配比较。
64.图20提供了cln6型巴藤病患者(n＝11)的自然历史数据。在图例中，虚线(
‑‑‑‑
)指示语言下降，并且实线灰线指示运动下降。蓝色线(项线)是运动下降和语言下降的总和。将平均汉堡运动 语言分数绘制在y轴上，并且将以月计的年龄绘制在x轴上。从两岁到七岁，每年有相当线性且几乎持续的一点下降。
65.图21a
‑
b提供了马伦早期学习量表的4个结构域的原始分数。虚线水平线表示筛选时的分数。分数越高表示功能越高。
具体实施方式
66.本公开提供了用于治疗cln6型巴藤病的方法和产品。所述方法涉及使用raav作为基因递送载体将cln6多核苷酸递送到受试者。
67.腺相关病毒(aav)是复制缺陷型细小病毒，其单链dna基因组长度约为4.7kb，包含两个145个核苷酸的末端反向重复(itr)并且可用于指病毒本身或其衍生物。所述术语涵盖所有亚型以及天然存在的和重组的形式，除非另有说明。存在多种血清型aav。aav的血清型各自与特定进化枝相关，其成员具有血清学和功能相似性。因此，进化枝也可以指aav。例如，aav9序列称为“进化枝f’序列(gao等人，《病毒学期刊(j.virol.)》，78：6381
‑
6388(2004)。本公开设想在特定进化枝内使用任何序列，例如进化枝f。aav血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，aav
‑
1的完整基因组在genbank登录号nc_002077中提供；aav
‑
2的完整基因组在genbank登录号nc_001401和srivastava等人，《病毒学期刊》，45：555
‑
564
(1983)中提供；aav
‑
3的完整基因组在genbank登录号nc_1829中提供；aav
‑
4的完整基因组在genbank登录号nc_001829中提供；aav
‑
5基因组在genbank登录号af085716中提供；aav
‑
6的完整基因组在genbank登录号nc_00 1862中提供；至少部分aav
‑
7和aav
‑
8基因组分别在genbank登录号ax753246和ax753249中提供；aav
‑
9基因组在gao等人，《病毒学期刊》，78：6381
‑
6388(2004)中提供；aav
‑
10基因组在《分子疗法(mol.ther.)》，13(1)：67
‑
76(2006)中提供；aav
‑
11基因组在《病毒学(virology)》，330(2)：375
‑
383(2004)中提供；aav
‑
12基因组的部分在genbank登录号dq813647中提供；aav
‑
13基因组的部分在genbank登录号eu285562中提供。参见美国专利9,434,928中提供了aavrh.74基因组的序列，其通过引用并入本文。aav
‑
b1基因组的序列在choudhury等人，《分子疗法》，24(7)：1247
‑
1257(2016)中提供。指导病毒dna复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在itr中。三个aav启动子(其相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个aav内部开放阅读框的表达。两个rep启动子(p5和p19)与单个aav内含子的差异剪接(在核苷酸2107和2227处)结合导致从rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52和rep 40)。rep蛋白具有多种酶特性，所述酶特性最终负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达，并且其编码三种衣壳蛋白vp1、vp2和vp3。替代性剪接和非共有转译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单一共有多腺苷酸化位点位于aav基因组的图谱位置95处。aav的生命周期和遗传学在muzyczka，《当前微生物学和免疫学的话题(current topics in microbiology and immunology)》，158：97
‑
129(1992)中评论。
68.aav具有独特的特征，这使其作为例如在基因治疗中将外源dna递送到细胞的载体具有吸引力。培养中细胞的aav感染是非细胞病变的，并且人类和其它动物的自然感染是沉默的和无症状的。而且，aav感染许多哺乳动物细胞，允许体内靶向许多不同组织的可能性。而且，aav转导缓慢分裂和非分裂细胞，并且可以作为转录活性核附加体(染色体外元件)基本上持续这些细胞的寿命。aav原病毒基因组作为质粒中的克隆dna具有感染性，这使得重组基因组的构建成为可能。此外，由于指导aav复制、基因组衣壳化和整合的信号包含在aav基因组的itr中，因此部分或全部内部约4.3kb的基因组(编码复制和结构衣壳蛋白，rep
‑
cap)可以用如含有启动子、感兴趣的dna和多腺苷酸化信号的基因盒等外源dna替代。在一些情况下，rep和cap蛋白以反式提供。aav的另一个显著特征是其是极其稳定且强健的病毒。它易于承受用于灭活腺病毒的条件(56℃到65℃，持续数小时)，使aav的冷保存不太重要。甚至可以将aav冻干。最后，aav感染的细胞不耐受重复感染。
69.如本文所使用的术语“aav”是指野生型aav病毒或病毒颗粒。术语“aav”、“aav病毒”和“aav病毒颗粒”在本文中可互换使用。术语“raav”是指重组aav病毒或重组感染性包封的病毒颗粒。术语“raav”、“raav病毒”和“raav病毒颗粒”在本文中可互换使用。
70.术语“raav基因组”是指衍生自已经修饰的天然aav基因组的多核苷酸序列。在一些实施例中，已经修饰raav基因组以去除天然cap和rep基因。在一些实施例中，raav基因组包括内源性5
′
和3
′
末端反向重复(itr)。在一些实施例中，raav基因组包括来自aav血清型的itr，所述aav血清型不同于衍生aav基因组的aav血清型。在一些实施例中，raav基因组包括感兴趣的转基因(例如，编码cln6的多核苷酸)，其通过末端反向重复(itr)侧接在5
′
和3
′
末端。在一些实施例中，raav基因组包括“基因盒”。示例性基因盒在图1a中和seq id no：4的核酸序列中示出。raav基因组可以是自身互补型(sc)基因组，其在本文中称为“scaav基
因组”。可替代地，raav基因组可以是单链(ss)基因组，其在本文中称为“ssaav基因组”。
71.术语“scaav”是指包括自身互补型基因组的raav病毒或raav病毒颗粒。术语“ssaav”是指包括单链基因组的raav病毒或raav病毒颗粒。
72.本文提供的raav基因组可以包括编码cln6多肽的多核苷酸。cln6多肽包括seq idno：1中所示的氨基酸序列，或具有与seq id no：1中所阐述的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的多肽，并且其编码具有cln6活性的多肽(例如，与例如治疗前的患者相比，治疗时，溶酶体自发荧光存储材料的清除率增加、atp合酶亚单位c的溶酶体积累减少、以及患者中星形胶质细胞和小胶质细胞的活化减少中的至少一种)。
73.在一些情况下，本文提供的raav基因组包括编码cln6多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有seq id no：2所示的核苷酸序列，或与seq id no：2所阐述的核苷酸序列至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的多核苷酸，并且编码具有cln6活性的多肽(例如，与例如治疗前的患者相比，治疗时，溶酶体自发荧光存储材料的清除率增加、atp合酶亚单位c的溶酶体积累减少、以及患者中星形胶质细胞和小胶质细胞的活化减少中的至少一种)。
74.在一些实施例中，本文提供的raav基因组包括编码具有cln6活性的多肽，并且在严格条件下与seq id no：2的核酸序列或其互补序列杂交的多核苷酸序列。术语“严格”用于指本领域通常理解为严格的条件。杂交的严格性主要由温度、离子强度、以及如甲酰胺等变性剂的浓度确定。用于杂交和洗涤的严格条件的实例包含但不限于0.015m氯化钠、65℃到68℃下0.0015m柠檬酸钠，或0.015m氯化钠、0.0015m柠檬酸钠和42℃下50％甲酰胺。参见例如，sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(molecular cloning：a laboratory manual)》，第2版，冷泉港实验室，(纽约冷泉港，1989)。
75.在一些实施例中，本文提供的raav基因组包括侧接编码cln6多肽的多核苷酸的一个或多个aav itr。cln6多核苷酸与转录控制元件(包含但不限于启动子、增强子和/或多腺苷酸化信号序列)可操作地连接，所述转录控制元件在靶细胞中起作用以形成基因盒。启动子的实例是鸡β肌动蛋白启动子和p546启动子。本文设想了其它启动子，包含但不限于猿猴病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦
‑
巴尔病毒(epstein
‑
barr virus)立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒(rous sarcoma virus)启动子、以及人类基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子
‑
1a启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。本文另外提供的是seq id no：3中示出的cb启动子序列，和与seq id no：3中所阐述的核苷酸序列至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的启动子序列，其是具有cb转录促进活性的启动子。转录控制元件的其它实例是组织特异性控制元件，例如，允许在神经元内特异性表达或在星形胶质细胞内特异性表达的启动子。实例包含神经元特异性烯醇酶和胶质原纤维酸性蛋白启动子。还设想了诱导型启动子。诱导型启动子的非限制性实例包含但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素调节的启动子。基因盒还可以包含内含子序列，以便在哺乳动物细胞中表达时促进
cln6 rna转录物的加工。这种内含子的一个实例是sv40内含子。
[0076]“包装”是指一系列细胞内事件，其导致aav颗粒的组装和衣壳化。术语“生产”是指通过包装细胞生产raav(感染性的、包封的raav颗粒)的过程。
[0077]
aav“rep”和“cap”基因分别是指编码腺相关病毒的复制和衣壳化蛋白的多核苷酸序列。aav rep和cap在本文中称为aav“包装基因”。
[0078]
aav的“辅助病毒”是指允许aav(例如野生型aav)被哺乳动物细胞复制和包装的病毒。用于aav的各种这样的辅助病毒是本领域已知的，包含腺病毒、疱疹病毒和如牛痘病毒等痘病毒。腺病毒可以涵盖许多不同的亚组，尽管最常用的是亚组c的5型腺病毒。许多人类、非人类哺乳动物和禽类的腺病毒是已知的并且可从如atcc等存放处获得。疱疹病毒家族的病毒包含例如单纯疱疹病毒(hsv)和爱泼斯坦
‑
巴尔病毒(ebv)，以及巨细胞病毒(cmv)和伪狂犬病病毒(prv)；这些也可以从如atcc等存放处获得。
[0079]“一种或多种辅助病毒功能”是指在辅助病毒基因组中编码的一种或多种功能，其允许aav复制和包装(结合本文所描述的复制和包装的其它要求)。如本文所描述的，“辅助病毒功能”可以以多种方式提供，包含通过提供辅助病毒或向反式生产细胞提供例如编码一种或多种必需功能的多核苷酸序列。
[0080]
本文提供的raav基因组缺乏aav rep和cap dna。本文设想的raav基因组(例如，itr)中的aavdna可以来自适于衍生重组病毒的任何aav血清型，包含但不限于aav血清型aav
‑
1、aav
‑
2、aav
‑
3、aav
‑
4、aav
‑
5、aav
‑
6、aav
‑
7、aav
‑
8、aav
‑
9、aav
‑
10、aav
‑
11、aav
‑
12、aav
‑
13、aav rh.74和aav
‑
b1。如上文所述，各种aav血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。还设想了具有衣壳突变的raav。参见例如，marsic等人，《分子疗法(molecular therapy)》，22(11)：1900
‑
1909(2014)。本文还设想了修饰的衣壳，并且包含具有各种转译后修饰的衣壳，如糖基化和脱酰胺。天冬酰胺或谷氨酰胺侧链的脱酰胺作用导致天冬酰胺残基转化为天冬氨酸或异天冬氨酸残基，并且本文提供的raav衣壳中设想了谷氨酰胺向谷氨酸或异谷氨酸的转化。参见例如，giles等人，《分子疗法》，26(12)：2848
‑
2862(2018)。本文还设想了修饰的衣壳包括将raav导向受影响的组织和需要治疗的器官的靶向序列。
[0081]
本文提供的dna质粒包括本文所描述的raav基因组。可以将dna质粒转移到允许用aav的辅助病毒(例如，腺病毒、e1缺失的腺病毒或疱疹病毒)感染的细胞中，以将raav基因组装配到具有aav9衣壳蛋白的感染性病毒颗粒中。产生raav的技术是本领域的标准，其中将待包装的raav基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能提供给细胞。raav颗粒的产生需要以下组分存在于单个细胞内(在本文中表示为包装细胞)：raav基因组、与raav基因组分开(即不在其中)的aav rep和cap基因，以及辅助病毒功能。aav rep和cap基因可以来自任何可以衍生重组病毒的aav血清型，并且可以来自与raav基因组itr不同的aav血清型。假型raav的产生在例如wo 01/83692中公开，其通过引用整体并入本文。在各种实施例中，可以修饰aav衣壳蛋白以增强重组raav的递送。对衣壳蛋白的修饰通常是本领域已知的。参见例如us 2005/0053922和us 2009/0202490，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0082]
生成包装细胞的方法是创建稳定表达raav产生的所有必需组分的细胞系。例如，包括缺乏aav rep和cap基因的raav基因组的质粒(或多个质粒)、与raav基因组分开的aav rep和cap基因、以及如新霉素抗性基因等可选择的标记可以整合到细胞的基因组中。可以通过如gc拖尾等程序将raav基因组引入细菌质粒中(samulski等人，1982，《美国国家科学
院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》，79：2077
‑
2081)，添加含有限制性核酸内切酶切割位点的合成连接子(laughlin等人，1983，《基因(gene)》，23：65
‑
73)或通过直接平末端连接(senapathy和carter，1984，《生物化学期刊(j.biol.chem.)》，259：4661
‑
4666)。然后可以用如腺病毒等辅助病毒感染包装细胞系。此方法的优点是细胞是可选择的并且适合于大规模生产raav。合适方法的其它非限制性实例采用腺病毒或杆状病毒而不是质粒将raav基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞。
[0083]
raav颗粒产生的一般原理在例如carter，1992，《生物技术当前述评(current opinions in biotechnology)》，1533
‑
539；和muzyczka，1992，《微生物学和免疫学的当前课题(curr.topics in microbial.and immunol.)》，158：97
‑
129)中评论。各种方法描述于ratschin等人，《分子与细胞生物学(mol.cell.biol.)》4：2072(1984)；hermona等人，《美国国家科学院院刊》，81：6466(1984)；tratschin等人，《分子与cel1.学》5：3251(1985)；mclaughlin等人，《病毒学期刊》，62：1963(1988)；以及lebkowski等人，1988《分子与细胞生物学》，7：349(1988)。samulski等人，(1989，《病毒学期刊》，63：3822
‑
3828)；美国专利号5，173,414；wo 95/13365和对应美国专利号5,658.776；wo 95/13392；wo 96/17947；pct/us98/18600；wo 97/09441(pct/us96/14423)；wo 97/08298(pct/us96/13872)；wo 97/21825(pct/us96/20777)；wo 97/06243(pct/fr96/01064)；wo 99/11764；perrin等人(1995)《疫苗(vaccine)》13：1244
‑
1250；paul等人(1993)《人类基因疗法(human gene therapy)》4：609
‑
615；clark等人(1996)《基因疗法(gene therapy)》3：1124
‑
1132；美国专利号5,786,211；美国专利号5,871,982；以及美国专利号6,258,595中。前述文献在此通过引用整体并入本文，特别强调与raav颗粒产生有关的文献的那些部分。
[0084]
本文进一步提供了产生感染性raav颗粒的包装细胞。在一个实施例中，包装细胞可以是稳定转化的癌细胞，如hela细胞、293细胞和perc.6细胞(同源293系)。在另一个实施例中，包装细胞可以是未转化的癌细胞的细胞，如低传代293细胞(用腺病毒e1转化的人类胚肾细胞)、mrc
‑
5细胞(人类胚胎成纤维细胞)、wi
‑
38细胞(人类胚胎成纤维细胞)、vero细胞(猴肾细胞)和frhl
‑
2细胞(恒河猴胚肺细胞)。
[0085]
本文还提供了包括本公开的raav基因组的raav(例如，感染性衣壳化的raav颗粒)。raav的基因组缺乏aav rep和cap dna，即在raav的基因组的itr之间不存在aav rep或cap dna。raav基因组可以是自身互补型(sc)基因组。具有sc基因组的raav在本文中称为scaav。raav基因组可以是单链(ss)基因组。具有单链基因组的raav在本文中称为ssaav。
[0086]
本文提供的示例性raav是名为“scaav9.cb.cln6”的scaav。scaav9.cb.cln6 scaav含有scaav基因组，其包括受杂交鸡β
‑
肌动蛋白(cb)启动子(seq id no：3)控制的人类cln6 cdna。scaav基因组还包括sv40内含子(人类cln6 cdna的上游)和牛生长激素多腺苷酸化(bgh poly a)终止子序列(人类cln6 cdna的下游)。此scaav9.cb.cln6基因盒的序列如seq id no：4所示。scaav基因组包装在aav9衣壳中，并且包含aav2 itr(cb启动子上游的一个itr和bgh poly a终止子序列下游的另一个itr)。
[0087]
raav可以通过本领域标准方法纯化，如通过柱色谱法或氯化铯梯度。从辅助病毒中纯化raav的方法是本领域已知的，并且可以包含在例如clark等人，《人类基因疗法》，10(6)：1031
‑
1039(1999)；schenpp和clark，《分子医学方法(methods mol.med.)》，69：427
‑
443(2002)；美国专利号6,566,118和wo 98/09657。
[0088]
还提供了包括raav的组合物。组合物包括编码cln6多肽的raav。组合物可以包含编码不同感兴趣的多肽的两种或更多种raav。在一些实施例中，raav是scaav或ssaav。
[0089]
本文提供的组合物包括raav和药学上可接受的一种或多种赋形剂。可接受的赋形剂对受体无毒，并且优选在所采用的剂量和浓度下是惰性的，并且包含但不限于缓冲液，如磷酸盐[例如磷酸盐缓冲盐水(pbs)]、柠檬酸盐或其它有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖醇，如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如吐温、共聚物如泊洛沙姆(poloxamer)188，普郎尼克(pluronics)(如pluronic f68)或聚乙二醇(peg)。本文提供的组合物可以包括药学上可接受的含水赋形剂，其含有非离子低渗透化合物，如碘比醇、碘海醇、碘美普尔、碘帕醇、碘喷托、碘普胺、碘佛醇、碘昔兰，其中含有非离子的低渗透化合物的水性赋形剂可以具有下列特性中的一种或多种：约180mgi/ml，蒸气压渗透法测定的渗透压约为322mosm/kg水，渗透压约为273mosm/l，在20℃下绝对粘度为约2.3cp并且在37℃下为约1.5cp，并且在37℃下的比重为约1.164。示例性组合物包括约20％到40％的非离子低渗透化合物或约25％到约35％的非离子低渗透化合物。一种示例性组合物包括配制在20mm的tris(ph为8.0)、1mm的mgcl2、200mm的nacl、0.001％泊洛沙姆188和约25％到约35％的非离子低渗透化合物的scaav或raav病毒颗粒。另一种示例性组合物包括配制在1x pbs和0.001％普郎尼克f68中的scaav。
[0090]
在本公开的方法中待施用的raav的剂量将根据例如特定raav、施用方式、施用时间、治疗目标、个体和靶向的一种或多种细胞类型而变化，并且可以通过本领域标准的方法确定。剂量可以以病毒基因组(vg)为单位表示。本文设想的剂量包括约1
×
10
11
、约1
×
10
12
、约1
×
10
13
、约1.1
×
10
13
、约1.2
×
10
13
、约1.3
×
10
13
、约1.5
×
10
13
、约2
×
10
13
、约2.5
×
10
13
、约3
×
10
13
、约3.5
×
10
13
、约4
×
10
13
、约4.5
×
10
13
、约5
×
10
13
、约6
×
10
13
、约1
×
10
14
、约2
×
10
14
、约3
×
10
14
、约4
×
10
14
、约5
×
10
14
、约1
×
10
15
到约1
×
10
16
或更多的总病毒基因组。约1
×
10
11
到约1
×
10
15
vg、约1
×
10
12
到约1
×
10
15
vg、约1
×
10
12
到约1
×
10
14
vg、约1
×
10
13
到约6
×
10
14
vg和约6
×
10
13
到约1.0
×
10
14
vg的剂量也是可以设想的。本文举例说明的一剂量是6
×
1013vg。本文举例说明的另一剂量是1.5
×
10
13
。
[0091]
提供了用raav转导靶细胞(包含但不限于神经系统、神经或神经胶质细胞的细胞)的方法。神经系统的细胞包含下运动神经元、小神经胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、施万细胞或其组合。
[0092]
术语“转导”用于指通过本公开的复制缺陷型raav在体内或在体外向靶细胞施用/递送cln6多核苷酸，导致受体细胞表达功能性多肽。用本公开的raav转导细胞导致由raav编码的多肽或rna的持续表达。因此，本公开提供了通过鞘内，脑室内，脑实质内或静脉内途径或其任何组合向受试者施用/递送编码cln6多肽的raav的方法。鞘内递送是指递送到脑或脊髓的蛛网膜下的空间。在一些实施例中，鞘内施用是通过脑池内施用。
[0093]
鞘内施用在本文中举例说明。这些方法包含用本文所描述的一种或多种raav转导靶细胞(包含但不限于神经和/或神经胶质细胞)。在一些实施例中，将包括编码cln6多肽的多核苷酸的raav病毒颗粒施用或递送到患者的脑和/或脊髓。在一些实施例中，将多核苷酸
递送到脑。设想用于递送的脑区包含但不限于运动皮层、视觉皮层、小脑和脑干。在一些实施例中，将多核苷酸递送到脊髓。在一些实施例中，将多核苷酸递送到下运动神经元。多核苷酸可以递送到神经和神经胶质细胞。神经胶质细胞是小胶质细胞、少突胶质细胞或星形胶质细胞。在一些实施例中，将多核苷酸递送到施万细胞。
[0094]
在本文提供的方法的一些实施例中，在施用raav后(例如，约5分钟、约10分钟、约15分钟或约20分钟)将患者保持在特伦德伦伯格位置(头向下位置)。例如，患者可以在头部向下位置倾斜约1度到约30度、约15度到约30度、约30度到约60度、约60度到约90度或约90度到约180度。
[0095]
本文提供的方法包括将包括本文提供的raav的组合物的有效剂量或有效多剂量施用于有需要的受试者(例如，包含但不限于人类患者的动物)的步骤。如果在cln6型巴藤病发展之前施用剂量，则施用是预防性的。如果在cln6型巴藤病发展之后施用剂量，则施用是治疗性的。有效剂量是减轻(消除、稳定或减少)与疾病相关的至少一种症状的剂量，其减缓或阻止疾病的进展、减少疾病的程度、导致疾病的缓解(部分或全部)和/或延长生存期。与治疗前的受试者相比或与未治疗的受试者相比，本文提供的方法导致用于评估cln6巴藤病的进展和/或改善的一种或多种量表的稳定化、进展减少或改善，例如统一的巴藤病评级系统(ubdrs)、汉堡运动和语言量表或马伦早期学习量表(msel)。ubdrs评估量表(如marshall等人，《神经病学(neurology)》，2005 65(2)：275
‑
279中所描述)[包含ubdrs物理评估量表、ubdrs癫痫发作评估量表、ubdrs行为评估量表、ubdrs能力评估量表、ubdrs症状发作序列和ubdrs临床总体印象(cgi)]；小儿生活质量量表(pedsqol)量表、运动功能、语言功能、认知功能和生存。与治疗前的受试者相比或与未治疗的受试者相比，本文提供的方法可以导致以下一种或多种：自发荧光存储材料的溶酶体积累减少或减缓、atp合成酶亚单位c的溶酶体积累减少或减缓、减少或减缓胶质细胞活化(星形胶质细胞和/或小胶质细胞)活化；减少或减缓星形细胞增生，并且示出了通过mri测量的脑量损失减少或延迟。
[0096]
还提供了组合疗法。如本文所使用的组合包含同时治疗或顺序治疗。本文所描述的方法与标准医学治疗的组合是特别设想的。
[0097]
进一步地，根据本发明使用的组合物的组合(例如，scaav9.p546.cln6和本文公开的造影剂的组合)(同时治疗或顺序治疗)是特别设想的。
[0098]
虽然设想了在出生后向有需要的受试者递送，但还设想了胎儿宫内分娩。
[0099]
实例
[0100]
虽然以下实例描述了具体的实施例，但应理解，本领域技术人员将想到变化和修改。因此，只有权利要求中出现的这些限制才能适用于本发明。
[0101]
在实例中，产生了受杂交鸡β
‑
肌动蛋白(cb)启动子控制的携带cln6 cdna的自身互补型aav(命名为scaav9.cb.cln6)。ivc注射(6
×
10
13
vg/动物)到出生后第1天小鼠的csf足以在整个cns中诱导稳定、稳健的表达cln6蛋白长达18个月。cln6型巴藤病的进展与asm的积累、atp合酶亚单位c的聚集、突触脊柱密度降低、星形胶质细胞中gfap反应性增加和小胶质细胞中cd68染色增加有关。cln6
nclf
小鼠在两个月时显示增加了asm和atp合酶亚单位c并且减少了树突棘，并且在六个月龄时增加了gfap和cd68反应性。在cln6
nclf
小鼠中注射scaav9.cb.cln6减少了asm和atp合酶亚单位c的积累并且增加了树突棘密度，并且降低了cd68 小胶质细胞和gfap 星形胶质细胞反应性水平。
[0102]
实例1
[0103]
生产scaav9.cb.cln6
[0104]
人类cln6 cdna克隆获自马里兰州罗克维尔市的origene。将hcln6 cdna进一步亚克隆到杂交鸡β
‑
肌动蛋白启动子(cb)下的aav9基因组中，并且在体外和体内进行测试。生成自身互补型腺相关病毒(scaav)血清型9病毒基因组，所述病毒基因组包括受鸡
‑
β
‑
肌动蛋白(cb)杂交启动子控制的人类cln6(hcln6)基因。图1a中提供了质粒构建体的示意图，其显示插入aav2 itr之间的cln6 cdna。质粒构建体还包含cp启动子、猿猴病毒40(sv40)嵌合内含子和牛生长激素(bgh)多腺苷酸化信号(bgh polya)。
[0105]
scaav9.cb.cln6在cgmp条件下通过使用基于双链aav2
‑
itr的cb
‑
cln6载体的瞬时三重质粒转染程序产生，其中质粒编码如前所述的rep2cap9序列(gao等人，《病毒学期刊》，78：6381
‑
6388(2004))，以及在hek293细胞(36)中的腺病毒辅助质粒phelper(stratagene，圣克拉拉，加利福尼亚州)。通过4％到12％十二烷基硫酸钠
‑
丙烯酰胺凝胶电泳和银染色和qpcr分析评估载体的纯度和滴度。克隆后，在胚胎第15.5天通过子宫内icv电穿孔在hek293细胞体内以及体内验证转基因表达(参见图1b和图1c)。此分析证实了体内神经元靶向和人类cln6蛋白的表达。
[0106]
实例2
[0107]
分析在cln6
nclf
小鼠中csf递送的scaav9.cb.cln6的表达
[0108]
细胞靶向和表达
[0109]
为了证实病毒导入的人类cln6在小鼠中的表达和生物分布，scaav9.cb.cln6在出生后24小时内通过单次脑室内(icv)注射施用于cln6
nclf
小鼠，并且在两个月的过程中在不同时间点监测表达。注射等体积pbs的野生型和cln6
nclf
小鼠作为对照。使用nch病毒载体核心滴度，有效施用剂量为5
×
10
10
vg/小鼠。将scaav9.cb.cln6配制在1
×
pbs和0.001％普朗尼克f68中，或配制在20mm tris(ph8.0)、1mm mgcl2、200mm nacl、0.001％泊洛沙姆188中。
[0110]
在注射后2个月、6个月和18个月通过rt
‑
pcr检测hcln6表达证明，与注射pbs的对照相比，注射scaav9.cb.cln6的cln6
nclf
小鼠的皮层中持续、稳健的hcln6表达(图2a，图3a)。这些结果与先前报道的scaav9
‑
cb
‑
gfp表达水平相似(参见例如foust等人，《分子疗法》2013；21(12)：2148
‑
59，foust等人，《自然生物技术(nat biotechnol.)》2010；28(3)：271
‑
4，meyer等人，《分子疗法》2015；23(3)：477
‑
87)。在图2a中，顶部凝胶和图表是代表性的rt
‑
pcr凝胶和光密度测定法(相对于gapdh归一化)。这些数据证明，与注射pbs的cln6
nclf
小鼠相比，scaav9.cb.cln6递送后基因表达增加。底部凝胶和图表示出了通过蛋白质印迹测量的cln6蛋白质表达。scaav9.cb.cln6载体的icv递送示出了cln6
nclf
小鼠的大脑皮层中hcln6蛋白表达显著增加。
[0111]
为了检查转基因表达的区分布，使用称为修饰的原位杂交方法来显现hcln6转录物。注射scaav9.cb.cln6的cln6
nclf
小鼠在2个月、6个月和18个月时在脑的所有区维持广泛的hcln6转导，包含丘脑的躯体感觉皮层和vpm/vpl细胞核，两个区已经示出在cln6
nclf
小鼠的疾病进展中最早受影响(图2b，左图；图3b；顶图，图4a)。
[0112]
为了检查cns内hcln6蛋白的表达，使用抗hcln6抗体进行从注射scaav9.cb.cln6的cln6
nclf
和注射pbs的对照中采集的脑皮层溶解物的免疫印迹。与rna表达所见的相同，在2个月、6个月和18个月时在整个cns中看到稳健的hcln6蛋白表达(图2b，右图，图3b，下图)。
此外，使用抗hcln6抗体对脑组织的免疫标记证实了scaav9.cb.cln6治疗的cln6
nclf
小鼠的整个脑中的表达(图4b)。总之，这些发现证明通过icv注射的scaav9.cb.cln6的csf递送能够在cns的疾病相关区中稳定地产生hcln6转录物和蛋白质。
[0113]
scaav9.cb.cln6递送后的病理学改进
[0114]
自发荧光存储材料(asm)的积累
[0115]
自发荧光存储材料(asm)的积累是巴藤病进展的标志性组织学标记(mole等人，《生物化学与生物物理学报
‑
疾病分子基础(biochim biophys acta
‑
mol basis dis.)》2015；1852(10)：2237
‑
2241；cotman等人，《临床血脂学期刊(clin lipidol.)》2012年2月；7(1)：79
‑
91；seehafer等人，《衰老神经生物学(neurobiol aging.)》2006；27：576
‑
588)。asm的累积是许多形式的巴藤病的疾病进展的强有力指标(bosch等人，《神经科学期刊(j neurosci.)》2016；36(37)：9669
‑
9682；morgan等人，《公共科学图书馆综合(plos one.)》2013；8(11)：e78694)。本文设想了asm的减少用作成功治疗的指标。
[0116]
在治疗后2个月、6个月和18个月，与注射pbs的小鼠相比，注射scaav9.cb.cln6的cln6
nclf
小鼠在丘脑的vpm/vpl细胞核和躯体感觉皮层中asm积累减少(图5，图3c)。因为pbs治疗的cln6nclf小鼠在15个月龄时死亡(图9d)，使用12个月到14个月龄的pbs治疗的cln6
nclf
小鼠作为与18个月龄的scaav9.cb.cln6治疗的cln6
nclf
小鼠的比较。值得注意的是，这些18个月龄的注射scaav9.cb.cln6的cln6
nclf
小鼠中asm积累的量与年龄匹配的未治疗的野生型小鼠相当。图9e证明，雄性(左图)和雌性(右图)scaav9.cb.cln6治疗的小鼠随着年龄的增长具有与野生型小鼠相似的体重，而未治疗的cln6
nclf
小鼠在研究过程中体重下降。注射pbs的cln6
nclf
小鼠(cln6
nclf
pbs)在10个月到11个月龄(雄性)和13个月到14个月龄(雌性)开始体重减轻。
[0117]
线粒体蛋白atp合成酶亚单位c的积累
[0118]
在来自野生型、注射pbs的cln6
nlcf
小鼠或注射scaav9.cb.cln6的cln6
nclf
小鼠的脑组织中分析atp合酶亚单位c的累积。在健康个体中，此蛋白质是线粒体膜中呼吸链的一部分，但是在患有巴藤病的患者中，蛋白质异常地在溶酶体中积累(palmer等人，《美国医学遗传学期刊(am j med genet.)》1992；42(4)：561
‑
567)。在cln6
nclf
小鼠中，与野生型动物相比，丘脑腹侧后内侧核和腹侧后外侧核2个月时亚单位c积累明显(vpm/vpl区)，脑区经常在ncl小鼠模型中受到影响(morgan等人，《公共科学图书馆综合》2013；8(11)：e78694；pontikis等人，《疾病神经生物学(neurobiol dis.)》2005；20(3)：823
‑
836)。与注射pbs的对照cln6
nclf
小鼠相比，在2个月、6个月和18个月时，用scaav9.cb.cln6治疗的cln6
nclf
小鼠的vpm/vpl和脑躯体感觉皮层内atp合酶亚单位c积累水平显著降低(图6；图3c；下图)。
[0119]
胶质细胞和星形胶质细胞活化
[0120]
除了存储材料的异常积累和atp合酶亚c的积累之外，人类患者和动物模型中疾病进展的其它组织学标志物包含星形胶质细胞和小胶质细胞的活化(cotman等人，《人类分子遗传学》2002；11(22)：2709
‑
2721；morgan等人，《公共科学图书馆综合(plos one.)》2013；8(11)：e78694；pontikis等人，《疾病神经生物学(neurobiol dis.)》2005；20(3)：823
‑
836；palmer等人，《美国医学遗传学期刊》1992；42(4)：561
‑
567)。具体地说，反应性小胶质细胞被引发释放如il1
‑
β26等促炎介质，这可能是cln6型巴藤病晚期神经元细胞死亡的关键原因。在6个月和18个月时，与垂死的pbs治疗的cln6
nclf
小鼠相比，注射scaav9.cb.cln6的
cln6
nclf
小鼠在vpm/vpl和躯体感觉皮层中的星形胶质细胞活化(gfap)和小胶质细胞增生(cd68)显著降低(分别为图7和图8；)
[0121]
图7证明通过在6个月和18个月时间点染色胶质原纤维酸性蛋白(gfap)，在vpm/vpl丘脑和躯体感觉皮层切片中鉴定活化的星形胶质细胞。图表示出了总gfap 免疫反应性。
[0122]
还使用抗cd68染色作为活化的小胶质细胞的标记，在vpm/vpl和躯体感觉皮层切片中确定胶质细胞活化。cd68是溶酶体蛋白，其在引发如吞噬作用等促炎功能的细胞中上调(seehafer等人，《神经免疫学期刊(j neuroimmunol.)》2011；230：169
‑
172)。图8证明scaav9.cb.cln6注射减少了6m cln6
nclf
小鼠的躯体感觉皮层中，以及18m cln6
nclf
小鼠的vpm/vpl和躯体感觉皮层中的小胶质细胞增生(cd68反应性)。图表示出了总cd68 免疫反应性。图8中的入口示出了小胶质细胞的形态。值得注意的是，在这些研究中分析的未治疗的cln6
nclf
小鼠是垂死的，并且许多小胶质细胞可能即将死亡或已死亡，导致它们不寻常的形态。总之，这些结果指示，在出生后第1天将scaav9.cb.cln6递送到csf中的单次注射可以减少或延迟cln6
nclf
小鼠脑中的许多典型cln6型巴藤病病理。
[0123]
在递送scaav9.cb.cln6后的行为改善
[0124]
在scaav9.cb.cln6的疗效研究中，从2个月龄开始，并且以2个月的间隔持续，对小鼠进行一系列行为测试范例，包含：加速旋转棒测定，和爬杆以测试运动功能和协调，以及莫里斯水迷宫来评估学习和记忆。注射后动物被跟踪24个月，并且正在进行研究。
[0125]
旋转棒测定
[0126]
先前的工作证明cln6型巴藤病的cln6
nclf
小鼠模型概括了人类中发现的许多运动、认知和存活缺陷(morgan等人，《公共科学图书馆综合》2013；8(11)：e78694)。在功效研究中，使用旋转棒作为运动协调的经典测量，与野生型相比，注射pbs的cln6
nclf
小鼠在8个月龄时开始示出旋转棒表现下降。然而，用scaav9.cb.cln6注射cln6
nclf
小鼠阻止了这种下降，这种作用持续整个研究期(24个月)(图9a)。为了进一步详细研究运动协调的影响，动物在12个月、18个月和24个月时接受各种运动任务(后肢扣紧、从壁架上降低自己的能力，以及步态评估)，并且使用评分矩阵进行评估，评分最高，预后最差(guyenet等人，《可视化实验期刊：jove.(journal of visualized experiments：jove.)》201039)。与pbs治疗的cln6
nclf
小鼠相比，用scaav9.cb.cln6治疗的小鼠在所有时间点示出了显著更低的组合评分，仅在24月龄时其评分略微增加(图9b)。
[0127]
morris水迷宫测试
[0128]
在morris水迷宫测试中，将动物放置在含有隐藏平台的充满水的池中。在训练之后，测量动物使用环境线索来定位隐藏平台的时间被测量为学习和记忆能力的标志。
[0129]
pbs治疗的cln6
nclf
小鼠在九个月龄的任务中表现不佳，指示为它们找到隐藏平台的能力降低(图9c)。由于pbs治疗的cln6
nclf
小鼠的游泳速度在11个月和12个月龄时显著降低，因此我们无法在这些后期时间点得出关于它们的记忆和学习能力的任何结论(图10a)。用scaav9.cb.cln6治疗cln6
nclf
小鼠在注射后12个月校正了这种记忆和学习缺陷(图9c)。当将野生型小鼠与scaav9.cb.cln6治疗的动物仅在morris水迷宫测试的后期时间点进行比较时，我们发现即使是治疗的小鼠在18个月和24个月时需要更多的时间来找到平台，而所有测试组之间的游泳速度相同(图9c，图10)。为了在稍后的时间点评估记忆和学习，在12
个月、18个月和24个月龄时对小鼠进行水迷宫逆转测试，其中平台被移动到新的位置。在此测试中，与野生型小鼠相比，用scaav9.cb.cln6治疗的cln6
nclf
小鼠花费显著更长时间以找到新的平台位置(图10)。总之，这些结果指示scaav9.cb.cln6的单次治疗阻止了这些动物中看到的许多运动衰退，但是当在稍后的时间点测试小鼠时不能完全抵御记忆和学习缺陷。
[0130]
递送scaav9.cb.cln6后存活率的改进
[0131]
已知cln6
nclf
小鼠与野生型小鼠相比存活率降低(guyenet等人，《可视化实验期刊：jove.》201039)。将scaav9.cb.cln6和注射pbs的cln6
nclf
小鼠的存活与注射pbs的野生型小鼠进行比较。与注射pbs的cln6
nclf
小鼠相比，单次icv注射scaav9.cb.cln6到cln6
nclf
小鼠的csf中显著增加了其存活率(图9d)。虽然pbs治疗小鼠的中位存活期为14个月，但scaav9.cb.cln6治疗的cln6
nclf
小鼠的中位存活期为21.5个月。存活率增加65％是非常显著的。而且，scaav9.cb.cln6治疗的cln6
nclf
小鼠的存活曲线与野生型动物没有显著差异。
[0132]
进一步地，作为总体健康的量度，每月记录体重。scaav9.cb.cln6治疗的小鼠维持其体重的能力也强调了健康和存活的改进，因为与野生型动物相比没有观察到差异，而pbs治疗的cln6
nclf
在10个月到12个月左右开始体重减轻(图9e)。
[0133]
用pbs治疗172只野生型小鼠和用5
×
10
10
vg/动物治疗的223只野生型小鼠进行安全性研究。此研究证明scaav9.cb.cln6在24周内耐受良好，没有可归因于病毒的副作用(数据未显示)。总之，这是迄今为止cln6
nclf
小鼠模型中最长的存活延伸，并且指示单独治疗scaav9.cb.cln6以恢复cln6型巴藤病的细胞和功能缺陷的效用。
[0134]
实例3
[0135]
scaav9.cb.cln6在非人类灵长类动物中的安全性研究
[0136]
为了在与人类患者更相关的大型动物模型中测试此治疗的安全性，给3只四岁的雄性食蟹猴施用配制在1
×
pbs和0.001％普朗尼克f68中的scaav9.cb.cln6。
[0137]
在注射后1个月、3个月或6个月处死动物。每个个体接受单次腰部鞘内注射，以每只动物6
×
10
13
个病毒颗粒的剂量将病毒载体直接递送到csf中。注射后，将动物保持在特伦德伦伯格位置15分钟，头部朝下以45度角向下，以促进脑和上脊髓区的靶向。
[0138]
所有受试者从注射中恢复良好并且未示出任何异常行为。在研究期间(基线，1个月、2个月、3个月和6个月)，血液学和血清化学在最多5个时间点进行，并且未显示出重大异常。具体地讲，没有发现天冬氨酸氨基转移酶(ast)或碱性磷酸酶水平升高的证据，而注射后1个月的一只动物中丙氨酸氨基转移酶(alt)略微增加(低于200单位/升)(图11c)。
[0139]
总蛋白水平、肌酸酐、甘油三酯、葡萄糖或如磷、钙、镁或钠等离子水平没有变化。在处死它们时对每只动物进行广泛的组织病理学以及转基因表达分析。除了一只在尸体剖检时显示膀胱感染的动物，在分析的任何组织中均未发现异常，包含各种脑和脊髓区，心脏，肺，肝，脾，肾，小肠，骨骼肌(膈肌，肱三头肌，ta，腓肠肌)，性腺。
[0140]
如荧光蛋白质印迹所示，单次腰部鞘内注射将scaav9.cb.cln6递送到脑脊髓液中诱导转基因在非人类灵长类动物的整个脑和脊髓中高表达。图11a中的印迹示出了cln6在皮层、胼胝体、室周白质、海马、小脑、丘脑、颈椎脊髓、胸椎脊髓、腰椎脊髓中的表达在所有三只动物的整个脑和脊髓中发现转基因的高表达(图11a到图11b)。总之，这些数据指示scaav9.cb.cln6的治疗在所有三个测试个体中都具有良好的耐受性和安全性。
[0141]
实例4
[0142]
scaav9.cb.cln6基因疗法的临床试验
[0143]
scaav9.cb.cln6是通过鞘内递送给患有cln6型巴藤病的人类患者。
[0144]
用于临床试验的scaav由全国儿童医院临床制造设施(nationwide children
′
s hospital clinical manufacturing facility)利用hek293细胞的三重转染方法在如实例1中所描述的gmp条件下产生。
[0145]
选择参与的患者年龄为一岁或更大，诊断为由基因型确定的cln6疾病。第一同期组群(n＝12)接受每位患者一次性基因转移剂量为1.5
×
10
13
vg总scaav。将scaav9.cb.cln6配制成20mm tris(ph8.0)、1mm mgcl2、200mm nacl、0.001％泊洛沙姆188和约20％到约40％非离子低渗透化合物，并且通过腰椎穿刺插入的鞘内导管一次性递送到腰椎间隙囊的蛛网膜下腔内。安全性是根据临床情况进行评估，并且通过检查安全标签进行评估。每个受试者的登记之间至少有四周的时间，以允许审查基因转移后第30天的安全性数据。
[0146]
本文提供的初步数据报告了十名接受治疗的患者，并且平均随访时间为12个月(治疗后1个月到24个月)。初步数据证明，scaav9.cb.cln6的施用通常具有良好的耐受性。大多数不良事件是轻微的，并且与治疗无关。观察到的任何t细胞应答和抗体升高与临床表现不相关，并且不需要治疗的变化。
[0147]
图12提供了报告如通过汉堡运动和语言量表注射后测量的在两个研究中的同胞对中的疾病进展的初步数据。这些同胞对具有同一gcln6突变基因型。
[0148]
二十四个月期功效研究
[0149]
本文提供了用于进行中的临床研究的八位经治疗患者的数据。对本文所描述的8名患者进行施用并且暴露于scaav9.cb.cln6持续至少17个月。以下提供了这8名患者的基线信息。
[0150][0151]
来自正在进行的24个月临床研究的数据表明，scaav9.cb.cln6的单次鞘内施用通常是良好耐受的。报道了137个不良事件。大多数不良事件(ae)是轻微的并且与治疗无关。在4名患者中报道了9个3级(严重)不良事件(表示为sae)。9个sae中的三个被认为可能与治疗相关。相关事件包含呕吐(2)、上腹部痛(1)和发热(1)并且所有四名患者都己恢复。未报道4级(危及生命的)或5级(死亡的)不良事件。没有与抗aav9衣壳或抗cln6免疫原性相关的不良事件的模式。
[0152]
图15提供了功效数据，所述功效数据显示对运动和语言功能的积极影响。在用scaav9.cb.cln6治疗的8名患者中的7名患者中，汉堡分数保持不变或具有初始变化( 1到
‑
1分)，随后处于稳定化。这项研究中的最年老的患者(在79个月龄时进行治疗)下降两点。自
然历史数据表明，在症状发作后24个月内汉堡运动和语言下降2
‑
3点。
[0153]
图16a
‑
c提供了同胞比较数据，其全部患有cln6疾病。相对于经历运动能力和语言能力大幅下降或在相同时间段内死亡的未治疗同胞，经治疗患者表现出稳定化。这些数据被提供为汉堡分数：随时间的推移的运动 语言。图16a提供了累积分数，而图16b提供了汉堡运动子分数，并且图16c提供了汉堡语言子分数。
[0154]
图12a
‑
c提供了均用scaav9.cb.cln6治疗的研究中对的研究中同胞比较数据。这些数据表明，与具有初始变化随后处于稳定化的较年老的同胞相比，较年轻的同胞表现出汉堡运动和语言分数的增加或稳定化。图12a提供了这些累积分数，而图12b提供了汉堡运动子分数，并且图12c提供了汉堡语言子分数。
[0155]
图17将用scaav9.cb.cln6治疗的前8名患者的数据与来自由全国儿童医院进行的cln6患者的正在进行的自然历史研究的数据(n＝14)进行比较。显示的是，汉堡运动和语言功能的组合分数相对于基线直到未反向减少2个或更多个点的时间的卡普兰
‑
梅尔曲线。使用存活概率估计及其标准误差计算置信带。所述附图比较了治疗组相对于自然历史组在2年时间段内组合汉堡运动和语言分数下降≥2点的患者，并且传达了支持本发明的治疗的功效的结果，所述结果包含：(i)与所有14名自然历史未治疗患者相比，在所述时间段内仅1名经治疗患者实现下降≥2点；和(ii)将经治疗患者与未治疗患者明显分开。
[0156]
总之，24个月的功效数据证明如下：i)疾病的稳定化，与经历其运动能力和语言能力快速下降的未治疗同胞相比；ii)较年轻的患者显示分数或稳定化增加；以及iii)大多数较年老患者显示初始变化，随后处于稳定化。另外，治疗通常是良好耐受的。
[0157]
剂量递增研究
[0158]
如果不存在安全问题，在注射后一个月评估第一个同期组群后，将登记另外的受试者。同期组群2中的每个受试者(n＝4)接受递增剂量的病毒载体。在同期组群1完成与同期组群2开始之间至少有六周的时间窗口，以允许从五个时间点(第1天、第2天、第7天、第14天和第21天)以及dsmb审查安全性分析在给予下一个受试者之前进行审查。
[0159]
使用ubdrs量表或汉堡运动和语言量表(在上文的详细描述中参考)并且使用小儿生活质量(pedsqol)量表的治疗对生活质量的影响以及延长存活的潜力来测量疾病进展。
[0160]
当所有患者完成为期三年的研究时，评估疗效的主要分析。确定疗效的基础是基于专门针对cln6型巴藤病或汉堡运动和语言量表而开发的完善的统一巴藤病评定量表(ubdrs)的疾病稳定或减少疾病的进展。完成三年研究期后，患者将按照fda指导每年监测，持续5年。
[0161]
实例5
[0162]
自然历史研究证明scaav9.cb.cln6基因疗法改善运动和语言分数
[0163]
为了促进研究受试者(cln6基因转移研究中的第一患者(n＝8))与天然历史受试者关于随时间的推移的临床进程的比较，将来自基因转移患者的组合汉堡量表运动(m)和语言(l)分数与在回顾性cln6自然历史研究(pi：emily de los reyes，md；美国临床试验数据库(clinicaltrials.gov)识别码：nct03285425)中的患者上收集的组合的汉堡量表运动和语言分数数据进行匹配。基于基线汉堡运动和语言分数以及在比较时(12个月内)的年龄，将基因转移患者与自然历史患者匹配。
[0164]
汉堡运动和语言分数的组合数据和单独数据(n＝8)显示cln6基因疗法停止或基
本上减缓疾病进展，其中对8名患者中的7名患者的运动和语言功能产生积极影响(图18)。积极影响是指患者维持组合汉堡分数或具有初始变化( 1到
‑
1分)随后处于稳定化。单独的运动和语言分数与相应的组合分数一致。
[0165]
用于自然历史匹配的比较的数据还显示汉堡运动和语言分数的改进(图19)。通过多对一匹配方法，相比于基因转移患者在最后时间点的相应汉堡运动和语言值(以绿色绘制)，将匹配自然历史患者在比较期的最后时间点(对于相应的基因转移患者)的平均汉堡运动和语言分数以红色绘制(图19)。在每幅图中提供了每个比较中的自然历史患者的数量连同在最后时间点汉堡运动与语言分数之间的差值(在基因转移患者与nh患者的平均值之间)。在全国儿童医院和emily de los reyes博士的研究中收集的巴藤病患者(n＝11)的自然历史数据表明，从两岁到七岁，汉堡运动 语言分数每年有相当线性且几乎持续的一点下降(图20)。
[0166]
总之，来自这些研究的数据表明，与匹配天然历史患者相比，大多数cln6基因转移患者表现出运动和语言分数的改善。
[0167]
实例6
[0168]
马伦早期学习量表分析
[0169]
使用马伦早期学习量表(msel)来评估scaav.cb.cln6基因疗法是否改善患者在12到24个月内的学习能力。msel是单独施用的、认知功能的归一化量度，其被设计成用于从出生到68个月的儿童。msel的子量表是总体运动、精细运动、接受性语言、表达性语言和早期学习复合。(参见mullen em.(1995).《马伦早期学习量表(mullen scales of early learning)》(ags编辑)明尼苏达州瑟克尔派因斯市：美国指南服务公司(circle pines，mn：american guidance service inc))。
[0170]
在8名患者中分析以下4个结构域：视觉接受、精细运动、接受性语言和表达性语言。图21a和21b提供了4个结构域的原始分数。分数越高表示功能越高。
[0171]
总结
[0172]
中期安全性和功效数据表明，aav9
‑
cln6基因疗法具有稳定变体婴儿晚期发作cln6型巴藤病的进展的潜力。功效结果证明运动和语言功能的有意义的治疗效果。与未治疗同胞相比，经过aav9
‑
cln6治疗的患者表现出汉堡运动和语言分数的改善，并且天然历史患者的平均值与年龄和汉堡运动和语言基线评分数相匹配。比较经治疗的较年轻和较年老同胞进一步支持用aav9
‑
cln6早期干预基因治疗的潜在益处。较年轻的经治疗患者表现出认知技能的改善或稳定，如msel量表所示。
[0173]
虽然已经在本文示出并且描述了本发明的优选实施例，但是对本领域的技术人员而言显而易见的是这种实施例仅以实例方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替代。应该理解，可以采用本文所描述的实施例的各种替代方案。预期的是以下权利要求书限定了本发明的范围以及由此覆盖在这些权利要求和它们的等效物的范围内的方法和结构。
[0174]
本技术中提及的所有文献均通过引用整体并入本文。